一種基于動態三明治結構的電化學傳感器及其制備和應用

一種基于動態三明治結構的電化學傳感器及其制備和應用
【專利摘要】本發明屬于生物電化學技術領域，具體涉及一種基于動態三明治結構的電化學傳感器及其制備和應用。本發明所述電化學生物傳感器，由電極、信號鏈和反應體系組成，電極采用金電極，信號鏈為一段單鏈DNA，DNA鏈的5’端修飾有巰基，DNA鏈的3’端修飾有亞甲基藍，通過巰基與金電極表面自組裝形成金?巰鍵立于金電極表面，反應體系中含有DNAzyme與必須的反應緩沖體系，DNAzyme可以與信號鏈互補配對并將其切割成兩段DNA短鏈，DNAzyme上標記有靶蛋白識別元件，可用于定量檢測蛋白質或蛋白質間相互作用，本發明操作簡單，操作者無需特別訓練，適合于偏遠地區及資源貧乏地區使用。
【專利說明】
一種基于動態三明治結構的電化學傳感器及其制備和應用
一、技術領域
[0001]本發明屬于生物電化學技術領域，具體涉及一種基于動態三明治結構的電化學傳感器及其制備和應用。
二、【背景技術】
[0002]在人蛋白質組中大約存在65萬種蛋白質相互作用對，這些蛋白質分子彼此間的相互作用控制著細胞絕大多數的活動，破譯這些蛋白質分子的相互作用網絡不僅可以更加深入的理解這些蛋白質是如何發揮功能并最終影響細胞活動，而且有助于人們設計更加特異性的藥物分子來治療特定的疾病。因此，在生物基礎研究領域對于發展靈敏、操作友好的分析方法來檢測這些蛋白質間的相互作用事件有著內在的迫切要求。
[0003]目前，已有多種研究蛋白質間相互作用的方法被開發出來。比如，免疫共沉淀法作為測定蛋白質相互作用的金標準，被廣泛使用多年(Barr1s.R.M.,Brown,K.R.,Ozdamar,B.，Bose，R.,LiujZ.,DonovanjR.S.，ShinjojF.,LiujY.,Dembowy,J.&Taylor，1.ff.High-Throughput Mapping of a Dynamic Signaling Network in Mammalian Cells.Science2005,307，1621)。但是免疫共沉淀法往往需要結合蛋白印跡法或者質譜法才能獲得最后的結果，過多的實驗步驟使得整個方法耗時耗力，大大降低了分析效率。蛋白片段互補檢測法是細胞內蛋白質相互作用原位成像一個強有力的工具(Kerppo la，T.K.BimolecularFluorescence Complementat1n(Bifc)Analysis as a Probe of Protein Interact1nsin Living Cells.Ann.Rev.B1phys.2008,37,465)。然而，革巴蛋白上需要融合被切斷的報告酶(綠色熒光蛋白或熒光素酶等)，這些報告酶片段很可能會干擾兩種蛋白質之間的相互作用，得到假陽性結果。至于表面等離子共振法，核磁共振法和等溫滴定量熱法等(Kerppola,T.K.Bimolecular Fluorescence Complementat1n(Bifc)Analysis as aProbe of Protein Interact1ns in Living Cells.Ann.Rev.B1phys 2008,37,465；Vaynberg,J.&Qin,J.Weak Protein-Protein Interact1ns as Probed by NMRSpectroscopy.Trends B1technol.2006,24,22；Ronkainen,N.J.,Halsall,H.B.&Heineman,ff.R.Electrochemical B1sensors.Chem.Soc.Rev.2010,39,1747)，由于需要昂貴的大型儀器設備，極大的限制了它們在許多領域的應用，特別是在資源匱乏的地區。因此，如何開發更加靈敏、簡單、高效的方法來分析復雜生物環境下的蛋白質分子間的相互作用就變得十分重要。
[0004]電化學技術由于其固有的簡單，靈敏，便攜和經濟等性質被廣泛用于各種生物分子的檢測中。盡管存在這些優點，利用電化學技術研究蛋白質相互作用仍處于探索階段，而且經常面臨靈敏度和精確度不足的問題。近年來，隨著DNA納米技術的發展，將生物電化學技術和DNA納米技術相結合，開發各項性能更加優異的生物傳感器成為了新的熱點(Li，C.，Li,X.,Wei,L.,Liu,M.,Chen,Y.&Li,G.Simple Electrochemical Sensing of AttomolarProteins Using Fabricated Complexes with Enhanced Surface BindingAvidity.Chem.Sc1.2015,6,4311)o三、

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種可以定量檢測蛋白質或蛋白質間相互作用的生物傳感器及其制備方法和應用。本發明充分利用DNA納米技術，提出了使用電化學技術為表征手段的蛋白質定量和蛋白質間相互作用研究方案，以求達到成本更低、快速簡單的檢測復雜生物環境下的蛋白質分子和蛋白質分子間相互作用。
[0006]為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案:一種基于動態三明治結構的電化學生物傳感器，包括:電極、信號鏈和反應體系，電極采用金電極，信號鏈為一段單鏈DNA，DNA鏈的5 ’端修飾有巰基，DNA鏈的3 ’端修飾有亞甲基藍，通過巰基與金電極表面自組裝形成金-巰鍵立于金電極表面，反應體系中含有DNA核酶(DNAzyme)與必須的反應緩沖體系，DNAzyme可以與信號鏈互補配對并將其切割成兩段DNA短鏈，DNAzyme上標記有靶蛋白識別元件。
[0007]所述DNA 信號鏈含有 17 個堿基，序列為 5’-C6-SH-CTCACTATrAGGAAGAG-methyleneblue-3，。
[0008]所述反應體系中包括:1mMTris-HCiaOnM DNAzyme，200mM NaCl，ImM ZnCl2,pH7.2。
[0009]所述DNAzyme序列為5’-Digoxin-CTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAG-3’。
[0010]本發明所述一種基于動態三明治結構的電化學傳感器的制備方法，包括以下步驟:
[0011](I)金電極的預處理:將金電極在水虎魚溶液(70 %濃硫酸，30 %過氧化氫)中處理10分鐘，隨后將電極依次用1.0μπι，0.3μπι的氧化鋁粉末拋光，并在乙醇和純水中超聲清洗5分鐘，最后將電極置于水虎魚溶液中處理10分鐘，取出沖洗，并在0.5Μ的硫酸中循環伏安掃描至穩定。
[0012](2)功能電極的組裝:將信號鏈分散在DNA固定液中，滴加到處理好的金電極上，室溫固定后取出電極用超純水沖洗，MCH封閉后即可得到組裝好的電極。
[0013]所述步驟一中金電極為直徑3mm的圓盤金電極。
[0014]所述步驟二中信號鏈DNA濃度為0.4?2μΜ。
[0015]所述步驟二中DNA固定液為1mMTris-HCl，10mM NaCl，ImM EDTA,1mM TCEP，pH7.4。
[0016]所述步驟二中DNA固定時間為I?12小時。
[0017]所述步驟二中MCH封閉時間為I?4小時。
[0018]所述步驟二中MCH濃度為I?5mM。
[0019]本發明所述一種基于動態三明治結構的電化學傳感器用于定量檢測蛋白質或蛋白質間相互作用的方法，包括以下步驟:
[0020](I)信號鏈修飾的金電極在-0.05?-0.5V范圍內，對其進行電化學方波伏安法檢測。
[0021](2)靶蛋白先與反應體系作用10分鐘后滴加到信號鏈修飾的金電極表面，37°C孵育40分鐘后，同樣條件進行電化學檢測。
[0022]本發明利用了分子在界面上不同的擴散速率來實現對蛋白質分子的檢測。傳統的免疫傳感器中廣泛使用的“一抗一靶標一二抗”三明治結構一旦形成就無法改變，由于靶蛋白無法釋放出來進行有效的循環，檢測靈敏度受到了一定的限制。本發明提供了一種新的思路，利用DNAzyme的循環切割能力使得靶標蛋白可以完成多次信號轉導過程，有效實現信號的增益效果。
[0023]DNAzyme由于尺寸較小(直徑小于2nm)，可以很容易的擴散到電極表面并與修飾在電極上面的信號鏈形成互補配對，然后DNAzyme發揮作用將信號鏈切為兩半，這時雙鏈結構變得不穩定，標記有亞甲基藍的DNA短鏈會脫落下來擴散到溶液中，同時DNAzyme則恢復單鏈狀態，又可以結合下一條信號鏈，繼續將其切斷，最終大大減弱亞甲基藍的電信號；當溶液中存在革巴蛋白時，革巴蛋白與DNAzyme上的識別位點結合，由于革巴蛋白較大的體積(直徑大于1nm)，會顯著拖慢DNAzyme的擴散和切割速率，在相同的作用時間內，電極上的信號鏈不會被大量切割，從而產生信號差異，實現該傳感器對靶蛋白的檢測。
[0024]與現有技術相比，本發明至少具有以下有益效果:
[0025]1、本發明依靠于靶標一配體特異性識別和高保真度的DNA雜交保證了實驗在復雜生物樣本下仍具有高度的選擇性，通過替換DNAzyme上的識別元件(抗體、適體、多肽、小分子等)理論上可以檢測任何目標蛋白，并研究其與其他蛋白的相互作用。
[0026]2、本發明可以直接檢測到亞納摩爾級別的靶標蛋白并可以分析其與類似濃度的其他蛋白質的相互作用；在金納米顆粒的幫助下，檢測靈敏度可大幅提升至飛摩爾級別的目標物，十分方便分析珍貴樣本。
[0027]3、本發明僅需要短時間的一步孵育，操作簡單，避免了復雜的實驗步驟，操作者無需特別訓練。
[0028]4、本發明利用便宜且便攜的電化學工作站，適合于偏遠地區及資源貧乏的地區使用。
四、【附圖說明】
[0029]圖1為動態三明治結構電化學傳感器進行免疫球蛋白質定量檢測的原理圖。
[0030]圖2為加入或不加入羊抗地高辛抗體的電化學方波伏安信號變化圖。
[0031 ]圖3為動態三明治結構電化學傳感器進行抗體一抗體相互作用分析的原理圖。
[0032]圖4為加入或不加入羊抗地高辛抗體一兔抗羊抗體復合物的電化學方波伏安信號隨時間變化圖。
[0033]圖5為兔抗羊抗體的滴定曲線。
[0034 ]圖6為金納米顆粒輔助下的羊抗地高辛抗體滴定曲線。
五、【具體實施方式】
[0035]下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步的說明。
[0036]圖1是動態三明治結構電化學傳感器進行免疫球蛋白質定量檢測的原理圖。DNAzyme由于尺寸較小(直徑小于2nm)，可以很容易的擴散到電極表面并與修飾在電極上面的信號鏈形成互補配對，然后DNAzyme發揮作用將信號鏈切為兩半，這時雙鏈結構變得不穩定，標記有亞甲基藍的DNA短鏈會脫落下來擴散到溶液中，同時DNAzyme則恢復單鏈狀態，又可以結合下一條信號鏈，繼續將其切斷，最終大大減弱亞甲基藍的電信號；當溶液中存在靶蛋白時，革巴蛋白與DNAzyme上的識別位點結合，由于革巴蛋白較大的體積(直徑大于1nm)，會顯著拖慢DNAzyme的擴散和切割速率，在相同的作用時間內，電極上的信號鏈不會被大量切害J，從而產生信號差異，實現該傳感器對靶蛋白的檢測。
[0037]實施例一:動態三明治結構電化學傳感器檢測羊抗地高辛免疫球蛋白反應流程
[0038]步驟一，將直徑為3mm的金電極倒置固定好，取98%濃硫酸與過氧化氫按照3:1的比例混合配置成水虎魚溶液，滴加1yL水虎魚溶液完全覆蓋金表面，1min后用大量超純水沖洗；金電極分別用I.Ομπι氧化鋁粉末于絹布和0.3μπι氧化鋁粉末在麂皮上輕柔打磨各5min，使電極表面光滑至鏡面;用大量超純水沖洗打磨好的金電極表面，將金電極先后浸入乙醇和超純水中，超聲清洗5min;用氮氣將電極表面吹干，再次滴加1yL水虎魚溶液于電極表面I Omin后，超純水沖洗。
[0039]步驟二，將處理過的金電極置于0.5M H2SO4中，在O?1.6V電壓范圍內進行循環伏安掃描，掃速為100mV/S，直至峰電流穩定;配制5yL的反應體系，其中含有終濃度為0.4?2μM信號鏈(序列:5’-C6-SH-CTCACTATrAGGAAGAG-methylene blue-3’ MPlOmM TCEP(緩沖液體系:10mM Tris-HCl，10mM NaCl，pH 7.4)，滴加到處理好的電極上，蓋上電極帽，防止水分的蒸發，室溫下修飾lh，信號鏈通過巰基共價固定到金電極表面；用超純水沖洗電極，用I mM的MCH溶液對電極進行封閉I h，占據電極上未反應的活性位點，再用超純水沖洗，吹干，記得到信號鏈修飾的金電極。
[0040]步驟三，取不同濃度的羊抗地高辛抗體加入到1mM Tris-HCl，1nM標記有地高辛分子的DNAzyme(序列:5’-Digoxin-CTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAG-3’)，200mM NaCl，ImM ZnCl2,pH 7.2中形成10yL的反應體系。將信號鏈修飾的金電極插入到含有抗地高辛抗體的反應體系中，在37°C金屬浴中反應40min ；將反應后的電極放置于4mL的電化學檢測液(1mM Tris-HCl，10mM NaCl, pH 7.4)中，利用三電極體系(信號鏈修飾的金電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為對電極)，以方波伏安法(SWV)檢測修飾在信號鏈上的亞甲基藍信號(圖2)。
[0041]實施例二:動態三明治結構電化學傳感器檢測抗體一抗體相互作用反應流程
[0042]圖3是動態三明治結構電化學傳感器進行抗體一抗體相互作用分析的原理圖。在實施例一的基礎上，如果在檢測體系中進一步引入可以與羊抗地高辛免疫球蛋白(Abl)發生相互作用的兔抗羊免疫球蛋白(Ab2)，濃度定為0.01nM、0.5nM、1.5nM、5nM、8nM、20nM、200nM、2000nM，由于形成的“DNAzyme—羊抗體一兔抗羊抗體”復合結構體積進一步增大，使得DNAzyme對信號鏈的切割更加緩慢(圖4)，在相同的作用時間內，電化學信號進一步提升，通過比較單獨羊抗體的電化學信號，即可分析得知溶液中兔抗羊抗體的存在(圖5)。
[0043]實施例三:聯合動態三明治結構和金納米顆粒的電化學傳感器靈敏檢測羊抗地高辛免疫球蛋白反應流程
[0044]由于DNAzyme上的吸附物體積越大，切割金電極上信號鏈的能力就越低，如果將DNAzyme與金納米顆粒連接起來形成超大體積的“DNAzyme—革E標物一金納米顆粒”復合結構，將會極大的提高傳感器的分析能力。
[0045]步驟一，將20nm檸檬酸覆蓋的金納米顆粒溶液(3nM)用10mMK2CO3溶液調至pH
9.0;取1yL lmg/mL的兔抗羊抗體加入到990yL上述金納米顆粒溶液中，室溫孵育2h;13000rpm離心15min，棄去上清液，用990yL PBS(pH 8.0)重懸，重復一次，去除溶液中未與金納米顆粒結合的抗體;加入I OyL 10%的BSA溶液封閉未被抗體吸附的金納米顆粒表面，室溫震蕩反應30min； 13000rpm離心15min，棄去上清液，用990yL PBS(pH 8.0)重懸，重復三次，即可得到ImL兔抗羊抗體修飾的金納米顆粒。
[0046]步驟二，在得到實施例一中的信號鏈修飾電極后，取UiL不同濃度的羊抗地高辛抗體與2yL兔抗羊抗體修飾的金納米顆粒37°C孵育30min;上述復合物加入1mM Tris-HCl，1nM標記有地高辛分子的DNAzyme，200mM NaCl，ImM ZnCl2,pH 7.2中形成ΙΟΟΛ的反應體系;進行與實施例一類似的電化學檢測(圖6)。
【主權項】
1.一種基于動態三明治結構的電化學傳感器，其特征是由電極、信號鏈、反應體系和電極檢測液組成，電極采用金電極，信號鏈為一段單鏈DNA，DNA鏈的5 ’端修飾有巰基，DNA鏈的3’端修飾有亞甲基藍，通過巰基與金電極表面自組裝形成金-巰鍵立于金電極表面，反應體系中含有DNA核酶DNAzyme與必須的反應緩沖體系，DNAzyme可以與信號鏈互補配對并將其切割成兩段DNA短鏈，DNAzyme上標記有靶蛋白識別元件。2.根據權利要求1所述一種基于動態三明治結構的電化學傳感器，其特征在于:DNA信號鏈含有 16個堿基，序列為5’-C6-SH-CTCACTATrAGGAAGAG-Methylene blue-3’，所述DNAzyme序列為5 ’ -Digoxin-CTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAG-3 ’，所述反應體系為1mMTris-HCiaOnM DNAzyme，200mM NaCl, ImM ZnCl2,pH 7.2，所述電極檢測液為1mM Tris-HCl，10mM NaCl,pH 7.4。3.根據權利要求1所述一種基于動態三明治結構的電化學傳感器的制備方法，其特征是由以下步驟構成: (1)金電極的預處理:將直徑3mm的圓盤金電極在水虎魚溶液即70%濃硫酸和30%過氧化氫的混合液中處理10分鐘，隨后將電極依次用1.Ομπι，0.3μηι的氧化鋁粉末拋光，并在乙醇和純水中超聲清洗5分鐘，最后將電極置于水虎魚溶液中處理10分鐘，取出沖洗，并在0.5Μ的硫酸中循環伏安掃描至穩定； (2)功能電極的組裝:將信號鏈分散在濃度為0.4?2μΜ的DNA固定液中，滴加到處理好的金電極上，固定液為 1mM Tris-HCl，10mM NaCl，ImM EDTA ,1mM TCEP，pH 7.4，室溫固定I?12小時后取出電極，用超純水沖洗，濃度為I?5mM的MCH封閉I?4小時后，即得到組裝好的電極。4.權利要求1所述一種基于動態三明治結構的電化學傳感器在定量檢測蛋白質或蛋白質間相互作用中的應用。5.根據權利要求4所述一種基于動態三明治結構的電化學傳感器在定量檢測蛋白質或蛋白質間相互作用中的應用，其特征是電化學傳感器用于定量檢測蛋白質或蛋白質間相互作用的方法，由以下步驟構成: (1)信號鏈修飾的金電極在-0.05?-0.5V范圍內，對其進行電化學方波伏安法檢測； (2)靶蛋白先與反應體系作用10分鐘后，將信號鏈修飾的金電極插入到加入靶蛋白的反應體系中，37°C孵育40分鐘后，同樣條件進行電化學檢測。
【文檔編號】G01N27/26GK105911289SQ201610225995
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月13日
【發明人】李根喜, 李超, 馬潔樺, 胡曉璐
【申請人】南京大學