一種基于聚集誘導發光和核酸適配體的檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于聚集誘導發光和核酸適配體的檢測方法，屬于生物分析技術領域。解決了現有技術中基于核酸適配體的檢測方法靈敏度低、穩定性差、步驟繁瑣、成本高等問題。本發明的方法第一次將具有聚集誘導發光性質的分子共價修飾于核酸適配體的兩端，利用核酸適配體和細胞(或蛋白質)的特異性結合，使具有聚集誘導發光分子發出熒光信號，從而實現對細胞或蛋白質的快速、簡便、廉價、穩定、靈敏、高選擇性的檢測，及對細胞的選擇性成像。且該檢測方法給出的是熒光增強的信號，不需要信號擴增就能達到很低的檢測限，也不用另外修飾淬滅基團或合成淬滅材料，只需要探針和檢測物兩種物質，即混即測。
【專利說明】
一種基于聚集誘導發光和核酸適配體的檢測方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物分析技術領域，具體涉及一種基于聚集誘導發光和核酸適配體的 檢測方法。
【背景技術】
[0002] 生物分析技術是指用分析化學的方法檢測、分析生命化學物質，從而對基礎研究、 藥物開發、臨床疾病診斷治療、生命個體健康狀態監控等提供信息依據。被分析的體系可以 是幾種簡單化合物的混合，也可以是細胞等復雜系統。對分析手段的主要要求是：高靈敏 度，高選擇性，方法簡單易行，費用低廉等。如今報道的生物分析的方法有很多，如熒光、電 化學、化學發光、電化學發光、比色、表面增強拉曼散射、表面等離子共振等。其中，熒光檢測 法因其操作簡單、相應迅速、靈敏度高而受到更多關注。
[0003] 聚集誘導發光(aggregation-induced emission，AIE)是一種特殊的光學現象。具 有某些特定結構(多為螺旋槳形結構）的熒光分子，當它們在溶液中以自由單體形式存在時 由于分子內旋轉將能量耗散而不發熒光;而以聚集體的形式存在時，由于分子內旋轉被抑 制而發出強烈的熒光。研究者們基于AIE現象，開發了許多生物分析的新方法。四苯乙烯 (TPE)是一種經典的AIE分子。例如，本課題組利用TPE的非公價自組裝，開發了檢測酶活性 的新方法（Anal.Chem.2014,86,9866-9872;CN 104195242 B)〇
[0004]核酸適配體(aptamer)是通過指數富集的配體系統進化技術(SELEX)獲得的具有 特定序列的DNA或RNA短鏈，對于靶分子具有高度親和力。它能夠特異性的識別各種目標物 質，如有機小分子，蛋白質，細胞等。相較于其他識別分子，核酸適配體更加穩定，且更容易 用化學方法來合成和修飾，基于核酸適配體的生物分析新方法的建立是當下研究的熱點。 然而，目前文獻報道的基于核酸適配體的檢測方法(涵蓋成像方法），主要存在靈敏度低、穩 定性差、步驟繁瑣、成本高等問題。例如，一些方法為了達到較低的檢測限，常常需要用到基 于酶反應的信號擴增（如Chem.Commun. ,2014,50,9547-9549)，這樣一來費時費力，而且增 加了成本，另外基于酶的信號擴增穩定性也不好。又如，一些方法將熒光基團共價修飾在核 酸適配體末端，但是為了引起熒光信號的變化，需要分別修飾上熒光基團和淬滅基團，或是 需要合成能淬滅焚光的納米材料，（如Chem.Eur. J. ,2005,11，4502_4508;Anal .Chem.， 2014，86，9271-9277)，這樣費時費力，且提高了成本，另外由于淬滅基團的熒光淬滅效率的 限制，也限制的檢測的靈敏度。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是解決現有技術中基于核酸適配體的檢測方法靈敏度低、穩定性 差、步驟繁瑣、成本高等問題，提供一種基于聚集誘導發光和核酸適配體的檢測方法。
[0006] 本發明解決上述技術問題采取的技術方案如下。
[0007] -種基于聚集誘導發光和核酸適配體的檢測方法，步驟如下：
[0008] 步驟一、將兩端修飾了氨基的適配體溶于溶劑中，得到第一溶液；
[0009] 所述適配體為細胞適配體或者蛋白適配體，溶劑為碳酸氫鈉水溶液或碳酸氫鉀水 溶液；
[0010] 步驟二、將化合物1溶于溶劑中，得到第二溶液；
[0011] 所述化合物1的結構式為 所述溶劑為二甲基亞砜(DMS0) 或二甲基甲酰胺(DMF);
[0012] 步驟三、將第一溶液和第二溶液混合均勾，得到混合溶液，在35~40°C中放置12~ 36h，離心，取上清液通過反相高效液相色譜(HPLC)提純，收集的產物，0°C以下真空干燥后， 得到無色固體，即為兩端共價修飾具有AIE性質分子的核酸適配體；
[0013] 所述混合溶液中，兩端修飾了氨基的適配體與化合物1的摩爾比小于1:2;
[0014] 步驟四、將步驟三得到的兩端共價修飾具有AIE性質分子的核酸適配體加入去離 子水中，得到母液；
[0015]步驟五、將步驟四中的母液、待測物與pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液或者70~90% 的血清混合，混合均勻后，檢測混合物的熒光強度；
[0016] 所述待測物為待測細胞或者待測蛋白質，兩端共價修飾具有AIE性質分子的核酸 適配體的檢測濃度為2~5yM;
[0017] 或者，
[0018]將步驟四中的母液、待測細胞與pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液或者70~90%的血 清混合，混合均勻后，在2~8°C下放置20~60min，取混合物滴在載玻片上，利用激光掃描共 聚焦顯微鏡拍攝細胞的熒光照片；
[0019] 兩端共價修飾具有AIE性質分子的核酸適配體的檢測濃度為2~5yM。
[0020] 優選的是，所述步驟一中，碳酸氫鈉水溶液或碳酸氫鉀水溶液的濃度為0.05~ 0.15M。
[0021] 優選的是，所述步驟一中，第一溶液中，兩端修飾了氨基的適配體的濃度為50~ 150iiM〇
[0022]優選的是，所述步驟二中，第二溶液中，化合物1的濃度為0.25~2.25mM。
[0023]優選的是，所述步驟三中，兩端修飾了氨基的適配體與化合物1的摩爾比為1: (5~ 15)〇
[0024] 優選的是，所述步驟四中，母液的儲存溫度為在2~8°C。
[0025] 優選的是，所述步驟五中，待測細胞的數量為100以上。
[0026] 優選的是，所述步驟五中，將步驟四中的母液、待測細胞與pH值為7.4的磷酸鹽緩 沖溶液或者70~90 %的血清混合，混合均勻后，在4°C下放置30min，然后滴在載玻片上。 [0027]優選的是，所述步驟五中，血清為80%。
[0028] 優選的是，所述步驟五中，磷酸鹽緩沖溶液的濃度為20mM。
[0029] 優選的是，所述步驟五中，兩端共價修飾具有AIE性質分子的核酸適配體的檢測濃 度為2.5uM。
[0030] 與現有技術相比，本發明的有益效果：
[0031] 本發明的檢測方法第一次將具有AIE性質的分子共價修飾于核酸適配體的兩端， 利用核酸適配體和細胞(或蛋白質）的特異性結合，使AIE分子發出熒光信號，從而實現對細 胞(或蛋白質)進行快速、簡便、廉價、穩定、靈敏、高選擇性的檢測及選擇性的細胞成像；
[0032] 該檢測方法給出的是熒光增強的信號，比起熒光減弱的信號，靈敏度更高；
[0033] 該方法不需要信號擴增就能達到很低的檢測限，也不用另外修飾淬滅基團或合成 淬滅材料，只需要探針和檢測物兩種物質，即混即測，經實驗驗證，在0~5000的Ramos細胞 數量范圍內，熒光強度和細胞數量成正比的線性關系，在沒有任何信號擴增的情況下，最低 可以檢測到100個Ramos細胞；
[0034] 從細胞成像結果能夠看出，該檢測方法成像效果清晰，熒光現象明顯。
【附圖說明】
[0035]圖1為本發明的檢測方法的原理圖；
[0036] 圖2中，（a)為本發明實施例1的含有不同細胞數量的混合物的熒光光譜，（b)為實 施例1的混合物的熒光強度隨混合物中Ramos細胞數量變化圖，（c)為(b)中Ramos細胞數量 為0~5000的局部放大圖；
[0037] 圖3為本發明實施例3的細胞檢測選擇性圖；
[0038]圖4為本發明實施例5的細胞的熒光成像圖，（a)Ramos細胞的明場照片，（b)Ramos 細胞的熒光照片，（c) CCRF-CEM細胞的明場照片，（d) CCRF-CEM細胞的熒光照片。
【具體實施方式】
[0039]為了進一步了解本發明，下面結合【具體實施方式】對本發明的優選實施方案進行描 述，但是應當理解，這些描述只是為進一步說明本發明的特征和優點，而不是對本發明專利 要求的限制。
[0040] 本發明的檢測方法，能夠檢測細胞、蛋白質等體積較大的生物物質。本發明的檢測 原理，如圖1所示：以Ramos細胞為例，我們將TPE分子共價修飾于Ramos細胞的適配體兩端， 得到熒光探針TPE-aptamer。在水溶液中，TPE分子主要以單體形式存在，故只有微弱的熒 光。當體系中加入Ramos細胞，Ramos適配體和Ramos細胞特異性結合，TPE分子的分子內旋轉 被抑制，故而發出強烈的熒光。如果加入其它細胞，Ramos適配體不發生特異性結合，將不會 觀察到熒光。我們利用這個原理對Ramos細胞進行選擇性檢測。同理，若將適配體的序列改 為其他細胞(或蛋白質）的特異性識別，就能對其他的細胞(或蛋白質)進行選擇性檢測。
[0041] 本發明的一種基于聚集誘導發光和核酸適配體的檢測方法，步驟如下：
[0042] 步驟一、將兩端修飾了氨基的適配體溶于碳酸氫鈉水溶液或者碳酸氫鉀水溶液 中，得到第一溶液；
[0043] 其中，適配體為細胞適配體或者蛋白質，且在細胞適配體或者蛋白質適配體兩端 修飾氨基屬于現有技術，第一溶液中，兩端修飾了氨基的細胞適配體或者蛋白質適配體的 濃度優選為50~150yM，碳酸氫鈉水溶液或者碳酸氫鉀水溶液的濃度優選為0.05~0.15M; [0044]步驟二、將化合物1溶于DMS0中，得到第二溶液；
[0045]第二溶液中，化合物1的濃度優選為0 . 2 5~2 . 2 5 m M，化合物1的結構式為
化合物1為現有技術，可以通過三步有機反應得到（參考 ， Chem? Commun ?，2013，49，5325-5327; J ? Org ? Chem?，2004，69，3271-3275的方法）；
[0046]制備化合物1的反應結構式為：
[0048]步驟三、將第一溶液和第二溶液充分混合，得到的混合溶液中，兩端修飾了氨基的 適配體與化合物1的摩爾比小于1: 2，優選1: (5~15)，將混合溶液在35~40°C中放置12~ 36h，離心，取上清液通過反相HPLC提純，收集的產物，0°C以下真空干燥后，得到無色固體， 即為兩端共價修飾具有AIE性質的分子的核酸適配體；
[0049]步驟三的反應結構式如下：
[0051]步驟四、將步驟三得到的無色固體加入去離子水，得到已知濃度的母液，在2~8°C 儲存備用；
[0052]步驟五、將母液、待測物與pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液或者70~90%的血清混合 均勻，得到混合物，混合物中兩端共價修飾具有AIE性質分子的核酸適配體的最終濃度為2-5yM，優選2.5yM，檢測混合物的熒光強度；
[0053]其中，待測物為待測細胞或者待測蛋白質，磷酸鹽緩沖溶液優選20mM，血清優選 80%，待測細胞的數量根據細胞的不同而不同，一般為100以上；
[0054]或者，
[0055]將步驟四中的母液、待測細胞與pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液或者70~90%的血 清混合，混合均勻后，在2~8 °C下放置20~60min，優選4 °C下放置30min，得到混合物，混合 物中兩端共價修飾具有AIE性質分子的核酸適配體的最終濃度為2-5yM，優選2.5yM，取混合 物滴在載玻片上，利用激光掃描共聚焦顯微鏡拍攝細胞的熒光照片；
[0056] 其中，磷酸鹽緩沖溶液優選20禮，血清優選80%，待測細胞的數量根據細胞的不同 而不同，一般為100以上。
[0057] 以下結合實施例及附圖進一步說明本發明。
[0058] 實施例1
[0059] -種基于聚集誘導發光和核酸適配體的檢測細胞的方法，步驟如下：
[0060] 步驟一、將兩端修飾了氨基的Ramos適配體(序列為5'-H2N-AAC ACC GGG AGG ATA GTT CGG TGG CTG ITC AGG GTC TCC TCC CGG TG-NH2-3'，從上海生工購得)溶于碳酸氫鈉 水溶液中（〇. 1M，250yL)，得到第一溶液，兩端修飾了氨基的Ramos適配體的濃度為1 OOyM; [0061 ]步驟二、將化合物1溶于DMS0(250yL)中，得到第二溶液，化合物1的濃度為ImM; [0062] 步驟三、將第一溶液和第二溶液充分混合，在37 °C中放置24h，離心，取上清液通過 反相HPLC提純，收集的產物，真空干燥后，得到無色固體，即TPE-aptamer;
[0063] 步驟四、將TPE-aptamer溶于去離子水，得到母液，在4°C儲存備用；
[0064] 步驟五、分別將不同數量的Ramos細胞（0，100，200，500，1000，2000，3000，4000， 5000，10000，15000，20000個)和母液溶于20mM的pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，充分混 合，得到最終體積為1〇〇此，TPE-aptamer的最終濃度為2 ? 5yM的混合物，然后在室溫下分別 測定混合物的焚光光譜。
[0065] 測定結果如圖2所示，混合物的熒光強度隨著溶液中Ramos細胞數量的增加而增 強。在0~5000個Ramos細胞的數量范圍內，細胞數量和熒光強度成正比的線性關系。在沒有 任何信號擴增的情況下，最低可以檢測到100個Ramos細胞。
[0066] 實施例2
[0067] -種基于聚集誘導發光和核酸適配體的檢測細胞的方法，步驟如下：
[0068] 步驟一、將兩端修飾了氨基的CCRF-CEM細胞適配體(序列為5'-ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-3'），溶于碳酸氫鈉水溶液中（0.1M，250yL)， 得到第一溶液，兩端修飾了氨基的CCRF-CEM細胞適配體的濃度為100yM;
[0069] 步驟二、將化合物1溶于DMS0(250yL)中，得到第二溶液，化合物1的濃度為ImM;
[0070] 步驟三、將第一溶液和第二溶液充分混合，在37 °C中放置24h，離心，取上清液通過 反相HPLC提純，收集的產物，真空干燥后，得到兩端共價修飾具有AIE性質分子的核酸適配 體；
[0071]步驟四、將步驟三得到的兩端共價修飾具有AIE性質的分子的核酸適配體溶于去 離子水，得到母液，在4 °C儲存備用；
[0072]步驟五、分別將不同數量的CCRF-CEM細胞（0，100，200，500，1000，2000，3000， 4000，5000，10000，15000，20000個)和和母液溶于20mM的pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中， 充分混合，得到最終體積為1〇〇此，兩端共價修飾具有AIE性質的分子的核酸適配體的最終 濃度為2.5yM的混合物，然后在室溫下分別測定混合物的熒光光譜。
[0073] 結果表明，混合物的熒光強度隨著溶液中CCRF-CEM細胞數量的增加而增強。
[0074] 實施例3
[0075] -種基于聚集誘導發光和核酸適配體的檢測細胞的方法，步驟如下：
[0076] 步驟一、將兩端修飾了氨基的Ramos適配體(序列為5'-H2N_AAC ACC GGG AGG ATA GTT CGG TGG CTG ITC AGG GTC TCC TCC CGG TG-NH2-3'，從上海生工購得)溶于碳酸氫鈉 水溶液中（〇. 1M，250yL)，得到第一溶液，兩端修飾了氨基的Ramos適配體的濃度為1 OOyM; [0077] 步驟二、將化合物1溶于DMS0(250yL)中，得到第二溶液，化合物1的濃度為ImM;
[0078] 步驟三、將第一溶液和第二溶液充分混合，在37 °C中放置24h，離心，取上清液通過 反相HPLC提純，收集的產物，真空干燥后，得到無色固體，即TPE-aptamer;
[0079] 步驟四、將TPE-aptamer溶于去離子水，得到母液，在4°C儲存備用；
[0080] 步驟五、分別將數量為20000的Ramos、Hela、CCRF-CEM、A929細胞和母液溶于20mM 的pH值為7 ? 4的磷酸鹽緩沖溶液中，充分混合，得到最終體積為100yL，TPE-aptamer的最終 濃度為2.5yM的混合物，然后在室溫下分別測定混合物的熒光光譜。
[00811測定結果如圖3所示，可以看出，除了Ramos細胞，其他幾種細胞均不能引起TPE-aptamer 的熒光的明顯增強，說明本發明的檢測方法對所檢測的細胞有很強的選擇性。
[0082] 實施例4
[0083] -種基于聚集誘導發光和核酸適配體的檢測細胞的方法，步驟如下：
[0084] 步驟一、將兩端修飾了氨基的Ramos適配體(序列為5'-H2N-AAC ACC GGG AGG ATA GTT CGG TGG CTG ITC AGG GTC TCC TCC CGG TG-NH2-3'，從上海生工購得)溶于碳酸氫鈉 水溶液中（〇.〇5M，250yL)，得到第一溶液，兩端修飾了氨基的Ramos適配體的濃度為50yM; [0085] 步驟二、將化合物1溶于DMS0(250yL)中，得到第二溶液，化合物1的濃度為0.25mM;
[0086] 步驟三、將第一溶液和第二溶液充分混合，在35 °C中放置36h，離心，取上清液通過 反相HPLC提純，收集的產物，真空干燥后，得到無色固體，即TPE-aptamer;
[0087] 步驟四、將TPE-aptamer溶于去離子水，得到母液，在2°C儲存備用；
[0088]步驟五、分別將不同數量的Ramos細胞（0，100，200，500，1000，2000，3000，4000， 5000，10000，15000，20000個)和母液溶于70 %的血清中，充分混合，得到最終體積為100yL， TPE-aptamer的最終濃度為2. OyM的混合物，然后在室溫下分別測定混合物的熒光光譜。
[0089] 測定結果表明，混合物的熒光強度隨著溶液中Ramos細胞數量的增加而增強。在0 ~4000個Ramos細胞的數量范圍內，細胞數量和熒光強度成正比的線性關系。
[0090] 實施例5
[0091 ] -種基于聚集誘導發光和核酸適配體的細胞成像的方法，步驟如下：
[0092] 步驟一、將兩端修飾了氨基的Ramos適配體(序列為5'-H2N-AAC ACC GGG AGG ATA GTT CGG TGG CTG ITC AGG GTC TCC TCC CGG TG-NH2-3'，從上海生工購得)溶于碳酸氫鈉 水溶液中（〇. 1M，250yL)，得到第一溶液，兩端修飾了氨基的Ramos適配體的濃度為100yM; [0093] 步驟二、將化合物1溶于DMS0(250yL)中，得到第二溶液，化合物1的濃度為ImM;
[0094] 步驟三、將第一溶液和第二溶液充分混合，在37 °C中放置24h，離心，取上清液通過 反相HPLC提純，收集的產物，真空干燥后，得到無色固體，即TPE-aptamer;
[0095] 步驟四、將TPE-aptamer溶于去離子水，得到母液，在4°C儲存備用；
[0096] 步驟五、分別將數量為10000的1^111〇8、(：〇^-0￡11細胞和母液溶于201111的口11值為7.4 的磷酸鹽緩沖溶液中，充分混合，得到最終體積為1〇〇此，TPE-aptamer的最終濃度為2.5yM 的混合物，將混合物在4°C下放置30min，然后分別滴在載玻片上，利用激光掃描共聚焦顯微 鏡拍攝細胞的熒光照片。
[0097] 結果如圖4所示，Ramos細胞可以觀察到明顯的藍色熒光而CCRF-CEM細胞則不行， 說明本發明的檢測方法可用于選擇性的細胞成像。
[0098] 實施例6
[0099] 基于聚集誘導發光和核酸適配體的檢測蛋白質的方法：
[0100] 步驟一、將兩端修飾了氨基的溶菌酶的適配體(序列為5'-ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG-3'）溶于碳酸氫鈉水溶液中（0.1M，250yL)，得到第一溶液，兩端修飾 了氨基的溶菌酶的適配體的濃度為l〇〇yM ;
[0101]步驟二、將化合物1溶于DMS0(250yL)中，得到第二溶液，化合物1的濃度為ImM; [0102] 步驟三、將第一溶液和第二溶液充分混合，在37 °C中放置24h，離心，取上清液通過 反相HPLC提純，收集的產物，真空干燥后，得到兩端共價修飾具有AIE性質的分子的核酸適 配體；
[0103] 步驟四、將兩端共價修飾具有AIE性質的分子的核酸適配體溶于去離子水，得到母 液，在4 °C儲存備用；
[0104] 步驟五、分別將不同質量的溶菌酶和母液溶于20mM的pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶 液中，充分混合，得到最終體積為l〇〇yL，兩端共價修飾具有AIE性質的分子的核酸適配體的 最終濃度為2.5yM，溶菌酶的濃度分別為0，0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20，50，100nM的混合物， 然后在室溫下分別測定混合物的熒光光譜。
[0105] 結果表明，混合物的熒光強度隨著溶液中溶菌酶濃度的增加而增強。
[0106] 實施例7
[0107] 基于聚集誘導發光和核酸適配體的檢測蛋白質的方法：
[0108] 步驟一、將兩端修飾了氨基的血小板衍生因子的適配體(序列為5'-AGG CTA CGG CAC GTAGAG CAT CAC CAT GAT CCT-3'），溶于碳酸氫鈉水溶液中（0.謂，250此），得到第一 溶液，兩端修飾了氨基的血小板衍生因子的濃度為i〇〇yM;
[0109] 步驟二、將化合物1溶于DMS0(250yL)中，得到第二溶液，化合物1的濃度為ImM; [0110] 步驟三、將第一溶液和第二溶液充分混合，在37 °C中放置24h，離心，取上清液通過 反相HPLC提純，收集的產物，真空干燥后，得到兩端共價修飾具有AIE性質的分子的核酸適 配體；
[0111] 步驟四、將兩端共價修飾具有AIE性質的分子的核酸適配體溶于去離子水，得到母 液，在4 °C儲存備用；
[0112] 步驟五、分別將不同質量的血小板衍生因子和母液溶于20mM的pH值為7.4的磷酸 鹽緩沖溶液中，充分混合，得到最終體積為1〇〇此，兩端共價修飾具有AIE性質的分子的核酸 適配體的最終濃度為2.5yM，血小板衍生因子的濃度分別為0，0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20， 50，100nM的混合物，在室溫下分別測定混合物的熒光光譜。
[0113] 結果表明，混合物的熒光強度隨著溶液中血小板衍生因子濃度的增加而增強。
[0114] 實施例8
[0115] 基于聚集誘導發光和核酸適配體的檢測蛋白質的方法：
[0116] 步驟一、將兩端修飾了氨基的血小板衍生因子的適配體(序列為5'-AGG CTA CGG CAC GTAGAG CAT CAC CAT GAT CCT-3'），溶于碳酸氫鈉水溶液中（0.15M，250yL)，得到第一 溶液，兩端修飾了氨基的血小板衍生因子的濃度為i〇〇yM;
[0117] 步驟二、將化合物1溶于DMS0(250yL)中，得到第二溶液，化合物1的濃度為2.25mM;
[0118] 步驟三、將第一溶液和第二溶液充分混合，在40 °C中放置12h，離心，取上清液通過 反相HPLC提純，收集的產物，真空干燥后，得到兩端共價修飾具有AIE性質的分子的核酸適 配體；
[0119] 步驟四、將兩端共價修飾具有AIE性質的分子的核酸適配體溶于去離子水，得到母 液，在8 °C儲存備用；
[0120] 步驟五、分別將不同質量的血小板衍生因子和母液溶于90%的血清中，充分混合， 得到最終體積為l〇〇yL，兩端共價修飾具有AIE性質的分子的核酸適配體的最終濃度為5.0y M，血小板衍生因子的濃度分別為0，0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20，50，100nM的混合物，在室溫 下分別測定混合物的熒光光譜。
[0121]結果表明，混合物的熒光強度隨著溶液中血小板衍生因子濃度的增加而增強。
【主權項】
1. 一種基于聚集誘導發光和核酸適配體的檢測方法，其特征在于，步驟如下： 步驟一、將兩端修飾了氨基的適配體溶于溶劑中，得到第一溶液； 所述適配體為細胞適配體或者蛋白適配體，溶劑為碳酸氫鈉水溶液或碳酸氫鉀水溶 液； 步驟二、將化合物1溶于溶劑中，得到第二溶液； 所述化合物1的結構式為所述溶劑為二甲基亞砜或二甲基甲酰 胺； 步驟三、將第一溶液和第二溶液混合均勻，得到混合溶液，在35~40°C中放置12~36h， 離心，取上清液通過反相高效液相色譜提純，收集的產物，〇°C以下真空干燥后，得到無色固 體，即為兩端共價修飾具有AIE性質分子的核酸適配體； 所述混合溶液中，兩端修飾了氨基的適配體與化合物1的摩爾比小于1:2; 步驟四、將步驟三得到的兩端共價修飾具有AIE性質分子的核酸適配體加入去離子水 中，得到母液； 步驟五、將步驟四中的母液、待測物與pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液或者70~90%的血 清混合，混合均勻后，檢測混合物的熒光強度； 所述待測物為待測細胞或者待測蛋白質，兩端共價修飾具有AIE性質分子的核酸適配 體的檢測濃度為2~5μΜ; 或者， 將步驟四中的母液、待測細胞與pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液或者70~90%的血清混 合，混合均勻后，在2~8 °C下放置20~60min，取混合物滴在載玻片上，利用激光掃描共聚焦 顯微鏡拍攝細胞的熒光照片； 所述兩端共價修飾具有AIE性質分子的核酸適配體的檢測濃度為2~5μΜ。2. 根據權利要求1所述的基于聚集誘導發光和核酸適配體的檢測方法，其特征在于，所 述步驟一中，碳酸氫鈉水溶液或碳酸氫鉀水溶液的濃度為0.05~0.15Μ。3. 根據權利要求1所述的基于聚集誘導發光和核酸適配體的檢測方法，其特征在于，所 述步驟一中，第一溶液中，兩端修飾了氨基的適配體的濃度為50~150μΜ。4. 根據權利要求1所述的基于聚集誘導發光和核酸適配體的檢測方法，其特征在于，所 述步驟二中，第二溶液中，化合物1的濃度為0.25~2.25mM。5. 根據權利要求1所述的基于聚集誘導發光和核酸適配體的檢測方法，其特征在于，所 述步驟三中，兩端修飾了氨基的適配體與化合物1的摩爾比為1: (5~15)。6. 根據權利要求1所述的基于聚集誘導發光和核酸適配體的檢測方法，其特征在于，所 述步驟四中，母液的儲存溫度為在2~8°C。7. 根據權利要求1所述的基于聚集誘導發光和核酸適配體的檢測方法，其特征在于，所 述步驟五中，待測細胞的數量為100以上。8. 根據權利要求1所述的基于聚集誘導發光和核酸適配體的檢測方法，其特征在于，所 述步驟五中，將步驟四中的母液、待測細胞與pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液或者70~90%的 血清混合，混合均勻后，在4°C下放置30min，然后滴在載玻片上。9. 根據權利要求1所述的基于聚集誘導發光和核酸適配體的檢測方法，其特征在于，所 述步驟五中，血清為80%，磷酸鹽緩沖溶液的濃度為20mM。10. 根據權利要求1所述的基于聚集誘導發光和核酸適配體的檢測方法，其特征在于， 所述步驟五中，兩端共價修飾具有AIE性質分子的核酸適配體的檢測濃度為2.5μΜ。
【文檔編號】G01N21/64GK105928920SQ201610363227
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月27日
【發明人】于聰, 陳健, 姜鴻, 周會鵬, 張云翊
【申請人】中國科學院長春應用化學研究所