一種中藥材紅外光譜邊分離邊分析多級宏觀指紋鑒定方法
【專利摘要】本發明提供一種中藥材紅外光譜邊分離邊分析多級宏觀指紋鑒定方法，包括以下步驟：取樣品，置于紅外光譜儀上，測定原藥材及各萃取部位樣品的紅外光譜圖；將各紅外光譜圖分別進行二階求導；得到上述相應各紅外光譜圖的二階導數譜；將所壓樣品裝入變溫附件，溫度程控50～180℃，溫度從50℃逐步升高，每升溫10℃采集一次紅外光譜，經二維相關分析軟件處理采集的系列光譜—變溫動態譜，即獲得二維紅外相關光譜。分析各紅外光譜圖中主要特征峰的歸屬，本發明將紅外光譜的宏觀指紋特性應用于中藥提取物的質量監控，從整體上對中藥提取物的質量進行控制，不僅快速、有效、可行，而且安全、綠色、環保，能夠為中藥提取物走向國際提供技術支撐。
【專利說明】
一種中藥材紅外光譜邊分離邊分析多級宏觀指紋鑒定方法
技術領域
[0001] 本發明屬于中藥檢測技術領域，具體涉及一種中藥材紅外光譜邊分離邊分析多級 宏觀指紋鑒定方法。
【背景技術】
[0002] 20 15版《中國藥典》收載的老鸛草為櫳牛兒苗科植物櫳牛兒苗（Erodium stehaianum Willd.)、老鶴草（Geranium wilfordii Maxim.)或野老鶴草（Geranium carolinianum L.)的干燥地上部分。具有祛風濕，通經絡，止瀉痢等作用。特別是近年醫學 研究發現，老鸛草中的鞣質類物質對腫瘤方面的疾病有突出的療效。但成分復雜的老鸛草 藥材及其提取物的分析質控目前仍然是難題。
[0003]紅外光譜法又稱"紅外分光光度分析法"。是分子吸收光譜的一種。根據不同物質 會有選擇性的吸收紅外光區的電磁輻射來進行結構分析;對各種吸收紅外光的化合物的定 量和定性分析的一種方法。物質是由不斷振動的狀態的原子構成，這些原子振動頻率與紅 外光的振動頻率相當。用紅外光照射有機物時，分子吸收紅外光會發生振動能級躍迀，不同 的化學鍵或官能團吸收頻率不同，每個有機物分子只吸收與其分子振動、轉動頻率相一致 的紅外光譜，所得到的吸收光譜通常稱為紅外吸收光譜，簡稱紅外光譜"IR"，。對紅外光譜 進行分析，可對物質進行定性分析。各個物質的含量也將反映在紅外吸收光譜上，可根據峰 位置、吸收強度進行定量分析。如文獻"丹參丹酚酸邊分離邊分析的紅外光譜法研究"（第十 七屆全國分子光譜學學術會議論文集2012-10-19)采用邊分離邊分析的紅外光譜法快速監 控并分析了丹參總丹酚酸從丹參原藥材到總丹酚酸局部再到丹酚酸B單體的整個提取過 程。結果表明，各級組分都有各自的紅外光譜指紋特征。
【發明內容】
[0004] 本發明為解決上述技術問題提供一種快速、有效、可行，而且安全、綠色、環保的一 種中藥材紅外光譜邊分離邊分析多級宏觀指紋鑒定方法。
[0005] 本發明為解決上述技術問題所采取的方案為:一種中藥材紅外光譜邊分離邊分析 多級宏觀指紋鑒定方法，其特征在于以下步驟： 先將中藥材切斷、粉碎、并過200目篩； 在上述所得藥材粉末中，加入提取劑，提取60min，過濾，回收提取劑，得水溶液； 將水溶液依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各提取液經過減壓濃縮后得到氯仿層、 乙酸乙酯層、正丁醇層和水層； 制樣:加入溴化鉀粉末進行壓片制樣，得壓片試樣； 測定所述壓片試樣的紅外光譜圖； 采用軟件對所述的紅外光譜圖二階導數譜解析，得二階導數譜； 測定所述壓片試樣的二維相關紅外譜； 依次分級對比相應圖譜，即可對各提取部位樣品的主體成分、特征成分以及無機成分 等進行分析鑒定； 其中，上述預處理步驟中的提取劑為1-4份丙酮、2-5份乙酸乙酯、1-9份甲醇、1-70份 水，因其取得效果的機理尚不明確可能是疊加產生了意料不到的效果或協同交互作用。
[0006]優選的，上述預處理步驟中的提取劑為3份丙酮、2份乙酸乙酯、9份甲醇、60份水。 [0007]或者，上述預處理步驟中的提取劑為2份丙酮、4份乙酸乙酯、7份甲醇、68份水。 [0008]或者，上述預處理步驟中的提取劑為1份丙酮、3份乙酸乙酯、5份甲醇、55份水。 [0009]或者，上述預處理步驟中的提取劑為4份丙酮、2份乙酸乙酯、3份甲醇、49份水。 [0010]上述的紅外光譜圖二階導數譜解析溫度程控為50~180°C。
[0011] 上述的提取方法為超聲提取，利用超聲振動使乙醇快速的進入藥材粉末中，是其 所含有機成分盡可能完全地溶于溶劑中。
[0012] 與現有技術相比，本發明所具有的優點在于： 1、提取劑配方合理，可以充分提取中藥材成分、脫除率高，且攝取用量少。
[0013] 2、采用紅外光譜技術對中藥材的提取分離過程進行了實時監控，記錄了提取分離 過程中整體化學信息的動態變化規律，建立了以紅外宏觀指紋法為先導的"邊分離邊分析" 技術。
[0014]
【附圖說明】： 圖1:老鸛草與老鸛草素的紅外光譜(4000~400cm-l) 圖2:老鸛草與老鸛草素的二階導數譜（1800~700cm-l) 圖3:不同樣品的紅外光譜圖（4000~400 cm-1) a.氯仿層b.乙酸乙酯層c.正丁醇層d. 水層e.老鸛草素 f.硝酸鉀 圖4:不同樣品的二階導數譜圖（1800~700 cm-1) a.氯仿層b.乙酸乙酯層c.正丁醇層 d.水層e.老鸛草素 f.硝酸鉀 圖5:老鸛草丙酮提取物的四個提取層的二維同步相關紅外光譜(1800~1000 cm-l)a. 氯仿層b.乙酸乙酯層c.正丁醇層d.水層e.硝酸鉀 圖6:硝酸鉀的二維同步相關紅外光譜（1800~1000 cm-1)。
【具體實施方式】
[0015]以下結合附圖和實施例作進一步詳細描述： 實施例1: 1、一種中藥材紅外光譜邊分離邊分析多級宏觀指紋鑒定方法，其特征在于以下步驟： 1) 先將中藥材切斷、粉碎、并過200目篩； 2) 在上述所得藥材粉末中，加入提取劑，提取60min，過濾，回收提取劑，得水溶液； 3) 將水溶液依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各提取液經過減壓濃縮后得到氯仿 層、乙酸乙酯層、正丁醇層和水層； 4) 制樣:加入溴化鉀粉末進行壓片制樣，得壓片試樣； 5) 測定所述壓片試樣的紅外光譜圖； 6) 采用軟件對所述的紅外光譜圖二階導數譜解析，得二階導數譜； 7) 測定所述壓片試樣的二維相關紅外譜； 8) 依次分級對比相應圖譜，即可對各提取部位樣品的主體成分、特征成分以及無機成 分等進行分析鑒定； 其中，所述預處理步驟中的提取劑為1-4份丙酮、2-5份乙酸乙酯、1-9份甲醇、1-70份 水。
[0016]優選的，上述預處理步驟中的提取劑為3份丙酮、2份乙酸乙酯、9份甲醇、60份水。 [0017]或者，上述預處理步驟中的提取劑為2份丙酮、4份乙酸乙酯、7份甲醇、68份水。 [0018]或者，上述預處理步驟中的提取劑為1份丙酮、3份乙酸乙酯、5份甲醇、55份水。
[0019] 或者，上述預處理步驟中的提取劑為4份丙酮、2份乙酸乙酯、3份甲醇、49份水。
[0020] 上述的紅外光譜圖二階導數譜解析溫度程控為50~180°C。實施例2:老鸛草原藥 材主體成分分析 實施例2: 實驗方法： 用KBr壓片法制樣，獲得原藥材在室溫下的紅外光譜圖。用PerkinElmer公司的 Spectrum v6.02軟件進行二階導數圖譜解析，平滑點數為13點。老鸛草中含有鞣質類、黃酮 類成分以及糖類成分。1730、1618~1445 cm-1主要歸屬于老鸛草素及其衍生物的鞣質類 物質的吸收峰。在1337 cm-1處的吸收峰為酸類分子的0-H彎曲振動，1232 cm-1為糖類分子 C-0伸縮振動吸收，在1048 cm-1處的C-0強吸收峰則來自于糖苷類成分;老鸛草二階導數譜 提高了圖譜表觀分辨率，原圖譜中吸收峰被分解成多個峰，1746 cm-1處出現酯類分子C=0 伸縮振動，說明原藥材中也有少量酯類成分。1618~1445 cm-1苯環骨架振動吸收峰被突顯 出來，證實鞣質類以及少量黃酮類成分(另有1659 cm-1)的存在。
[0021] 實施例3:老鸛草不同萃取部位紅外光譜以及二階導數光譜分析 實驗方法： 先將中藥材加提取物超聲提取60min(提取物為3份丙酮、2份乙酸乙酯、9份甲醇、60份 水），過濾，回收提取物，水溶液依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，將各提取液經過減壓濃 縮后得到氯仿層、乙酸乙酯層、正丁醇層和水層，加入溴化鉀粉末進行壓片制樣，獲得各萃 取層在室溫下的紅外光譜圖。用PerkinElmer公司的Spectrum v6.02軟件進行二階導數圖 譜解析，平滑點數為13點。老鸛草提取物氯仿層、乙酸乙酯層、正丁醇層均有明顯的鞣質類 成分的特征吸收峰，3600~2500 cm-1的0-H伸縮振動吸收區域有寬而強的吸收峰，1728~ 1714 cm-1酯類和酸類分子的C=0伸縮振動，和1600~1450 cm-1有明顯的苯環骨架伸縮振 動峰，通過相似度比較可以看出乙酸乙酯層中多酚類成分含有較多的老鸛草素，其次為正 丁醇層、氯仿層。二階導數譜更可清晰表明在氯仿層中有酯羰基吸收峰（1746 cm-1)，723 cm-1處吸收峰證明在氯仿層中有油脂類成分，在乙酸乙酯與正丁醇層中出現更多特征峰與 老鸛草素相對應的鞣質類特征吸收峰;水層中很強吸收峰出現在1384、825 cm-1的，檢索表 明其為硝酸鉀特征吸收峰。但是在原藥材中未發現硝酸鉀的吸收峰，可能是因為在提取過 程中對硝酸鹽進行了富集，在氯仿層、乙酸乙酯層也相應地發現了硝酸鉀吸收峰。
[0022] 實施例4:老鸛草不同萃取部位的二維相關紅外光譜 實驗方法： 將所壓不同萃取部位樣品裝入變溫附件，溫度程控50~180°C，溫度從50°C逐步升高， 每升溫l〇°C采集一次紅外光譜，經二維相關分析軟件處理采集的系列光譜一變溫動態譜， 即獲得二維紅外相關光譜。老鸛草提取物氯仿層、乙酸乙酯層、正丁醇層與水層1800~1000 cm-1二維相關紅外光譜有數量不等的明顯自動峰。在乙酸乙酯層自動峰最多為10個，而水 層中只出現兩個，因此可以很直觀地區分四者。氯仿層1701 cm-1處酯類羰基的吸收峰隨溫 度升高峰強度逐漸降低；乙酸乙酯層與正丁醇層中在1629和1619 cm-1附近是鞣質類成分 相關的吸收峰隨著溫度升高強度也逐漸減弱。氯仿層、乙酸乙酯層、正丁醇層、水層提取物 的二維相關譜中均有N03-( 1383 cm-1)的一個強且尖的自動峰，且與其他自動峰的交叉峰 均為負，說明此處在溫度微擾下總體變化趨勢與其他自動峰變化趨勢相反。另外結果表明， 正丁醇層中也含有少量的硝酸鉀，雖然在其一維圖譜和二階導數圖譜并沒有與硝酸鉀有關 的吸收峰出現，驗證了二維相關光譜確實可以提高紅外光譜的檢測限和譜圖分辨率。通過 1383 cm-1自動峰強度及其與其他峰的關系可快速判斷硝酸鉀的存在和相對含量。
[0023] 實施例5: 實驗方法： 用KBr壓片法制樣，獲得原藥材在室溫下的紅外光譜圖。用PerkinElmer公司的 Spectrum v6.02軟件進行二階導數圖譜解析，平滑點數為13點。老鸛草中含有鞣質類、黃酮 類成分以及糖類成分。1730、1618~1445 cm-1主要歸屬于老鸛草素及其衍生物的鞣質類 物質的吸收峰。在1337 cm-1處的吸收峰為酸類分子的0-H彎曲振動，1232 cm-1為糖類分子 C-0伸縮振動吸收，在1048 cm-1處的C-0強吸收峰則來自于糖苷類成分;老鸛草二階導數譜 提高了圖譜表觀分辨率，原圖譜中吸收峰被分解成多個峰，1746 cm-1處出現酯類分子C=0 伸縮振動，說明原藥材中也有少量酯類成分。1618~1445 cm-1苯環骨架振動吸收峰被突顯 出來，證實鞣質類以及少量黃酮類成分(另有1659 cm-1)的存在。
[0024] 實施例6:老鸛草不同萃取部位紅外光譜以及二階導數光譜分析 實驗方法： 先將中藥材加提取物超聲提取60min(提取物為1份丙酮、3份乙酸乙酯、5份甲醇、55份 水。），過濾，回收提取物，水溶液依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，將各提取液經過減壓 濃縮后得到氯仿層、乙酸乙酯層、正丁醇層和水層，加入溴化鉀粉末進行壓片制樣，獲得各 萃取層在室溫下的紅外光譜圖。用PerkinElmer公司的Spectrum v6.02軟件進行二階導數 圖譜解析，平滑點數為13點。老鸛草提取物氯仿層、乙酸乙酯層、正丁醇層均有明顯的鞣質 類成分的特征吸收峰，3600~2500 cm-1的0-H伸縮振動吸收區域有寬而強的吸收峰，1728 ~1714 cm-1酯類和酸類分子的C=0伸縮振動，和1600~1450 cm-1有明顯的苯環骨架伸縮 振動峰，通過相似度比較可以看出乙酸乙酯層中多酚類成分含有較多的老鸛草素，其次為 正丁醇層、氯仿層。二階導數譜更可清晰表明在氯仿層中有酯羰基吸收峰（1746 cm-l)，723 cm-1處吸收峰證明在氯仿層中有油脂類成分，在乙酸乙酯與正丁醇層中出現更多特征峰與 老鸛草素相對應的鞣質類特征吸收峰;水層中很強吸收峰出現在1384、825 cm-1的，檢索表 明其為硝酸鉀特征吸收峰。但是在原藥材中未發現硝酸鉀的吸收峰，可能是因為在提取過 程中對硝酸鹽進行了富集，在氯仿層、乙酸乙酯層也相應地發現了硝酸鉀吸收峰。
[0025] 實施例7:老鸛草不同萃取部位的二維相關紅外光譜 實驗方法： 將所壓不同萃取部位樣品裝入變溫附件，溫度程控50~180°C，溫度從50°C逐步升高， 每升溫l〇°C采集一次紅外光譜，經二維相關分析軟件處理采集的系列光譜一變溫動態譜， 即獲得二維紅外相關光譜。老鸛草提取物氯仿層、乙酸乙酯層、正丁醇層與水層1800~1000 cm-1二維相關紅外光譜有數量不等的明顯自動峰。在乙酸乙酯層自動峰最多為11個，而水 層中只出現兩個，因此可以很直觀地區分四者。氯仿層1701 cm-1處酯類羰基的吸收峰隨溫 度升高峰強度逐漸降低；乙酸乙酯層與正丁醇層中在1629和1619 cm-1附近是鞣質類成分 相關的吸收峰隨著溫度升高強度也逐漸減弱。氯仿層、乙酸乙酯層、正丁醇層、水層提取物 的二維相關譜中均有N03-( 1383 cm-1)的一個強且尖的自動峰，且與其他自動峰的交叉峰 均為負，說明此處在溫度微擾下總體變化趨勢與其他自動峰變化趨勢相反。另外結果表明， 正丁醇層中也含有少量的硝酸鉀，雖然在其一維圖譜和二階導數圖譜并沒有與硝酸鉀有關 的吸收峰出現，驗證了二維相關光譜確實可以提高紅外光譜的檢測限和譜圖分辨率。通過 1383 cm-1自動峰強度及其與其他峰的關系可快速判斷硝酸鉀的存在和相對含量。
[0026] 對比實驗： 設置對照組，通過對比實驗，如下表1，實施例較現有技術具有明顯且出乎意料的產品 特性，在沒有明顯增加成本的情況下產品性能顯著改善。
[0027] 表1對比試驗結果
雖然本發明已以實施例公開如上，但其并非用以限定本發明的保護范圍，任何熟悉本 領域的技術人員，在不脫離本發明的構思和范圍內所做的更動和潤飾，均應屬于本發明所 附權利要求的保護范圍。
【主權項】
1. 一種中藥材紅外光譜邊分離邊分析多級宏觀指紋鑒定方法，其特征在于以下步驟： 1)先將中藥材切斷、粉碎、并過200目篩； 2 )在上述所得藥材粉末中，加入提取劑超聲提取60min，過濾，回收提取劑，得水溶液； 3) 將水溶液依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各提取液經過減壓濃縮后得到氯仿 層、乙酸乙酯層、正丁醇層和水層； 4) 制樣:加入溴化鉀粉末進行壓片制樣，得壓片試樣； 5) 測定所述壓片試樣的紅外光譜圖； 6) 采用軟件對所述的紅外光譜圖二階導數譜解析，得二階導數譜； 7) 測定所述的壓片試樣的二維相關紅外譜； 8) 依次分級對比相應圖譜，即可對各提取部位樣品的主體成分、特征成分以及無機成 分等進行分析鑒定； 其中，所述預處理步驟中的提取劑為1-4份丙酮、2-5份乙酸乙酯、1-9份甲醇、1-70份 水。2. 根據權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于:所述步驟6)中的紅外光譜圖二階導數 譜解析溫度程控為50~180°C。
【文檔編號】G01N21/3563GK105928897SQ201610386026
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月3日
【發明人】孫仁爽, 滕坤, 張海豐, 胡彥武, 關穎麗, 李成華
【申請人】通化師范學院