一種動物疫病抗體類病毒膠體金定量檢測系統及制備方法

一種動物疫病抗體類病毒膠體金定量檢測系統及制備方法
【專利摘要】本發明屬于生物檢測領域，尤其涉及一種動物疫病抗體類病毒膠體金定量檢測系統及制備方法，包括卡盒和試劑條，試劑條由基板、樣品墊、膠體金墊、反應膜和吸水墊組成，其特征在于：膠體金墊上吸附有膠體金標記的豬病毒蛋白和牛血清白蛋白，反應膜上包被有檢測抗原和質量控制抗體，檢測抗原顯示為檢測線T，為豬病毒抗原；質量控制抗體顯示為質控線C，為羊抗鼠IgG抗體。本發明充分應用了膠體金的操作簡便、快速、實用于各種現場檢測的技術優點，配套膠體金定量分析儀和特有的曲線建立方法，達到了膠體金能定量檢測出樣品的含量，綜合了膠體金和ELISA的雙重優點，形成兩種技術的互補。
【專利說明】
一種動物疫病抗體類病毒膠體金定量檢測系統及制備方法
技術領域
[0001 ]本發明屬于生物檢測領域，尤其涉及一種動物疫病抗體類病毒膠體金定量檢測系 統及制備方法。
【背景技術】
[0002] 中國是農業大國，也是畜牧大國。以豬養殖為例，2009年全國性豬存欄約4.7億頭， 出欄6.45億頭，豬肉產量4889萬噸，約占全球總產量的50%，在世界上排名第一。但中國并 不是畜牧強國，在每頭母豬年平均分娩胎數、每頭母豬提從斷奶仔豬數、仔豬存活率及肉豬 出欄率等方面，與世界畜牧強國仍然存在巨大的差距。其原因之一在于集約化養殖程度不 高，規模不夠，農戶散養或小型化養殖場所占比重高，造成疫病多發，生產力低下，添加違禁 藥物和濫用抗生素現像嚴重，且環境污染嚴重。
[0003] 由于中國養殖業比重較大的是農戶散養或者小型養殖場養殖，規模分散，動物疫 病防治水平和生產管理能力落后，在發生疫病流行時，難以有效控制。存在著獸醫領域監管 對像種類多、數量大、分布廣、規模不一等問題，尤其養殖環節中具有極強的隱蔽性和時間 性的特點，現場執法檢查如果靠眼面檢查從根本上不能積習難改現其問題和隱患。傳統實 驗檢測也存在程序復雜、檢測時間長的技術問題，檢測結果出來后產品已經銷售或轉移，無 法及時處理，無法滿足現場檢測需要及時、高效、快速的需要。而且，目前成熟的快速檢測技 術大多是針對單一疫病或者藥物殘留進行，也難以達到對檢測樣品種類多樣、檢測項目繁 多的檢測的目的。
[0004] 隨著生物技術的發展，開始用生物技術來對動物疫病、動物產品質量進行安全檢 測。比如PCR檢測法、酶聯免疫法(ELI SA)和操作比較簡單的動物疫病免疫層析檢測方法， PCR檢測法常用于核酸方面的檢測，敏感度好且準確性相對較高，酶聯免疫法常用于檢測獸 藥殘留及動物疫病，具有特異性和靈敏度比較高的優點，對于現場初篩有較好的應用前景， 但這兩者都需要專業的儀器設備和操作人員進行檢驗操作，對試驗條件要求較高，施行不 方便，成本高。
[0005]目前應用比較成熟的現場快速檢測方法還有免疫膠體金試紙檢測方法，膠體金技 術具有方便快捷、特異敏感、穩定性強、不需要特殊設備和試劑、結果判斷直觀等優勢，適合 于大批量檢測和大面積普查等。
[0006] 膠體金(colloidal gold)，又稱金溶膠(gold solution)，是指分散相粒子直徑在 1一150nm之間的金溶膠，屬于多相不均勻體系，顏色呈桔紅色到紫紅色。膠體金可以作為標 記物用于免疫組織化學，近10多年來膠體金標記已經發展為一項重要的免疫標記技術。膠 體金免疫分析在藥物檢測、生物醫學等許多領域的研究已經得到發展，并越來越受到相關 研究領域的重視。膠體金作為標記物用于免疫組織化學始于1971年，Faulk等應用電鏡免疫 膠體金染色法(IGS)觀察沙門氏菌，此后他們把膠體金與多種蛋白質結合.1974年Romano等 將膠體金標記在第二抗體(馬抗人IgG)上，建立了間接免疫膠體金染色法。1978年geoghega 發現了膠體金標記物在光鏡水平的應用。膠體金在免疫化學中的這種應用，又被稱為免疫 金.之后，許多學者進一步證實膠體金能穩定又迅速地吸附蛋白質，而蛋白質的生物活性無 明顯改變.它可以作為探針進行細胞表面和細胞內多糖、蛋白質、多膚、抗原、激素、核酸等 生物大分子的精確定位，也可以用于日常的免疫診斷，進行免疫組織化學定位，因而在臨床 診斷及藥物檢測等方面的應用已受到廣泛的重視。
[0007] 具有高效、快速、結果判斷直觀和穩定的檢測動物疫病抗體類病毒的方法和相關 的產品是目前市場所需。
【具體實施方式】
[0008]
[0009] 為了解決上述技術問題，本發明提供一種動物疫病抗體類病毒膠體金定量檢測系 統及制備方法，其特點是充分應用了膠體金的操作簡便、快速、實用于各種現場檢測的技術 優點，配套膠體金定量分析儀和特有的曲線建立方法，達到了膠體金能定量檢測出樣品的 含量，綜合了膠體金和ELISA的雙重優點，形成兩種技術的互補。
[0010] 解決以上技術問題的本發明中的一種動物疫病抗體類病毒膠體金定量檢測系統， 包括膠體金定量檢測盒和手持式讀卡儀器，其特征在于:所述檢測系統能夠對待檢測的動 物樣品給出準確的定量檢測結果，該動物疫病可包括豬瘟、豬圓環、豬偽狂犬、豬口蹄疫、豬 藍耳。所述待檢測的動物樣品為血清或全血;檢測步驟為取50-150ul的動物樣品加入到檢 測卡中，反應5-20分鐘后放入手持式讀卡儀進行T/C值讀數，根據不同濃度的比值運用函數 擬合建立標準曲線。
[0011] 所述定量檢測結果為根據手持式讀卡儀測出的T/C值和抗體效價梯度值成相應的 函數關系，該函數關系式按照對數函數進行擬合曲線，從而制定每批產品的內標曲線而得 出定量檢測結果;該手持式讀卡儀器為通過成像系統測量C/T線的反射光強度，并通過隨機 芯片將檢測結果通過無限網絡傳輸到中央系統或云端服務器;該手持式讀卡儀器包括智能 手機、塑料模具、鏡片、玻璃板、9V電池、LED燈帶、抽屜式托盤。
[0012] 所述函數關系式為:y = aln(x)-b，其中y代表T/C值，x代表濃度，a代表斜率，b代表 常數。
[0013] 所述每個批次的產品的內標準曲線可以相應調整，這樣減少了不同批次產品間定 量分析關系的差別，確保不同批次產品對同一待測物定量檢測關系的一致性，并將內標曲 線輸入軟件制成二維碼方便客戶操作使用。
[0014] 所述檢測盒，包括卡盒和試劑條，試劑條由基板、樣品墊、膠體金墊、反應膜和吸水 墊組成，膠體金墊上吸附有膠體金標記的豬病毒蛋白和牛血清白蛋白，反應膜上包被有檢 測抗原和質量控制抗體，檢測抗原顯示為檢測線T，為豬病毒抗原；質量控制抗體顯示為質 控線C，為羊抗鼠IgG抗體。
[0015] 檢測線T與質控線C距離可為5-10mm，間距太長了會增長檢測時間，且對檢測卡殼 的視窗要求就更長。T線中豬病毒抗原質量濃度可為0.5-3mg/ml，T線濃度過低，對后面顯色 效果不理想，過高了會降低檢測條的靈敏度，所以T線的濃度是需要在實驗研發中選擇一個 合適濃度，進而達到市場產品的質量要求。
[0016]所述試劑條制備方法包括以下步驟，所用原料用量份數為重量份：
[0017] (1)膠體金溶液的制備：
[0018] 將500份蒸餾水加熱至沸騰后，再加入氯金酸1-5份和檸檬酸三鈉1-5份，攪拌并煮 沸8-12min，冷卻至常溫，用可見光分光光度計檢測其峰值及半峰寬；原料在使用前經過純 化，純度達到97%以上，特異性強，無非特異性結合。
[0019] 膠體金溶液質量標準:清亮透明的橘紅色或紫紅色，無懸浮顆粒、液體表面無飄金 情況，用紫外檢測波峰應該越陡峭半峰寬越窄，膠體金的質量越好。
[0020] (2)膠體金的標記及噴金：
[0021] 取100份膠體金溶液，加入1.38%的碳酸鉀緩沖液8-12份，攪拌中加入豬病毒蛋白 0.015-0.025份繼續攪拌8-12min，再加入牛血清白蛋白10-20份進行偶聯，10000r/min離心 4-7min，去掉上清，留下膠體金顆粒溶液進行噴金使用;一般膠體金在進行標記前都會進行 方正梯度實驗，既對膠體金的標記條件和標記量進行梯度實驗，在最佳的PH值和標記量的 條件下進行標記和封閉。
[0022]用噴金劃膜機在玻璃纖維素膜上噴金，用量2.5-8.5111/(^，再在溫度35-38°(：下干 燥10-14h，密封保存備用；
[0023] (3)硝酸纖維素膜的C/T畫線：
[0024]用DC緩沖液將羊抗鼠IgG稀釋成0.5-3mg/ml的羊抗鼠IgG溶液，在PVC底板上貼好 硝酸纖維素膜，中間用羊抗鼠IgG畫C線，用量0.5-3ul/cm;
[0025] DC緩沖液配方為：0.8g NaCl+0.05g KCl+0.144gNa2HP04+0.067g NaH2P04,用蒸 餾水定容到l〇〇ml。
[0026]用DT緩沖液將豬病毒蛋白稀釋成0.5-3mg/ml，在PVC底板上貼好硝酸纖維素膜C線 往下5-10_處用稀釋后的豬病毒蛋白畫T線，用量0.5-3ul/cm;原料豬病毒抗原質量濃度要 達到 lmg/ml。
[0027] DT緩沖液配方為：0.8g NaCl+0.15g KCl+0.288gNa2HP04+0.134g NaH2P04,用蒸 餾水定容到l〇〇ml，再加入5 %體積的海藻糖。
[0028] 將畫好線的PVC底板在溫度35-38°C下干燥8-12h，密封保存備用；
[0029] (4)膠體金大板的制作：
[0030]在步驟（3)中的PVC底板上貼上噴好金的玻璃纖維塑模，貼上樣品墊及吸水紙即 可。
[0031 ] 所述步驟(2)中膠體金顆粒大小為15-60nm，優化顆粒大小為20-40nm，膠體金顆粒 溶液質量濃度為〇. 8-1.2%，優化濃度為1 %。
[0032]所述樣品墊使用前進行處理，用定量的DY緩沖液進行均勻涂抹，其中，100ml的D Y 緩沖液配方為：10%tw20+表面活性劑5-15% + l%PEG20000+10%海藻糖，用蒸餾水定容到 100ml。表面活性劑可為 TritonX-100、Tween-20、Tween-80 等。
[0033] 樣品墊處理步驟:將進口的Alhstorm8964裁切成2cm*30cm，用定量的DY緩沖液進 行均勻涂抹，保證樣品墊的均一性。
[0034]所述膠體金溶液PH值為6.2-7.8，原料的等電點ph值加0.5為最適PH標記點。
[0035]所述步驟(2)中豬病毒蛋白質量體積濃度為3-4mg/ml，牛血清白蛋白質量濃度10-15%〇
[0036]本發明中的試劑盒基于膠體金雙抗夾心技術，檢測卡的硝酸纖維膜上預先包被了 豬病毒抗原(T線)和羊抗鼠IgG抗體(C線）。其中T線為檢測線，C線為質控線。金標抗原特異 性結合豬病毒抗體，T線顯色深度隨豬病毒抗體濃度呈線性改變，通過手持檢測儀的分析即 可測出樣本中豬病毒抗體效價高低。
[0037]本發明中的試劑盒檢測時間快、方便、穩定、且準確，適合范圍廣。不即只顯色，還 可以定量測定，可測定出具體的數值，檢測結果準確，易把握，誤差少，減少人為評估帶來的 偏差。
【附圖說明】
[0038] 圖1為本發明中豬瘟病毒抗體檢測血清曲線圖
[0039] 圖2為本發明中豬圓環病毒抗體檢測血清曲線圖
[0040] 圖3為本發明中豬藍耳病毒抗體檢測血清曲線圖
【具體實施方式】
[0041] 以下用具體實施例對本發明作進一步的說明：
[0042] 以下實施例中待檢測的動物樣品為血清或全血;檢測步驟為取50-150ul的動物樣 品加入到檢測卡中，反應5-20分鐘后放入手持式讀卡儀進行T/C值讀數，根據不同濃度的比 值運用函數擬合建立標準曲線。
[0043] 定量檢測結果為根據手持式讀卡儀測出的T/C值和抗體效價梯度值成相應的函數 關系，該函數關系式按照對數函數進行擬合曲線，從而制定每批產品的內標曲線而得出定 量檢測結果;該手持式讀卡儀器為通過成像系統測量C/T線的反射光強度，并通過隨機芯片 將檢測結果通過無限網絡傳輸到中央系統或云端服務器;該手持式讀卡儀器包括智能手 機、塑料模具、鏡片、玻璃板、9V電池、LED燈帶、抽屜式托盤。
[0044] 每個批次的產品的內標準曲線可以相應調整，這樣減少了不同批次產品間定量分 析關系的差別，確保不同批次產品對同一待測物定量檢測關系的一致性，并將內標曲線輸 入軟件制成二維碼方便客戶操作使用。
[0045] 實施例1
[0046] 動物疫病抗體類病毒膠體金定量檢測系統:豬瘟病毒抗體膠體金定量檢測試劑系 統，設有膠體金定量檢測盒和手持式讀卡儀器，對待檢測的動物樣品給出準確的定量檢測 結果。定量檢測結果為根據手持式讀卡儀測出的T/C值和抗體效價梯度值成相應的函數關 系，函數關系式為:y = aln(x)-b。
[0047] 該函數關系式按照對數函數進行擬合曲線，從而制定每批產品的內標曲線而得出 定量檢測結果。
[0048] 豬瘟病毒抗體膠體金定量檢測試劑盒，包括卡盒和試劑條，試劑條由基板、樣品 墊、膠體金墊、反應膜和吸水墊組成，膠體金墊上吸附有膠體金標記的豬瘟病毒蛋白和牛血 清白蛋白，反應膜上包被有檢測抗原和質量控制抗體，檢測抗原顯示為檢測線T，為豬瘟病 毒抗原;質量控制抗體顯示為質控線C，為羊抗鼠IgG抗體。
[0049] 檢測線T與質控線C一般控制在5mm，間距太長了會增長檢測時間，且多檢測卡殼的 視窗要求就更長。T線中豬病毒抗原質量濃度為0.3mg/ml。
[0050] 試劑條制備方法包括以下步驟，所用原料用量份數為重量份：
[00511 (1)膠體金的制備：
[0052]將500份蒸餾水加熱至沸騰后，再加入氯金酸1份和檸檬酸三鈉1份，攪拌并煮沸 lOmin，冷卻至常溫，用可見光分光光度計檢測其峰值及半峰寬，峰值229-231，半峰寬580-585〇
[0053] 原料在使用前經過純化，通過儀器檢測其純度達到97%以上，特異性強，無非特異 性結合。膠體金液質量標準:清亮透明的橘紅色或紫紅色，無懸浮顆粒、液體表面無飄金情 況，用紫外檢測波峰應該越陡峭半峰寬越窄，膠體金的質量越好。
[0054] 膠體金溶液PH值為6.2，膠體金顆粒大小為30nm，膠體金濃度為0.8%。
[0055] (2)膠體金的標記及噴金：
[0056]取100份膠體金溶液，加入1.38%的碳酸鉀緩沖液8份，攪拌中再加入3mg/ml豬病 毒蛋白0.015份繼續攪拌8min，再加入15%牛血清白蛋白15份進行偶聯，10000r/min離心 7min，去掉上清，留下清金顆粒溶液進行噴金使用；
[0057]用噴金劃膜機在玻璃纖維素膜(GE公司進口的Acuuflow G)上噴金，用量2.5ul/ cm，蛋白濃度為4ug/ml，再在溫度35 °C下干燥14h，密封保存備用；
[0058]豬瘟病毒原料通過儀器檢測其純度達到97%以上，特異性強，沒有非特異性吸附； 蛋白在使用前，一般都需要進行純化或電泳，保證其純度和蛋白含量。
[0059] (3)硝酸纖維素膜的C/T畫線：
[0060]用DC緩沖液將羊抗鼠IgG稀釋成0.5mg/ml的羊抗鼠IgG溶液，在PVC底板上貼好硝 酸纖維素膜，中間用羊抗鼠IgG畫C線，用量0.5ul/cm;
[0061 ] DC緩沖液配方為：0.8g NaCl+0.05g KCl+0.144gNa2HP04+0.067g NaH2P04,用蒸 餾水定容到l〇〇ml。
[0062]用DT緩沖液將豬瘟病毒抗原稀釋成0.5mg/ml，在PVC底板上貼好硝酸纖維素膜C線 下端5mm處用稀釋后的豬瘟病毒蛋白畫T線，用量lul/cm;原料豬瘟病毒抗原質量濃度要達 至丨Jlmg/ml〇
[0063] DT緩沖液配方為：0.8g NaCl+0.15g KCl+0.288gNa2HP04+0.134g NaH2P04,用蒸 餾水定容到l〇〇ml，再加入5 %體積的海藻糖。
[0064] 將畫好線的PVC底板在溫度37°C下干燥12h，密封保存備用；
[0065] (4)膠體金大板的制作：
[0066]在步驟（3)中的PVC底板上貼上噴好金的玻璃纖維塑模，貼上樣品墊及吸水紙即 可。玻璃纖維素膜在貼的過程中要疊加硝酸纖維素膜貼樣品墊按照樣品墊下端與 PVC底端邊緣對齊，貼吸水紙時必須與硝酸纖維素膜上端疊加l-2mm即可。粘貼過程中一定 要注意別再硝酸纖維素膜上留下痕跡，粘貼地方一定要牢固，疊加部分一定要相互接觸，不 能彼此脫離。
[0067]樣品墊使用前進行處理：用定量的DY緩沖液將裁切好的樣品墊進行均勻涂抹，可 以用移液器、玻璃棒進行涂抹，或者直接用濕侵法，使其樣品墊均勻涂抹。其中，l〇〇ml的D Y 緩沖液配方為：10%丨￥20+了￥6611-20 15% + 1%?￡620000+10%海藻糖，用蒸餾水定容到 100ml〇
[0068] 樣品墊處理步驟:將進口的Alhstorm8964裁切成2cm*30cm，用定量的DY緩沖液進 行均勻涂抹，保證樣品墊的均一性。
[0069]實施例2豬圓環病毒抗體膠體金定量檢測試劑系統
[0070]其它內容如實施例1中，豬圓環病毒抗體定量檢測試劑系統，設有膠體金定量檢測 盒和手持式讀卡儀器，對待檢測的動物樣品給出準確的定量檢測結果。定量檢測結果為根 據手持式讀卡儀測出的T/C值和抗體效價梯度值成相應的函數關系，函數關系式為:y = aln (x)-b〇
[0071]該函數關系式按照對數函數進行擬合曲線，從而制定每批產品的內標曲線而得出 定量檢測結果。
[0072]豬圓環病毒抗體膠體金定量檢測試劑盒，包括卡盒和試劑條，試劑條由基板、樣品 墊、膠體金墊、反應膜和吸水墊組成，膠體金墊上吸附有膠體金標記的豬圓環病毒和牛血清 白蛋白，反應膜上包被有檢測抗原和質量控制抗體，檢測抗原顯示為檢測線T，為豬圓環病 毒抗原;質量控制抗體顯示為質控線C，為羊抗鼠IgG抗體。
[0073]檢測線T與質控線C一般控制在5mm，間距太長了會增長檢測時間，且多檢測卡殼的 視窗要求就更長。
[0074] T線中豬圓環病毒抗原質量濃度為3ug/ml。
[0075] 試劑條制備方法包括以下步驟，所用原料用量份數為重量份：
[0076] (1)膠體金的制備：
[0077]將500份蒸餾水加熱至沸騰后，再加入氯金酸5份和檸檬酸三鈉5份，攪拌并煮沸 lOmin，冷卻至常溫，用可見光分光光度計檢測其峰值及半峰寬；
[0078] 膠體金溶液PH值為7.3，膠體金顆粒大小為40nm，膠體金濃度為1.2%。
[0079] (2)膠體金的標記及噴金：
[0080] 取100份膠體金溶液，加入1.38%的碳酸鉀緩沖液12份，攪拌中再加入3.5mg/ml豬 病毒蛋白〇. 025份繼續攪拌8min，再加入10 %牛血清白蛋白20份進行偶聯，10000r/min離心 4min，去掉上清，留下清膠體金顆粒溶液進行噴金使用；
[0081]用噴金劃膜機在玻璃纖維素膜(GE公司進口的Acuuflow G)上噴金，用量4.5ul/ cm，蛋白濃度為6ug/ml，再在溫度37 °C下干燥10h，密封保存備用；
[0082] (3)硝酸纖維素膜的C/T畫線：
[0083]用DC緩沖液將羊抗鼠IgG稀釋成3mg/ml的羊抗鼠IgG溶液，在PVC底板上貼好硝酸 纖維素膜，中間用羊抗鼠IgG畫C線，用量3ul/cm;
[0084] DC緩沖液配方為：0.8g NaCl+0.05g KCl+0.144gNa2HP04+0.067g NaH2P04,用蒸 餾水定容到l〇〇ml。
[0085]用DT緩沖液將豬病毒蛋白稀釋成3mg/ml，在PVC底板上貼好硝酸纖維素膜C線往下 用稀釋后的豬病毒蛋白畫T線，用量8ul/cm;
[0086] DT緩沖液配方為：0.8g NaCl+0.15g KCl+0.288gNa2HP04+0.134g NaH2P04,用蒸 餾水定容到l〇〇ml，再加入5 %體積的海藻糖。
[0087]將畫好線的PVC底板在溫度37 °C下干燥8h，密封保存備用；
[0088] (4)膠體金大板的制作：
[0089] 在步驟（3)中的PVC底板上貼上噴好金的玻璃纖維塑模，貼上樣品墊及吸水紙即 可。
[0090] 樣品墊使用前進行處理：用定量的DY緩沖液將裁切好的樣品墊進行均勻涂抹，可 以用移液器、玻璃棒進行涂抹，或者直接用濕侵法，使其樣品墊均勻涂抹。其中，l〇〇ml的D Y 緩沖液配方為：10 % tw20+Tween-80 5 % + 1 % roG20000 + 10 %海藻糖，用蒸餾水定容到 100ml〇
[0091] 實施例3豬藍耳病毒抗體膠體金定量檢測系統
[0092] 其它內容如實施例1中，豬圓環病毒膠體金抗體定量檢測試劑系統，設有膠體金定 量檢測盒和手持式讀卡儀器，對待檢測的動物樣品給出準確的定量檢測結果。定量檢測結 果為根據手持式讀卡儀測出的T/C值和抗體效價梯度值成相應的函數關系，函數關系式為： y = aln(x)_b〇
[0093] 該函數關系式按照對數函數進行擬合曲線，從而制定每批產品的內標曲線而得出 定量檢測結果。
[0094] 豬藍耳病毒抗體膠體金定量檢測試劑盒，包括卡盒和試劑條，試劑條由基板、樣品 墊、膠體金墊、反應膜和吸水墊組成，膠體金墊上吸附有膠體金標記的豬病毒蛋白和牛血清 白蛋白，反應膜上包被有檢測抗原和質量控制抗體，檢測抗原顯示為檢測線T，為豬藍耳病 毒抗原;質量控制抗體顯示為質控線C，為羊抗鼠IgG抗體。
[0095] 檢測線T與質控線C一般控制在8mm，間距太長了會增長檢測時間，且多檢測卡殼的 視窗要求就更長。
[0096] T線中豬藍耳病毒抗原質量濃度為0.6mg/ml，牛血清白蛋白質量濃度為。
[0097] 試劑條制備方法包括以下步驟，所用原料用量份數為重量份：
[0098] (1)膠體金的制備：
[0099]將500份蒸餾水加熱至沸騰后，再加入氯金酸5份和檸檬酸三鈉3份，攪拌并煮沸 lOmin，冷卻至常溫，用可見光分光光度計檢測其峰值及半峰寬；
[0100] 膠體金溶液PH值為7，原料的等電點ph值加0.5。膠體金顆粒大小為40nm，膠體金濃 度為1%。
[0101] (2)膠體金的標記及噴金：
[0102] 取100份膠體金溶液，加入1.38%的碳酸鉀緩沖液9份，攪拌中加入3.8mg/ml豬病 毒蛋白0.022份繼續攪拌10111；[11，再加入12%牛血清白蛋白10份進行偶聯，1000017 /1]1；[11離心 6min，去掉上清，留下清金顆粒溶液進行噴金使用；
[0103] 用噴金劃膜機在玻璃纖維素膜(GE公司進口的Acuuflow G)上噴金，用量3.2ul/ cm，蛋白濃度為8ug/ml，再在溫度36 °C下干燥13h，密封保存備用；
[0104] (3)硝酸纖維素膜的C/T畫線：
[0105]用DC緩沖液將羊抗鼠IgG稀釋成2mg/ml的羊抗鼠IgG溶液，在PVC底板上貼好硝酸 纖維素膜，中間用羊抗鼠IgG畫C線，用量2ul/cm;
[0106] DC緩沖液配方為：0.8g NaCl+0.05g KCl+0.144gNa2HP04+0.067g NaH2P04,用蒸 餾水定容到l〇〇ml。
[0107]用DT緩沖液將豬病毒蛋白稀釋成0.6ug/ml，在PVC底板上貼好硝酸纖維素膜C線往 下6mm處用稀釋后的豬病毒蛋白畫T線，用量5ul/cm;
[0108] DT緩沖液配方為：0.8g NaCl+0.15g KCl+0.288gNa2HP04+0.134g NaH2P04,用蒸 餾水定容到l〇〇ml，再加入5 %體積的海藻糖。
[0109] 將畫好線的PVC底板在溫度37 °C下干燥9h，密封保存備用；
[0110] (4)膠體金大板的制作：
[0111] 在步驟（3)中的PVC底板上貼上噴好金的玻璃纖維塑模，貼上樣品墊及吸水紙即 可。
[0112] 粘貼過程中一定要注意別再硝酸纖維素膜上留下痕跡，粘貼地方一定要牢固，疊 加部分一定要相互接觸，不能彼此脫離。
[0113]樣品墊使用前進行處理：用定量的DY緩沖液將裁切好的樣品墊進行均勻涂抹，可 以用移液器、玻璃棒進行涂抹，或者直接用濕侵法，使其樣品墊均勻涂抹。其中，l〇〇ml的D Y 緩沖液配方為：10%丨￥20+1^切1^-100 10%+1%?￡620000+10%海藻糖，用蒸餾水定容到 100ml〇
[0114] 實施例4豬口蹄疫病毒抗體膠體定量檢測系統
[0115] 其它內容如實施例1中的內容，生產工藝如下：
[0116] (1)膠體金的制備
[0117]膠體金的制備，500ml蒸餾水加熱至沸騰后，快速加入氯金酸5mg，在加入4mg的朽1 檬酸三鈉還原劑，持續攪拌并煮沸10分鐘，停止加熱后冷卻至常溫，通過可見光分光光度計 檢測其峰值及半峰寬即可。
[0118] (2)膠體金的標記及噴金
[0119] 取100ml膠體金溶液，加入10ml碳酸鉀(稱取13.8g無水K2C03,定容到1000ml)緩沖 液，在攪拌中加入311^/1]11的豬病毒蛋白2〇111繼續攪拌1〇1]1；[11，再加入15%的牛血清白蛋白 1^八(稱取1581^4加蒸餾水1001111)151111進行偶聯，100001'/111；[11離心5111；[11，去掉上清 ；留下清金 顆粒溶液進行噴金使用。用噴金劃膜機按照3ul/cm的量在玻璃纖維素膜上進行均勻噴金， 在37 °C恒溫干燥箱里進行12h干燥；用自封袋進行密封保存。
[0120] (3)硝酸纖維素膜的c/t的畫線
[0121] 先將羊抗鼠 IgG用DC緩沖液（0.8g NaCl+0.05g KC1+0.144gNa2HP04+0.067g NaH2P04用蒸餾水定容到100ml)稀釋成1.5mg/ml，在PVC底板上貼好硝酸纖維素膜中間用羊 抗鼠IgG按照lul/cm進行畫C線；T線用DT緩沖液（0.8g NaCl+0.15g KCl+0.288gNa2HP04+ 0.134gNaH2P04用蒸餾水定容到100ml，在加入5%體積的海藻糖)將豬病毒蛋白稀釋成2mg/ ml或2.5mg/ml，在PVC底板上貼好硝酸纖維素膜C線往下用稀釋后的豬病毒蛋白按照8ul/cm 進行畫T線;在37°C的恒溫干燥箱干燥10h即可，用自封袋進行密封保存。
[0122] 試驗一:對豬瘟病毒抗體的檢測
[0123] 陰性血清的驗證:根據已知(經過國家動物疾控中心定的金標法測定的）的20份陰 性血清，進行雙樣平行性的測定，最終結果應該是C線顯色，T線不顯色即為正確結果。
[0124] 陽性血清的驗證:根據經過國家動物獸醫規定的金標法測定的的5份強陽性豬血 清，分別按照等比稀釋成7個濃度點（1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512)各lml，再 用本發明中的豬病毒檢測試劑條分別測定其以上不同濃度的35份血清。
[0125] 即檢測具體操作步驟為:每個檢測條加入液稀釋后的150ul血清后，在10-30°C的 條件下靜置15min后，用手持式讀卡儀器進行共計35份不同濃度的血清的測定;分別測定其 每個檢測條的C值、T值、T/C值三個數據。
[0126] 標準曲線的建立:根據這5份血清的七個數據點測定其值進行標準曲線的建立(橫 坐標為效價，縱坐標也為T/C值），具體如圖1:
[0127] 再根據T和C線的色度變化通過儀器的檢測和方程式計算出數值，T/C值和抗體效 價梯度值成相應的函數關系即標準曲線方程式為y = aln(x)-b，如圖1。
[0128] 結果分析:當被檢測樣品抗體效價> = 16時，呈陽性，說明檢測樣品中豬瘟病毒抗 體的滴度較高，暫不需要接種豬瘟疫苗。當被檢測樣品抗體效價〈16時，說明檢測樣品中豬 瘟病毒抗體效價不能達到抵御豬瘟病毒強毒攻擊的最低保護效價，應當及時補種豬瘟病毒 疫苗。當被檢測樣品檢測結果呈陰性時，說明被檢測樣品中沒有豬瘟病毒抗體。如果豬群健 康，應當及時接種豬瘟病毒疫苗。
[0129] 試驗二:對豬圓環病毒抗體的檢測
[0130] 其它內容如試驗一中的操作步驟，曲線圖如圖2:
[0131] 結果分析：當被檢測樣品抗體效價>=40時，說明檢測樣品中豬圓環病毒抗體的 滴度較高，暫不需要接種豬圓環疫苗。當被檢測樣品抗體效價〈40時，說明檢測樣品中豬圓 環病毒抗體效價不能達到抵御豬圓環病毒強毒攻擊的最低保護效價，應當及時補種豬圓環 病毒疫苗。當被檢測樣品檢測結果呈陰性時，說明被檢測樣品中沒有豬圓環病毒抗體。如果 豬群健康，應當及時接種豬圓環病毒疫苗。
[0132] 試驗三:對豬藍耳病毒抗體的檢測
[0133] 其它內容如試驗一中的操作步驟，曲線圖如圖3:
[0134] 結果分析：當被檢測樣品抗體效價>=40時，說明檢測樣品中豬藍耳病毒抗體的 滴度較高，暫不需要接種豬藍耳疫苗。當被檢測樣品抗體效價〈40時，說明檢測樣品中豬藍 耳病毒抗體效價不能達到抵御豬藍耳病毒強毒攻擊的最低保護效價，應當及時補種豬藍耳 病毒疫苗。當被檢測樣品檢測結果呈陰性時，說明被檢測樣品中沒有豬藍耳病毒抗體。如果 豬群健康，應當及時接種豬藍耳病毒疫苗。
[0135] 試驗四：
[0136] 檢測操作方法如試驗一，設置對照組1 (進口愛德士試劑盒，ELISA試劑盒），對照組 2 (間接血凝試劑盒)和實驗組(本發明中的檢測盒），對比結果如下：
[0137] 血清號對照組1 對照組2 實驗組符合率 1 + + + 定量膠體金與進口試劑盒的陽性符合率是:90%,與間接血凝試劑盒符合本是 100%； ^： + + + 3_ + + + i + + + 5 + _ _ 6 + + + 7 + + + 8. + + + 9 + + + :]-0+ + + U _ 定量膠體金與進口試劑盒的陽性符合率是1〇(?，與間接血凝試劑盒符合率 是 100%; 12 _ 13 14 15 16 17 _ _ _ 18 19 20 _
[0138] (注:其中"+"代表陽性，"一"代表陰性，符合率都達到了90%及以上）
[0139] 從以上可以看出，本發明中的檢測盒檢測出的結果與目前國際認可的檢測盒的檢 測結果基本一致，且速度快，操作方便，適用范圍廣，對檢測操作人員的要求不高，檢測結果 穩定、準確。
[0140] 本發明中進行動物疫病檢測，步驟可如下：
[0141] (1)將檢測箱的拉桿縮放到箱體里面，箱體正面向上平放于臺面，打開正面的兩個 保險扣；
[0142] (2)詳細閱讀檢測箱里面的使用說明書、技術參數表；
[0143] (3)取出血清板、移液器、離心機，用移液器移取一定量的動物血液在離心機的作 用下分離出血清；
[0144] (4)取出檢測試劑條、計時器，打開外包裝平放于臺面，用移液器量取一定量的血 清于檢(5)測條的加樣孔中，開始計時20min;
[0145] (6)取出手持檢測儀，打開電源開關，待15分鐘時將檢測條放入檢測儀進行定量讀 數。
[0146] 本發明中試劑和樣本用量較小，血清樣品量150ul，不需y-計數器、熒光顯微鏡、 酶標檢測儀等貴重儀器，更適于現場應用，沒有諸如放射性同位素、鄰苯二胺等有害物質參 與，實驗結果可以長期保存，時間大大縮短，提高了檢測速度。因此膠體金定量檢測試劑盒 在霉菌毒素檢測行業中可以得到廣泛應用，從重復性、準確性、靈敏度三方面結果來說都符 合檢測要求;對于現場大量樣品篩選檢測來說，為客戶提供了操作簡單、儀器化程度低、專 業性低、快速等優勢，極大的縮短了客戶的檢測時間，提高了工作效率。
【主權項】
1. 一種動物疫病抗體類病毒膠體金定量檢測系統，包括膠體金定量檢測盒和手持式讀 卡儀器，其特征在于:所述檢測系統對待檢測的動物樣品給出準確的定量檢測結果;該動物 疫病類包括豬瘟、豬藍耳、豬圓環、豬偽狂犬和豬口蹄疫。2. 根據權利要求1所述的一種動物疫病抗體類病毒膠體金定量檢測系統，其特征在于： 所述待檢測的動物樣品為血清或全血;檢測步驟為取50-150ul的動物樣品加入到檢測卡 中，待檢測卡層析反應5-20分鐘后放入手持式讀卡儀進行讀數。3. 根據權利要求1所述的一種動物疫病抗體類病毒膠體金定量檢測系統，其特征在于： 所述定量檢測結果為根據手持式讀卡儀測出的T/C值和抗體效價梯度值成相應的函數關 系，該函數關系式按照對數函數進行擬合曲線，從而制定每批產品的內標曲線而得出定量 檢測結果;該手持式讀卡儀器為通過成像系統測量C/T線的反射光強度，并通過隨機芯片將 檢測結果通過無限網絡傳輸到中央系統或云端服務器;該手持式讀卡儀器主要由智能手 機、塑料模具、鏡片、玻璃板、9V電池、LED燈帶、抽屜式托盤組成。4. 根據權利要求1-3中任一項所述的一種動物疫病抗體類病毒膠體金定量檢測系統， 其特征在于:所述檢測盒包括試劑條和試劑盒，試劑條由基板、樣品墊、膠體金墊、反應膜和 吸水墊組成，膠體金墊上吸附有膠體金標記的豬病毒蛋白和牛血清白蛋白，反應膜上包被 有檢測抗原和質量控制抗體，檢測抗原顯示為檢測線T，為豬病毒抗原；質量控制抗體顯示 為質控線C，為羊抗鼠 IgG抗體。5. 根據權利要求3所述的一種動物疫病抗體類病毒膠體金定量檢測系統，其特征在于： 所述函數關系式為:y = a In (X) -b，其中y代表T/C值，X代表濃度，a代表斜率，b代表常數。6. 根據權利要求3所述的一種動物疫病抗體類病毒膠體金定量檢測系統，其特征在于： 所述每個批次的產品的內標準曲線可以進行相應調整，這樣減少了不同批次產品間定量分 析關系的差別，確保不同批次產品對同一待測物定量檢測關系的一致性，并將內標曲線輸 入軟件制成二維碼方便客戶操作使用。7. 根據權利要求1或4所述的一種動物疫病抗體類病毒膠體金定量檢測系統的制備方 法，其特征在于:所述檢測盒中的試劑條制備方法包括以下步驟，所用原料用量份數為重量 份： (1) 膠體金溶液的制備： 將500份蒸餾水加熱至沸騰后，再加入氯金酸1-5份和檸檬酸三鈉1-5份，攪拌并煮沸8-12min，冷卻至常溫； (2) 膠體金的標記及噴金： 取100份膠體金溶液，加入1.38 %的碳酸鉀緩沖液8-12份，攪拌中加入豬病毒蛋白 0.015-0.025份繼續攪拌8-12min，再加入牛血清白蛋白10-20份進行偶聯，10000r/min離心 4-7min，去掉上清，留下層膠體金顆粒溶液進行噴金使用； 在玻璃纖維素膜上噴金，用量2.5-8.5ul/cm，蛋白濃度2-10ug/ml，再在溫度35-38°C下 干燥IO-Hh，密封保存備用； (3) 硝酸纖維素膜上的C/T畫線： 用DC緩沖液將羊抗鼠 IgG稀釋成0.5-3mg/ml的羊抗鼠 IgG溶液，在PVC底板上貼好硝酸 纖維素膜中間用羊抗鼠 IgG畫C線，用量0.5-3ul/cm; 用DT緩沖液將豬病毒抗原稀釋成0.5-3mg/ml，在PVC底板上貼好硝酸纖維素膜C線往下 5-10mm處用稀釋后的豬病毒蛋白畫T線，用量0.5-3ul/cm; 將畫好線的PVC底板在溫度35-38°C下干燥8-12h，密封保存備用； (4)膠體金大板的制作： 在步驟(3)中的PVC底板上貼上噴好金的玻璃纖維塑模，貼上樣品墊及吸水紙即可。8. 根據權利要求7所述的一種動物疫病抗體類病毒膠體金定量檢測系統的制備方法， 其特征在于:所述步驟(2)中膠體金顆粒大小為15-60nm，膠體金顆粒溶液質量濃度為0.5- 2%〇9. 根據權利要求7所述的一種動物疫病抗體類病毒膠體金定量檢測系統的制備方法， 其特征在于:所述步驟(4)中的樣品墊使用前進行處理，即用定量的DY緩沖液進行均勻涂 抹，其中，100mL的D Y緩沖液配方為：10%tw20+表面活性劑5-15%+1 %PEG20000+10%海藻 糖，用蒸餾水定容到l〇〇ml。10. 根據權利要求7所述的一種動物疫病抗體類病毒膠體金定量檢測系統的制備方法， 其特征在于:所述膠體金溶液PH值為6.2-7.8。
【文檔編號】G01N33/569GK105911277SQ201610260006
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月25日
【發明人】蔡文勝, 劉文副, 李丹, 胡俊峰, 徐江波, 馬路春
【申請人】成都盛泰爾生物醫藥科技有限公司