一種半楓荷活血化瘀活性部位的提取方法及指紋圖譜檢測方法

一種半楓荷活血化瘀活性部位的提取方法及指紋圖譜檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種半楓荷活血化瘀活性部位的提取方法，取干燥的半楓荷根粉碎后采用乙醇提取1?3次后濃縮干燥得到含有活血化瘀活性部位的半楓荷提取物；其中，半楓荷根和乙醇的比例為40?50g:1ml；每次用乙醇提取時間為100?200min。該提取方法提取準確性高、提取物活性高；此外本發明還提供一種半楓荷的活血化瘀活性部位的指紋圖譜檢測方法。該檢測方法可以客觀、全面、準確地評價半楓荷有效成分的質量，對控制半楓荷有效成分的質量和保證臨床療效有重要意義。
【專利說明】
一種半楓荷活血化瘀活性部位的提取方法及指紋圖譜檢測 方法
技術領域
[0001] 本發明涉及藥物分析技術領域，尤其涉及一種半楓荷活血化瘀活性部位的提取方 法及指紋圖譜檢測方法。
【背景技術】
[0002] 半楓荷(Semiliquidambar cathayensis Chang)是金縷梅科半楓荷新發現的寡種 屬植物，為我國特產。半楓荷是我國特有的藥用植物，有祛風除濕、舒筋活血的功效(傅立 國.中國植物紅皮書-稀有瀕危植物[M].第一冊.北京:科學出版社，1992 .)，初步研究發現， 其化學成分主要為齊墩果酸衍生物和鞣酸衍生物(周光雄，楊永春，石建功，等.金縷半楓荷 化學成分研究[J].中草藥，2002.33(7): 589-591.)。經研究，半楓荷的提取物有活血化瘀作 用。（梁偉江，盧海嘯，曾孟，等.半楓荷提取物對血瘀模型大鼠的影響[J].中藥材，2015.38
[2] :366-369.)該研究采用持續力竭游泳法制作大鼠血瘀模型，并對半楓荷不同極性提取 物的活血化瘀活性進行了測定，發現不同極性半楓荷提取物均有活血化瘀的作用。
[0003] 中藥指紋圖譜是指某種(或某地）中藥材或中成藥經適當處理后，采用一定的分析 手段，得到的能夠標示該中藥材或中成藥藥物特性的共有峰的圖譜。指紋圖譜從中醫整體 觀念和中藥藥效來自多種化學物質綜合作用的觀點出發，能夠建立比較客觀、整體和多指 標的綜合評價體系，并通過圖譜的整體特征，能夠比較全面地反映出中藥所含化學成分的 種類與數量，是一種綜合的、可量化的質量控制手段。與測定單一組分相比，它的優勢在于 能夠提供更豐富、有效的質和量的信息，因此指紋圖譜能較為宏觀和綜合地反映中藥的內 在質量已被國內外研究者所認可。
[0004] 專利號CN201410106425.0-種枳實藥材指紋圖譜、其建立方法及用途(喬善義;孫 磊;劉曉晴）公開了一種枳實藥材指紋圖譜、其建立方法及用途。該發明涉及一種枳實藥材 高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜及其建立方法，以及枳實藥材HPLC指紋圖譜和/或標準指紋 圖譜在鑒別枳實藥材中的用途。該發明枳實藥材HPLC指紋圖譜的建立方法，包括下述步驟： (1)枳實供試品的制備，和（2)高效液相色譜分析方法。該發明還涉及一種鑒別枳實藥材的 方法。該發明適于對枳實藥材真偽和質量進行鑒別。
[0005] 專利號CN201310692364.6(中藥苦黃注射液及其原料藥材、半成品的指紋圖譜檢 測方法及應用顧治平;王恒斌；陳力建)公開了中藥苦黃注射液及其原料藥材、半成品的指 紋圖譜檢測方法及其應用。該方法包括供試液的制備，對照指紋圖譜的建立和供試液指紋 圖譜的測定。該專利根據中藥苦黃注射劑中所含的活性成分，包括蒽醌類、黃酮類和生物堿 類化合物的結構性質特點。并通過大量實驗篩選出最佳的流動相組成，梯度洗脫程序、流 速，檢測波長、色譜柱，柱溫等分析條件。
[0006] 專利號CN201310313721.3(-種化橘紅有效部位及其制劑的質量控制方法彭維； 蘇薇薇;鄒威等)公開了一種化橘紅有效部位及其制劑的質量控制方法。該發明以含新北美 圣草苷、櫻桃苷、柚皮苷、野漆樹苷、橙皮內酯水合物、7_(2"-a-鼠李糖基-6"-(3""_羥基- 3""-甲基戊二酰)-P-D-葡萄糖基)柚皮素、柚皮素的混合甲醇溶液為對照品；以化橘紅有效 部位或其制劑的甲醇提取液為供試品；在特定的色譜條件下，采用高效液相色譜指紋圖譜 分析法，建立對照品的高效液相色譜、供試品的高效液相色譜指紋圖譜和對照指紋圖譜，通 過供試品是否含有與對照品相對應的色譜峰，以及與對照指紋圖譜的相似度評價結果，判 斷藥品是否合格。
[0007] 專利號CN103110677A(-種西洋參提取物的提取方法及其在制備防治艾滋病藥物 中的應用劉延軍郭會軍李青雅肖培根等），本發明涉及一種防治艾滋病的藥物的提取方法 及其應用，具體涉及西洋參提取物的提取方法及其在制備防治艾滋病的藥物中的應用，可 通過添加藥學上可接受的載體，將西洋參提取物制備成口服制劑或注射劑，所述口服制劑 的劑型優選為膠囊、片劑、滴丸劑、微丸劑、口服液或顆粒劑。藥效學試驗表明西洋參提取物 能在不損傷免疫功能的前提下，有效阻斷HIV感染，無副作用，從而實現對艾滋病的防治。
[0008] 在我國現有標準中，中藥材、中成藥的質量標準大量限于外觀鑒別，性狀檢查、即 使在建立成分測定的標準中，所測成分大部分僅為一、二個指標成分，而不是直接與療效相 關的有效成分，在常規檢查中，外觀、性狀的鑒別以及化學鑒別項的內容中，存在大量普適 性內容、專屬性不強、很難對藥材或制劑的特性有一個全面的描述。

【發明內容】

[0009] 本發明的目的是提供一種半楓荷的活血化瘀活性部位的提取方法和指紋圖譜檢 測方法。該檢測方法可以客觀、全面、準確地評價半楓荷有效成分的質量，對控制半楓荷有 效成分的質量和保證臨床療效有重要意義。
[0010] 本發明的技術方案為:一種半楓荷活血化瘀活性部位的提取方法，取干燥的半楓 荷根粉碎后采用乙醇提取1-3次后濃縮干燥得到含有活血化瘀活性部位的半楓荷提取物； [00 11] 其中，半楓荷根和乙醇的比例為lg:40-50ml;每次用乙醇提取時間為100-200min。 [0012]在上述的半楓荷活血化瘀活性部位的提取方法中，所述的提取溫度為50-90°C。
[0013] 在上述的半楓荷活血化瘀活性部位的提取方法中，所述的乙醇的體積百分比為 65 %，每次加入的料液比為1 g: 45ml，在70 °C下提取3次，每次提取時間為150min。
[0014] 同時本發明還公開了上述的半楓荷活血化瘀活性部位的指紋圖譜檢測方法，包括 以下步驟：
[0015] 步驟1:精密稱取5.Omg半楓荷提取物，用色譜純甲醇溶解且定容至lml容量瓶中， 用0.45微米微孔濾膜過濾，即得到半楓荷供試品；
[0016]步驟2:對步驟1制備的供試品進行高效液相色譜測定，并以保留時間為19.235± 5 %，32 ? 858 ± 5 %，39 ? 106 ± 5 %的三個特征峰作為反式-白藜蘆醇葡萄糖苷、3，3'-二甲氧 基鞣花酸-0-2-L-吡喃鼠李糖苷、3，3'-甲醚-鞣花酸的特征峰，進行分析比較；
[0017] 高效液相色譜的條件為:色譜柱填料為Aglient C18,規格為250mmX4.6mm 5_， 波長為254nm，流動相為乙腈-0.4 %磷酸，梯度洗脫為：0~lmin，乙腈體積百分比由5 %~ 8%，0.4%磷酸體積百分比由95%~92% ; 1~lOmin，乙腈體積百分比由8%~12% ,0.4% 磷酸體積百分比由92 %~88 % ; 10~29min，乙腈體積百分比由12 %~20 %，0.4%磷酸體積 百分比由88 %~80 % ; 29~42min，乙腈由體積百分比20 %~30 %，0.4%磷酸體積百分比由 80 %~70 % ; 42~50min，乙腈體積百分比由30 %~40 %，0.4 %磷酸體積百分比由70 %~ 60%;5〇111；[11~60111；[11，乙臆體積百分比由40%~75%，0.4%磷酸體積百分比由60%~25%; 60min~70min，乙腈體積百分比由75 %~95 %，0.4%磷酸體積百分比由25 %~5 %。
[0018]本發明的有益效果如下：
[0019] 本發明以活血化瘀化學成分組(反式-白藜蘆醇葡萄糖苷、3,3'-二甲氧基鞣花酸- V-0-2-L-吡喃鼠李糖苷、3 甲醚-鞣花酸化學成分)為評價指標，得到半楓荷提取物的 最佳工藝條件:熱回流方法提取、提取時間為150分鐘、提取溶劑為乙醇、提取濃度為65 %、 料液比為1:45、提取次數為3次、提取溫度為70°C，以此提高臨床療效，對半楓荷活血化瘀活 性成分的質量控制方法研究具有實用價值和重大意義。
[0020] 本發明通過運用現代提取技術、高效液相色譜分析方法、excel軟件和SPSS軟件 等，明確半柄荷提取的最佳工藝條件，從而確定半柄荷的提取工藝，為提尚半柄荷的活血化 瘀活性部位提取率研究提供科學依據，又可進一步提高半楓荷的藥理作用。
[0021] 采用一測多評法同時鑒定及測定半楓荷的活血化瘀活性部位，有效地全面監控半 楓荷藥材質量。監控生產工藝的穩定性，保證其質量的穩定、均一、可控、有效的避免了半楓 荷藥材偽品，保證半楓荷藥材生產流通秩序。
【附圖說明】
[0022] 圖1為實施例4的指紋圖譜；
[0023] 圖2為實施例4的反式-白藜蘆醇葡萄糖苷的保留特征峰；
[0024] 圖3為實施例4的-二甲氧基鞣花酸-0-2-L-吡喃鼠李糖苷的保留特征峰；
[0025] 圖4為實施例4的3 -甲醚-鞣花酸的保留特征峰。
【具體實施方式】
[0026] 下面結合【具體實施方式】，對本發明的技術方案作進一步的詳細說明，但不構成對 本發明的任何限制。
[0027] 實施例1
[0028]本發明的半楓荷的活血化瘀活性部位的提取方法的步驟如下：
[0029]取干燥的半楓荷根，粉碎后過二號篩，然后加入乙醇，每次加入的料液比為lg: 40ml，然后加熱，在50°C下提取3次，每次提取時間為lOOmin過濾后，濃縮干燥即可得到含有 活血化瘀活性部位的半楓荷提取物。
[0030]所述的乙醇的體積百分數為65%。
[0031] 實施例2
[0032]本發明的半楓荷的活血化瘀活性部位的提取方法的步驟如下：
[0033]取干燥的半楓荷根，粉碎后過二號篩，然后加入乙醇，每次加入的料液比為lg: 50ml，然后加熱，在60°C下提取1次，每次提取時間為200min，過濾后，濃縮干燥即可得到含 有活血化瘀活性部位的半楓荷提取物。
[0034]所述的乙醇的體積百分數為65%。
[0035] 實施例3
[0036] 本發明的半楓荷的活血化瘀活性部位的提取方法的步驟如下：
[0037]取干燥的半楓荷根，粉碎后過二號篩，然后加入乙醇，每次加入的料液比為lg: 45ml，然后加熱，在70°C下提取3次，每次提取時間為150min，過濾后，濃縮干燥即可得到含 有活血化瘀活性部位的半楓荷提取物。
[0038]所述的乙醇的體積百分數為65%。
[0039] 實施例4
[0040] 半楓荷高效液相指紋圖譜的建立和驗證
[0041 ] 1儀器和試藥
[0042] 安捷倫1260及色譜工作站，甲醇和乙腈均為色譜純，水為純化水，其余為分析純。
[0043] 2半楓荷藥材高效液相指紋圖譜的建立
[0044] 2.1供試品溶液制備：
[0045] 精密稱取5. Omg實施例1-3制備的半楓荷提取物，用色譜純甲醇溶解且定容至lml 容量瓶中，用〇. 45微米微孔濾膜過濾，即得到半楓荷供試品。
[0046] 2.2對照品溶液的制備：
[0047] 通過高效液相色譜測定多個批次的半楓荷藥材，高效液相色譜分析色譜柱填料為 Agl ient C18，規格為250mm X 4 ? 6mm 5wii，波長為254nm，流動相為乙腈-0 ? 4%磷酸，梯度洗 脫為：〇~lmin，乙腈體積百分比由5%~8%，0.4%磷酸體積百分比由95%~92% ; 1~ lOmin,乙腈體積百分比由8%~12% ,0.4%磷酸體積百分比由92%~88% ; 10~29min,乙 腈體積百分比由12%~20%，0.4%磷酸體積百分比由88%~80% ; 29~42min,乙腈體積百 分比由20 %~30 %，0.4 %磷酸體積百分比由80 %~70 % ; 42~50min，乙腈體積百分比由 30%~40% ,0.4%磷酸體積百分比由70%~60% ;50min~60min,乙腈體積百分比由40% ~75 % , 0.4 %磷酸體積百分比由60 %~25 % ; 60min~70min,乙臆體積百分比由75 %~ 95%，0.4%磷酸體積百分比由25%~5%。
[0048]得到指紋圖譜共有12各共有特征峰，具體保留時間分別為：1.640±5%(1號峰）， 2.386±5%(2號峰），3.316±5%(3號峰），4.246±5%(4號峰），5.214±5%(5號峰）， 19.235±5%(6號峰），20.727±5%(7號峰），27.65±5%(8號峰），29.586±5%(9號峰）， 32.858±5%(10號峰），39.106±5%(11號峰），61.782±5%(12號峰）。（圖1)
[0049] 其中保留時間為 19.235±5%(6號峰），32.858±5%(10號峰），39.106±5%(11號 峰），分別為反式-白藜蘆醇葡萄糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸-0-2-L-吡喃鼠李糖苷、3， 3'-甲醚-鞣花酸(分別為圖2、圖3、圖4)。
[0050] 2.3對步驟2.1制備的供試品進行高效液相色譜測定，并以步驟2.2中確定的三個 特征峰為評價指標，進行分析比較。
[0051 ] 3方法學驗證
[0052] 3.1精密度試驗
[0053]取同一半楓荷活性成分供試品溶液連續進樣6次，檢測指紋圖譜。再采用《中藥色 譜指紋圖譜相似度評價系統2009版》進行評價，結果表明供試品溶液的相似度均等于1，說 明儀器精密度良好。
[0054] 3.2穩定性試驗
[0055] 取同一個半楓荷活性成分供試品溶液。分別在0.2.4.6.8.10.12.24.48小時進樣， 檢測指紋圖譜。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2009版》進行評價，結果表明供試 品溶液的相似度均等于1，說明供試品在放置48小時內穩定。
[0056] 3.3重復性試驗
[0057] 取同一批半楓荷活性成分供試品6份，按"供試品溶液制備"方法制備，分別進樣， 檢測指紋圖譜。再采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2009版》進行評價。得出半楓荷 根干燥粉末重復性好。
[0058] 4最佳制備技術的優選
[0059] 通過指紋圖譜對比，實施例1-3中的提取方法的提取率分別是8.58%、9.96%、 12.75%，通過上述對比分析，本發明實施例3的提取方法提取率最好。
[0060]該研究采用持續力竭性游泳血瘀模型，檢測舌象、全血黏度、血漿黏度、紅細胞聚 集指數、血小板數、1'1'、？1')?17、？18等指標，考察半楓荷各極性提取物的活血化瘀作用。結 果分布如下：
[0061 ] 1.檢測舌象檢測
[0062] 表1半楓荷提取物各極性部位對血瘀大鼠舌象評分的影響CS：±hn = 10)
[0064] 注:與正常對照組比較，，<0.05，*叩<0.01;與模型組比較><0.05，，<0.01 [0065]可知道與正常對照組比較，模型組大鼠舌象評分顯著升高(P<0.01);與模型組比 較，除石油醚部位組外，各給藥組舌象評分均顯著降低(P<〇.05或P<0.01)，其中以正丁醇 部位組、水部位組對舌象改善最顯著。
[0066] 2.全血黏度及血漿黏度檢測
[0067] 表2半楓荷提取物各極性部位對血瘀大鼠全血黏度及血漿黏度的影響= 10)
[0069] 注:與正常對照組比較，*?<0.05，*叩<0.01;與模型組比較，##?<0.01
[0070]可知道與正常對照組比較，模型組全血黏度和血漿黏度均升高(P<0.01);與模型 組比較，各給藥組全血黏度均顯著降低(P<〇.01)。
[0071 ] 3.紅細胞聚集指數檢測
[0072]表3半楓荷提取物各極性部位對血瘀大鼠紅細胞聚集指數的影響UHn = 10)
[0074] 注:與正常對照組比較，**P<0.01;與模型組比較，##P<0.01
[0075]可知道與正常對照組比較，模型組大鼠紅細胞聚集指數顯著升高(P<0.01);與模 型組比較，各給藥組紅細胞聚集指數均顯著降低(P<〇.01)，其中以水部位組作用最佳。
[0076] 4.血小板數檢測
[0077] 表4半楓荷提取物各極性部位對血瘀大鼠血小板計數的影響（mn = 10)
[0079] 注:與正常對照組比較，**P<0.01;與模型組比較，##P<0.01
[0080]可知道與模型組比較，半楓荷水部位各劑量組血小板數計數均顯著降低（P< 〇. 01 )，其作用呈現一定的量效關系。
[0081] 5.半楓荷提取物各極性部位對血瘀大鼠凝血四項的影響
[0082] 表5半楓荷提取物各極性部位對血瘀大鼠凝血四項的影響(mn = 10)
[0084] 注:與正常對照組比較，*?<0.05，*叩<0.01;與模型組比較><0.05，，<0.01
[0085] 結果如表5所示，與正常對照組比較，模型組PT、APTT顯著降低，TT、FIB顯著升高(P <0.01);與模型組比較，各給藥組PT、APTT顯著升高，TT、FIB顯著降低（P<0.05SP< 0.01)，其中以水部位組作用最佳。
[0086] 6.不同劑量半楓荷提取物水部位對血瘀大鼠
[0087]舌象評分的影響：
[0088] 表6不同劑量半楓荷水提取物部位對血瘀大鼠舌象評分的影響(f = 10)
[0090] 注:與正常對照組比較，**P<0.01;與模型組比較，#P<0.05。
[0091] 如表6所示，與模型組比較，半楓荷水部位各劑量組舌象評分均顯著降低(P<0.05 或P<0.01)，其作用呈現一定的量效關系。
[0092] 7.不同劑量半楓荷提取物水部位對血瘀大鼠全血黏度及血漿黏度的影響：
[0093] 表7不同劑量半楓荷提取物水部位對血瘀大鼠全血黏度及血漿黏度的影響 = 10)
[0095] 注:與正常對照組比較，**P<0.01;與模型組比較，##P<0.01
[0096]可知道與模型組比較，半楓荷水部位各劑量組全血黏度及血漿黏度均顯著降低(P <〇.〇1)，其作用呈現一定的量效關系。
[0097] 8.不同劑量半楓荷提取物水部位對血瘀大鼠紅細胞聚集指數的影響；
[0098] 表8不同劑量半楓荷提取物水部位對血瘀大鼠紅細胞聚集指數的影響（mn = 10)
[0100] 注:與正常對照組比較，**P<〇. 01;與模型組比較，##P<〇. 01
[0101] 可知道與模型組比較，半楓荷水部位各劑量組紅細胞聚集指數均顯著降低（P< 0.01 )，其作用呈現一定的量效關系。
[0102] 9.不同劑量半楓荷提取物水部位對血瘀大鼠血小板計數的影響：
[0103] 表9不同劑量半楓荷提取物水部位對血瘀大鼠血小板計數的影響(US <n = 10)
[0105] 注:與正常對照組比較，**P<0.01;與模型組比較，##P<0.01
[0106] 與模型組比較，半楓荷水部位各劑量組血小板數計數均顯著降低(P<0.01)，其作 用呈現一定的量效關系。
[0107] 10.不同劑量半楓荷提取物水部位對血瘀大鼠凝血四項的影響：
[0108] 表10不同劑量半楓荷提取物水部位對血瘀大鼠凝血四項的影響(>~n = 10)
[0110] 注:與正常對照組比較，**P<0.01;與
模型組比較，P<0.01
[0111] 可知道與模型組比較，半楓荷水部位各劑量組PT、APTT顯著升高，TT、FIB顯著降低 (P<0.01)，其作用呈現一定的量效關系。
[0112] 由以上結論可知半楓荷提取物均具有顯著的活血化瘀作用，其活血化瘀的有效部 位為水部位
[0113] 以上所述的僅為本發明的較佳實施例，凡在本發明的精神和原則范圍內所作的任 何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種半楓荷活血化瘀活性部位的提取方法，其特征在于:取干燥的半楓荷根粉碎后 采用乙醇提取1-3次后濃縮干燥得到含有活血化瘀活性部位的半楓荷提取物； 其中，半楓荷根和乙醇的比例為lg:40-50ml;每次用乙醇提取時間為100-200min。2. 根據權利要求1所述的半楓荷活血化瘀活性部位的提取方法，其特征在于，所述的提 取溫度為50-90 °C。3. 根據權利要求1所述的半楓荷活血化瘀活性部位的提取方法，其特征在于，所述的乙 醇的體積百分比為65%，每次加入的料液比為lg:45ml，在70°C下提取3次，每次提取時間為 150min〇4. 根據權利要求1至3任一所述的半楓荷活血化瘀活性部位的指紋圖譜檢測方法，其特 征在于，包括以下步驟： 步驟1:精密稱取5. Omg半楓荷提取物，用色譜純甲醇溶解且定容至Iml容量瓶中，用 0.45微米微孔濾膜過濾，即得到半楓荷供試品； 步驟2:對步驟1制備的供試品進行高效液相色譜測定，并以保留時間為19.235±5%， 32 · 858 ± 5 %，39 · 106 ± 5 %的三個特征峰作為反式-白藜蘆醇葡萄糖苷、3，3'-二甲氧基鞣 花酸-0-2-L-吡喃鼠李糖苷、3，3'-甲醚-鞣花酸的特征峰，進行分析比較； 高效液相色譜的條件為:色譜柱填料為Aglient C18,規格為250mmX4.6mm 5μηι，波長 為254nm，流動相為乙腈-0.4%磷酸，梯度洗脫為:0~Imin，乙腈體積百分比由5 %~8 %， 0.4%磷酸體積百分比由95%~92% ; 1~IOmin，乙腈體積百分比由8%~12% ,0.4%磷酸 體積百分比由92%~88% ; 10~29min，乙腈體積百分比由12%~20%，0.4%磷酸體積百分 比由88%~80 % ; 29~42min，乙腈由體積百分比20%~30%，0.4%磷酸體積百分比由80% ~70 % ; 42~50min，乙腈體積百分比由30 %~40 %，0.4%磷酸體積百分比由70 %~60 % ; 50min~60min，乙臆體積百分比由40%~75%，0.4%磷酸體積百分比由60%~25% ;60min ~70min，乙腈體積百分比由75 %~95 %，0.4%磷酸體積百分比由25 %~5 %。
【文檔編號】A61K36/185GK105911192SQ201610390309
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月6日
【發明人】盧海嘯, 梁偉江
【申請人】玉林師范學院