一種測定胃蛋白酶原Ⅱ的試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種測定胃蛋白酶原Ⅱ的試劑盒及其制備方法，包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分：試劑R1：緩沖液、無機鹽、加速劑、防腐劑，試劑R2：緩沖液、穩定劑、防腐劑、膠乳包被抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗體，制備方法為：按照組分含量配制好試劑；將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應；用全自動生化分析儀測定反應后的吸光度差值；根據吸光度變化值計算出樣本中的胃蛋白酶原Ⅱ的濃度。本發明具有準確度高等優點。
【專利說明】
一種測定胃蛋白酶原n的試劑盒及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明涉及醫學及生物化學技術領域，具體來說是一種測定胃蛋白酶原n的試劑 盒及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 胃蛋白酶原由泌酸腺的主細胞合成，在胃腔內經鹽酸或已有活性的胃蛋白酶的作 用下變成胃蛋白酶，胃蛋白酶原是胃蛋白酶的前體，根據其生化性質和免疫原性將其分成2 個亞群，1-5組分的免疫原性相同，稱為胃蛋白酶原I，主要由胃底腺的主細胞和黏液頸細胞 分泌，組分6、7被稱為胃蛋白酶原n，除由胃底腺的主細胞和黏液頸細胞分泌外，賁門腺和 胃竇的幽門腺的黏液頸細胞以及十二指腸上段也能產生胃蛋白酶原n，因此血清中胃蛋白 酶原的含量可以反映胃黏膜腺體和細胞的數量，也間接反映了胃黏膜不同部位的分泌功 能，當胃黏膜發生病理變化時，血清胃蛋白酶原含量也隨之改變，被稱為胃黏膜的"血清學 活檢"。
[0003] 其中，胃是胃蛋白酶原n的唯一來源，因此胃蛋白酶原n可以反映胃黏膜狀態和 細胞數量的變化，胃蛋白酶原n與胃底黏膜病變的相關性較大，其升高與胃底腺管萎縮、胃 上皮化生或假幽門腺化生、異型增值有關。
[0004] 目前胃蛋白酶原的檢測方法普遍存在操作復雜以及測定準確度低的缺陷，需要進 行進一步的改進。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是為了克服現有技術操作復雜、測定準確度低的缺 陷，而提供一種測定胃蛋白酶原n的試劑盒及其制備方法。
[0006] 本發明解決上述技術問題提供的技術方案是:本發明公開了一種測定胃蛋白酶原 n的試劑盒，包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應含量為： 試劑R1: 緩沖液 20~180 mmol/L 無機鹽 10CK300 mmol/L 加速劑 10~60 g/L 防腐劑 0.5~1.5 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 10~60 mmol/L 穩定劑 15~45 g/L 防腐劑 0.5~1.5 g/L 膠乳包被抗人胃蛋白酶原II抗體 5~16 g/L 其溶劑為純化水。
[0007] 作為優選，本發明公開了 一種測定胃蛋白酶原n的試劑盒，包括彼此獨立的試劑 R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應含量為： 試劑R1: 緩沖液 100 mmol/L 無機鹽 200 mmol/L 加速劑 35 g/L 防腐劑 1.0 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 35 mmol/L 穩定劑 30 g/L 防腐劑 1.0 g/L 膠乳包被抗人胃蛋白酶原II抗體 10 g/L 其溶劑為純化水。
[0008] 作為優選，所述的試劑R1中，所述的緩沖液采用Tris緩沖液、MES緩沖液、磷酸鹽緩 沖液中的一種或多種的組合，所述的無機鹽采用氯化鈉、氯化鉀、硫酸鉀的一種或多種的組 合，所述的加速劑采用聚乙二醇-800、聚乙二醇-2000、聚乙二醇-4000、聚乙二醇-8000中的 一種或多種的組合，所述的防腐劑采用疊氮鈉。
[0009] 作為優選，所述的試劑R2中，所述的緩沖液采用Tris緩沖液、MES緩沖液、磷酸鹽緩 沖液中的一種或多種的組合，所述的穩定劑采用蔗糖、吐溫-20、吐溫-80、牛血清白蛋白中 的一種或多種的組合，所述的防腐劑采用疊氮鈉。
[0010] 作為優選，所述的試劑R2中，所述的膠乳包被抗人胃蛋白酶原n抗體的制備方法 為：用50 mmol/L的MES緩沖液將粒徑為80-500nm的聚苯乙烯微球稀釋成為所含的聚苯乙烯 微球的質量濃度為1%_5%的溶液，然后每毫升溶液中加入0.5mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙 基)碳化二亞胺鹽酸鹽，在20°C_37°C的條件下反應1小時，使用離心機，在25000 rpm/min轉 速下離心30分鐘，去上清，再將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，使用超聲分散儀進行 超聲分散，使用離心機，在25000 rpm/min轉速下離心30分鐘，去上清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散，然后邊攪拌邊加入等體積的含8 mg/mL抗人胃蛋白酶原 II抗體的MES緩沖液，混合攪拌，室溫反應2小時，使得聚苯乙烯微球最終質量濃度為0.5%-2.0%，最后加入牛血清白蛋白，使得牛血清白蛋白最終濃度達到20 g/L，在4°C的條件下封 閉8-12小時，即可制備得到膠乳包被抗人胃蛋白酶原n抗體。
[0011] 作為優選，本發明還公開了上述測定胃蛋白酶原n的試劑盒的制備方法和使用方 法，包括以下步驟： (a)按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: 緩沖液 20~180 mmol/L 無機鹽 100~300 mmol/L 加速劑 10~60 g/L 防腐劑 0.5~1.5 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 10~60 mmol/L 穩定劑 15~45 g/L 防腐劑 0.5~1.5 g/L 膠乳包被抗人胃蛋白酶原II抗體 5~16 g/L 其溶劑為純化水； (b) 將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應； (c) 用全自動生化分析儀測定反應后的吸光度差值； (d) 根據吸光度變化值計算出樣本中的胃蛋白酶原n的濃度。
[0012]作為優選，步驟(b)中，所述的試劑R1和試劑R2的體積比為5:1。
[0013]作為優選，步驟(b)中，所述的待測樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1: 10到1:50之間。
[0014]本發明的檢測原理是:本發明利用抗原抗體反應，先加入試劑R1，使血清中的胃蛋 白酶原n的位點暴漏，當加入膠乳包被抗人胃蛋白酶原n抗體，使溶液中的抗原抗體反應 形成不溶于溶液的抗原抗體復合物，從而產生一定的濁度，在人血清中胃蛋白酶原n含量 在一定范圍內與形成的池度成正比，通過測定特定波長的吸光度值，根據校準曲線計算出 血清中胃蛋白酶原n的含量。
[0015] 樣本中胃蛋白酶原n(PG-n)的活性i
式中：A At以空白管吸光度作對照的樣品管吸光度值 A AS以空白管吸光度作對照的校準管吸光度值 cs校準液中PG-n的濃度。
[0016] 與現有技術相比，本發明具有以下有益優點：本發明通過在試劑R1和試劑R2中均 添加了穩定劑，增加了膠乳包被抗人胃蛋白酶原n抗體的懸浮穩定性，因此檢測的準確性 也就大大的提高了，另外操作也比較方便。
【具體實施方式】
[0017] 以下結合具體實施例進一步說明，但本發明并不僅限于這些實施例。
[0018] 實施例1 本發明的試劑盒包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: MES緩沖液 100 mmol/L 硫酸鉀 200 mmol/L 聚乙二醇-2000 35 g/L 疊氮鈉 1.0 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: MES 緩沖液 35mmol/L 鹿糖 30 g/L 疊氮鈉 1.0 g/L 膠乳包被抗人胃蛋白酶原n抗體 10 g/L 其溶劑為純化水。
[0019] 實施例2 本發明的試劑盒包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: Tris緩沖液 180 mmol/L 氯化鈉 105 mmol/L 聚乙二醇-4000 20 g/L 疊氮鈉 1.5 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 10 mmol/L 吐溫-20 45 g/L 疊氮鈉 1.5 g/L 膠乳包被抗人胃蛋白酶原II抗體 16 g/L 其溶劑為純化水。 實施例3 試劑盒的制備和使用方法 1、 膠乳包被抗人胃蛋白酶原n抗體的制備：用50 mmol/L的MES緩沖液將粒徑為120nm 的聚苯乙烯微球稀釋成為所含的聚苯乙烯微球的質量濃度為4%的溶液，然后每毫升溶液中 加入0.5mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，在28°C的條件下反應1小時， 使用離心機，在25000 rpm/min轉速下離心30分鐘，去上清，再將沉淀懸浮于50 mmol/L的 MES緩沖液中，使用超聲分散儀進行超聲分散，使用離心機，在25000 rpm/min轉速下離心30 分鐘，去上清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散，然后邊攪拌邊加入等體 積的含8 mg/mL抗人胃蛋白酶原II抗體的MES緩沖液，混合攪拌，室溫反應2小時，使得聚苯 乙烯微球最終質量濃度為1.0%，最后加入牛血清白蛋白，使得牛血清白蛋白最終濃度達到 20 g/L，在4°C的條件下封閉10小時，即可制備得到膠乳包被抗人胃蛋白酶原n抗體； 2、 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: MES緩沖液 100 mmol/L 硫酸鉀 200 mmol/L 聚乙二醇-2000 35 g/L 疊氮鈉 1.0 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: MES緩沖液 35 mmol/L 鹿糖 30 g/L 疊氮鈉 1.0 g/L 膠乳包被抗人胃蛋白酶原n抗體 1〇 g/L 其溶劑為純化水； 3、 全自動生化分析儀參數設置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長:主波長700nm; (c) 反應時間：10min，其中，孵育時間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化AA = A2-A1 ; (d) 反應方向：正反應； 4、 檢測步驟 (a) 取200yl試劑R1與7yl待測樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min;
(c) 加入40yl試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化 A A=A2-A1 ； (d) 根據樣本中胃蛋白酶原n (PG-n)的活性 計算出樣 本中的胃蛋白酶原n的濃度。
[0020] 實施例4 試劑盒的制備和使用方法 1、 膠乳包被抗人胃蛋白酶原II抗體的制備：用50 mmol/L的MES緩沖液將粒徑為120nm 的聚苯乙烯微球稀釋成為所含的聚苯乙烯微球的質量濃度為4%的溶液，然后每毫升溶液中 加入0.5mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，在28°C的條件下反應1小時， 使用離心機，在25000 rpm/min轉速下離心30分鐘，去上清，再將沉淀懸浮于50 mmol/L的 MES緩沖液中，使用超聲分散儀進行超聲分散，使用離心機，在25000 rpm/min轉速下離心30 分鐘，去上清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散，然后邊攪拌邊加入等體 積的含8 mg/mL抗人胃蛋白酶原II抗體的MES緩沖液，混合攪拌，室溫反應2小時，使得聚苯 乙烯微球最終質量濃度為1.0%，最后加入牛血清白蛋白，使得牛血清白蛋白最終濃度達到 20 g/L，在4°C的條件下封閉10小時，即可制備得到膠乳包被抗人胃蛋白酶原n抗體； 2、 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: Tris緩沖液 180 mmol/L 氯化鈉 105 mmol/L 聚乙二醇-4000 20 g/L 疊氮鈉 1.5 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris 緩沖液 10mmol/L 吐溫-20 45 g/L 疊氮鈉 1.5 g/L 膠乳包被抗人胃蛋白酶原n抗體 16 g/L 其溶劑為純化水； 3、 全自動生化分析儀參數設置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長:主波長700nm; (c) 反應時間：10min，其中，孵育時間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化AA = A2-A1 ; (d) 反應方向：正反應； 4、 檢測步驟 (a) 取200yl試劑R1與7yl待測樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min;
(c) 加入40yl試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化 AA = A2-A1; (d) 根據樣本中胃蛋白酶原n(PG-n)的活性 計算出樣本中 的胃蛋白酶原n的濃度。
[0021] 表1為實施例1所制得的測定胃蛋白酶原n的試劑盒以及實施例2所制得的測定胃 蛋白酶原n的試劑盒分別對質控品1進行測定的結果，其中質控品1中的胃蛋白酶原n的濃 度為10.0 ng/mL，測定結果見表1:
由表1可知，本發明所制得的測定胃蛋白酶原n的試劑盒對質控品1的測定結果偏差較 小，因此測定準確度高，而且實施例1為最優的選擇。
[0022] 表2為實施例1所制得的測定胃蛋白酶原n的試劑盒以及實施例2所制得的測定胃蛋白 酶原n的試劑盒分別對質控品2進行測定的結果，其中質控品2中的胃蛋白酶原n的濃度為 40.0 ng/mL，測定結果見表2:
由表2可知，本發明所制得的測定胃蛋白酶原n的試劑盒對質控品2的測定結果偏差較 小，因此測定準確度高，而且實施例1為最優的選擇。
[0023]表3為實施例3所制得的測定胃蛋白酶原II的試劑盒對同一待測樣本進行的多次 反復測定以及實施例4所制得的測定胃蛋白酶原n的試劑盒對同一待測樣本進行的多次反 復測定，對所得的結果進行SD和CV的計算，結果如下： 表3
由表3可知本發明所制得的測定胃蛋白酶原n的試劑盒的精密度比較好，而且由表3可 知，實施例3為最優的選擇。
[0024]上述實施例僅例示性說明本發明的原理及其功效，而非用于限制本發明。任何熟 悉此技術的人士皆可在不違背本發明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術領域中具有通常知識者在未脫離本發明所揭示的精神與技術思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應由本發明的權利要求所涵蓋。
【主權項】
1. 一種測定胃蛋白酶原Π 的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨立的試劑Rl和試劑R2雙 液體組分，包括的成分及相應含量為： 試劑Rl: 緩沖液 20~180 mmol/L 無機鹽 100~300 mmol/L 加速劑 10~60 g/L 防腐劑 0.5~1.5 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 10~60 mmol/L 穩定劑 15~45 g/L 防腐劑 0.5~1.5 g/L 膠乳包被抗人胃蛋白酶原Π 抗體 5~16 g/L 其溶劑為純化水。2. 根據權利要求1所述的一種測定胃蛋白酶原Π 的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨立 的試劑Rl和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應含量為： 試劑Rl: 緩沖液 100 mmol/L 無機鹽 200 mmol/L 加速劑 35 g/L 防腐劑 1.0 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 35 mmol/L 穩定劑 30 g/L 防腐劑 1.0 g/L 膠乳包被抗人胃蛋白酶原Π 抗體 10 g/L 其溶劑為純化水。3. 根據權利要求1或2所述的一種測定胃蛋白酶原Π 的試劑盒，其特征在于:所述的試 劑Rl中，所述的緩沖液采用Tris緩沖液、MES緩沖液、磷酸鹽緩沖液中的一種或多種的組合， 所述的無機鹽采用氯化鈉、氯化鉀、硫酸鉀的一種或多種的組合，所述的加速劑采用聚乙二 醇-800、聚乙二醇-2000、聚乙二醇-4000、聚乙二醇-8000中的一種或多種的組合，所述的防 腐劑采用疊氮鈉。4. 根據權利要求1或2所述的一種測定胃蛋白酶原Π 的試劑盒，其特征在于:所述的試 劑R2中，所述的緩沖液采用Tris緩沖液、MES緩沖液、磷酸鹽緩沖液中的一種或多種的組合， 所述的穩定劑采用蔗糖、吐溫-20、吐溫-80、牛血清白蛋白中的一種或多種的組合，所述的 防腐劑采用疊氮鈉。5. 根據權利要求1或2所述的一種測定胃蛋白酶原Π 的試劑盒，其特征在于:所述的試 劑R2中，所述的膠乳包被抗人胃蛋白酶原Π 抗體的制備方法為：用50 mmol/L的MES緩沖液 將粒徑為80-500nm的聚苯乙烯微球稀釋成為所含的聚苯乙烯微球的質量濃度為1%-5%的溶 液，然后每毫升溶液中加入〇.5mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，在20 °C_37°C的條件下反應1小時，使用離心機，在25000 rpm/min轉速下離心30分鐘，去上清，再 將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，使用超聲分散儀進行超聲分散，使用離心機，在 25000 rpm/min轉速下離心30分鐘，去上清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲 分散，然后邊攪拌邊加入等體積的含8 mg/mL抗人胃蛋白酶原Π 抗體的MES緩沖液，混合攪 拌，室溫反應2小時，使得聚苯乙烯微球最終質量濃度百分比為0.5%-2.0%，最后加入牛血清 白蛋白，使得牛血清白蛋白最終濃度達到20 g/L，在4°C的條件下封閉8-12小時，即可制備 得到膠乳包被抗人胃蛋白酶原Π 抗體。6. 根據權利要求1或2所述的一種測定胃蛋白酶原Π 的試劑盒的制備方法和使用方法， 其特征在于:包括以下步驟： (a) 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑Rl: 緩沖液 20~180 mmol/L 無機鹽 100~300 mmol/L 加速劑 10~60 g/L 防腐劑 0.5~1.5 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 10~60 mmol/L 穩定劑 15~45 g/L 防腐劑 0.5~1.5 g/L 膠乳包被抗人胃蛋白酶原Π 抗體 5~16 g/L 其溶劑為純化水； (b) 將待測樣本與試劑Rl和試劑R2混合，使其充分反應； (c) 用全自動生化分析儀測定反應后的吸光度差值； (d) 根據吸光度變化值計算出樣本中的胃蛋白酶原Π 的濃度。7. 根據權利要求6所述的一種測定胃蛋白酶原Π 的試劑盒的制備方法和使用方法，其 特征在于:步驟(b)中，所述的試劑Rl和試劑R2的體積比為5:1。8. 根據權利要求6所述的一種測定胃蛋白酶原Π 的試劑盒的制備方法和使用方法，其 特征在于:步驟(b)中，所述的待測樣本與試劑Rl和試劑R2的總體積的體積比在1:10到1:50 之間。
【文檔編號】G01N33/573GK105911279SQ201610358109
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月26日
【發明人】蔡曉輝, 莊慶華, 吳錚, 徐運
【申請人】安徽伊普諾康生物技術股份有限公司