三文魚中磷脂分子的檢測方法

三文魚中磷脂分子的檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種三文魚中磷脂分子的檢測方法，包括以下步驟：1)、樣品前處理：將三文魚肉洗凈后研磨成糜，在三文魚肉糜中加入有機溶劑Ⅰ后震蕩混勻；超聲冰浴提取，提取完畢后向加入純水并震蕩混勻；所得的混合物用冷凍離心機離心，移取下相溶液，將該下相溶液低溫干燥后，用有機溶劑Ⅱ復溶，得脂質粗提物；2)、富集和凈化：先對固相萃取柱進行活化處理；然后將脂質粗提物經上樣、淋洗、洗脫；所收集的洗脫液為磷脂提取液；3)、將磷脂提取液進行質譜檢測分析。采用本發明的方法能實現對三文魚中磷脂酰膽堿(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)兩大類磷脂的結構鑒定和定量分析。
【專利說明】
三文魚中磷脂分子的檢測方法
技術領域
[0001] 本發明屬于食品檢測領域，涉及三文魚中磷脂分子的檢測方法，具體指一種三文 魚中磷脂酰膽堿(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)兩大類磷脂的結構鑒定和定量分析方法。
【背景技術】
[0002] 三文魚是生長在挪威、美國和加拿大等高煒度地區的鮭科種類，屬于冷水性的洄 游魚類。其肉質細嫩，口感鮮美，肉色一般呈紅色或橘色，是魚類中的珍品。三文魚營養價值 極高，富含脂溶性維他命A及D以及水溶性維他命B12及維他命B6,也是-3不飽和脂肪酸的重 要來源，其蛋白質含量高，膽固醇和熱量含量低，是全世界餐桌上的高檔水產品之一。食用 三文魚能有效防治心腦血管疾病，緩解血管炎癥和安撫神經功效，還可預防糖尿病等疾病， 三文魚的食用價值和保健價值，已被越來越多的人們所認識。
[0003] 磷脂是一類含有磷酸的脂類。磷脂結構主要由甘油骨架、極性基團和不同長度和 飽和度的脂肪酸鏈組成。根據磷脂極性基團不同，可將磷脂分為磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺 等類別。生物體中存在的磷脂種數以千計，結構多樣、種類復雜，具有獨特的化學結構。磷脂 是維持細胞結構的重要組成部分，也是新陳代謝不可或缺的營養元素。磷脂還具備廣泛的 生物學功能，諸如活化細胞，維持代謝與荷爾蒙分泌均衡，增強人體免疫力等。實驗證明，磷 脂可以分解血脂、膽固醇，阻止多余脂肪在血管壁沉積，使血管循環順暢，被譽為"血管清道 夫"。高效的三文魚中磷脂分子的檢測方法將有利于深化三文魚中磷脂的營養學研究，促進 三文魚為原料的產品開發。
[0004] 常規磷脂提取方法主要為液液萃取和C18固相萃取，磷脂的特異性吸附較差，導致 提取物中含有較多雜質。
[0005] 傳統磷脂檢測方法包括高效液相色譜（HPLC)、核磁共振波譜（NMR)、熒光光譜 (FLR)等，這些方法分析耗時長、靈敏度低。質譜技術已經成為當前磷脂研究的主流技術手 段，基質輔助激光解吸/飛行時間串聯質譜法已被證實是一種快速有效的分析手段，每個樣 品的分析可以控制在幾秒鐘以內。
[0006] 建立基質輔助激光解吸/飛行時間串聯質譜法，快速分析三文魚肌肉組織中磷脂 酰膽堿和磷脂酰乙醇胺分子種，有利于深化三文魚營養學認識。

【發明內容】

[0007] 本發明要解決的技術問題是提供一種操作簡便、定性定量能力較強的三文魚中磷 脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺的基質輔助激光解吸/飛行時間串聯質譜檢測方法。
[0008] 為了解決上述技術問題，本發明提供一種三文魚中磷脂分子的檢測方法，包括以 下步驟：
[0009] 1)、樣品前處理：
[0010]將三文魚肉洗凈后研磨成糜，在三文魚肉糜中加入有機溶劑I后震蕩混勻；超聲 (探頭式超聲)冰浴提取(提取時間為10~20分鐘），提取完畢后向加入純水并震蕩混勻；
[0011] 所得的混合物用冷凍離心機離心，移取下相溶液，將該下相溶液低溫（<io°c)干 燥后（用氮氣進行低溫吹干），用有機溶劑n復溶，得脂質粗提物；
[0012] 有機溶劑I為甲醇:氯仿= 1:0.5~2體積比的混合液，三文魚肉糜與有機溶劑I的 料液比為lg/15~30ml;所加入純水的量為有機溶劑I的0.5~1體積倍；
[0013] 所述有機溶劑n為體積濃度多30% (較佳為多70% )的甲醇水溶液或甲醇；
[0014] 2)、富集和凈化：
[0015] 先對固相萃取柱進行活化處理(通過使用有機溶劑水溶液實現活化）；然后將脂質 粗提物經上樣、淋洗、洗脫;所收集的洗脫液為磷脂提取液；
[0016] 3)、將磷脂提取液進行質譜檢測分析。
[0017 ]作為本發明的三文魚中磷脂分子的檢測方法的改進：
[0018] 所述步驟3)為：
[0019]將磷脂提取液與DHB基質等體積比混合后的所得物在點樣板上點樣，于空氣中干 燥結晶后進行質譜分析;正離子反射模式，加速電壓20kV，離子萃取時間延遲450ns，掃描范 圍為450~1000m/z ;質譜數據采集使用4000Series Explorer，所有譜圖均經同位素校正， 確保微量磷脂的離子峰不受其他高濃度磷脂離子峰干擾。
[0020] 備注說明：同位素校準屬于常規方式，例如可由4000Series Explorer這個軟件完 成的，具體操作為選擇Peaks選項，Peak Deisotoping選項，Adduct選擇為H。
[0021 ]作為本發明的三文魚中磷脂分子的檢測方法的進一步改進：
[0022]所述步驟1)中，以移取下相溶液后的離心所得物（即，包括上相溶液和固體）替代 三文魚肉糜，以機溶劑I中的氯仿替代機溶劑I;再重復提取1~3次;將所有提取后所得的下 相溶液合并后進行后續的干燥和復溶。
[0023]備注說明：離心后離心管內溶液上下分層，三文魚肌肉組織樣品則呈餅狀居于兩 相中間。
[0024]甲醇、氯仿、水三者在一起的時候不會混溶，會分成上下兩相，甲醇極性較強會與 水混溶，因此在離心管中，氯仿混溶少量甲醇在下相，水混溶多量甲醇在上相；由于移取走 下相后，實際大部分甲醇依然在上相中并未被移取，因此重復提取的時候只需要加入氯仿 即可。即，重復提取時氯仿的體積用量=機溶劑I中的氯仿的體積用量。
[0025]作為本發明的三文魚中磷脂分子的檢測方法的進一步改進：
[0026]所述步驟1)中超聲條件為25kHz。
[0027]作為本發明的三文魚中磷脂分子的檢測方法的進一步改進：
[0028] 所述步驟2)中，有固相萃取柱填料為二氧化硅/二氧化鈦殼核復合材料；
[0029] 淋洗液為有機溶劑m水溶液或水，有機溶劑m水溶液中有機溶劑m的體積濃度< 1 〇 %，有機溶劑m為甲醇、乙腈；
[0030] 洗脫液為有機溶劑IV水溶液或有機溶劑IV，有機溶劑IV水溶液中有機溶劑IV的體 積濃度多75 % (較佳為多90 % )，有機溶劑IV為甲醇、乙腈。
[0031 ]作為本發明的三文魚中磷脂分子的檢測方法的進一步改進：
[0032] 所述步驟2)中，上樣、淋洗和洗脫的流速均為0.2~2mL/min(優選流速為0.6mL/ min) 〇
[0033]作為本發明的三文魚中磷脂分子的檢測方法的進一步改進：
[0034]所述步驟3)中，在點樣板上的點樣量為0.5~lyL。
[0035]作為本發明的三文魚中磷脂分子的檢測方法的進一步改進：
[0036] 所述步驟1)中，用冷凍離心機離心為:于4°C、8000rpm離心15分鐘。
[0037]作為本發明的三文魚中磷脂分子的檢測方法的進一步改進：
[0038]所述步驟1)中，三文魚肉糜與復溶用的有機溶劑II的料液比為lg/1~2ml。
[0039] 在本發明中，
[0040]步驟1 )，將三文魚去皮、去骨、去內臟后，所得的肌肉組織三文魚肉。
[0041]所述步驟2)中，使用有機溶劑水溶液對固相萃取柱進行活化處理，可使用注射器 將有機溶劑水溶液流經填料層，將流出液收集并丟棄，達到固相萃取柱活化與清洗的目的。 [0042]固相萃取柱包含空管，上下篩板，篩板中間填料為二氧化硅/二氧化鈦殼核復合材 料。本發明所用的二氧化娃/二氧化鈦殼核復合材料可按照發表于《T a 1 a n t a》的V 〇 1 u m e 123，June 2014，Pages 233-240,篇名為"Solid-phase extraction approach for phospholipids profiling by titania-coated silica microspheres prior to reversed-phase liquid chromatography-evaporative light scattering detection and tandem mass spectrometry analysis"的方法進行制備。二氧化欽：二氧化娃質量比 為1 /10，粒徑為50~100um。例如具體為通過熱水法合成，3.5g鈦酸四丁酯溶解在14mL乙醇 中，60°C下密封振蕩。加入8g硅膠并攪拌至干，得到的固形物在100°C下熏蒸6小時后得到粗 復合物，取lg粗復合物于反應釜中60°C維持5小時，最后將產物于500°C老化5小時，即得到 二氧化硅/二氧化鈦殼核復合材料。
[0043]在本發明中，步驟1)復溶后過0.22M1的PTFE濾膜。
[0044] 步驟2)中，脂質粗提物與作為填料的二氧化硅/二氧化鈦殼核復合材料的用量比 一般為lml/1~3g;活化處理時所用的有機溶劑水溶液為：甲醇、50% (體積）甲醇水溶液、乙 臆。
[0045] 該步驟2)具體為包括以下步驟：
[0046] A)填料活化:使用有機溶劑水溶液對填料層進行活化處理，使用3mL注射器將有機 溶劑水溶液流經填料層，將流出液收集并丟棄，達到固相萃取柱活化與清洗的目的。
[0047] B)上樣：取3mL注射器抽取適量樣品溶液，注入固相萃取柱，目標組分被吸附在填 料上，雜質直接隨樣品溶液流出固相萃取柱并丟棄。
[0048] C)淋洗：向固相萃取柱注入3mL淋洗液，目的是為了洗去與目標組分共吸附的雜 質。
[0049] D)洗脫：向固相萃取柱加入1~3mL洗脫劑，收集洗脫液。
[0050] 綜上所述，本發明采用以二氧化硅/二氧化鈦殼核復合材料為填料的固相萃取柱 對三文魚中的磷脂進行選擇性富集，經填料活化、上樣、體積濃度<10%的甲醇或乙腈水溶 液淋洗、體積濃度多75%的甲醇或乙腈水溶液洗脫步驟后，得到純化的磷脂。本發明樣品制 備、填料活化、上樣、淋洗和洗脫步驟，操作簡便、簡單易培訓、定性定量能力較強、實用性 強，適合實驗室廣泛使用。即，采用本發明的方法能準確獲得三文魚中磷脂酰膽堿(PC)和磷 脂酰乙醇胺(PE)兩大類磷脂的含量，也能進行準確的結構鑒定。
【附圖說明】
[0051] 下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0052] 圖1的上、下圖分別為正離子模式下磷脂酰膽堿DMPC(14:0/14:0)和磷脂酰乙醇胺 DPPE(15:0/15:0)標準品質譜圖。上圖：4700 Reflector Spec #1 MC[BP = 678.4,2741]; 下圖：4700 Reflector Spec #1 MC[BP = 686.4,462]〇
[0053]圖2是三文魚肌肉組織脂質提取物正離子模式質譜圖。圖中，4700 Reflector Spec #1 MC[BP = 806.4，1211]。
【具體實施方式】
[0054]下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此：以下結合附圖詳細說明本發明的【具體實施方式】，使本領域的技術人員更清楚地理解如 何實踐本發明。應當理解，盡管結合其優選的具體實施方案描述了本發明，但這些實施方案 只是闡述，而不是限制本發明的范圍。
[0055] 本發明中：
[0056]材料與試劑
[0057] 磷脂酰膽堿DMPC(14 : 0/14 : 0)和磷脂酰乙醇胺DPTO(15 : 0/15 : 0)標準品：美國 八￥&111:;[公司；甲醇、乙腈及甲酸：美國51811^-六1(11'；[(311公司，色譜純 ；2,5-二羥基苯甲酸 (DHB):美國Sigma-Aldrich公司，質譜級;挪威三文魚購買自杭州物美超市，新鮮度佳。準確 稱取DMPC(14:0/14:0)、DPPE(15:0/15:0)標準品各O.Olg，用甲醇/氯仿（1:1，v/v)溶解于 10mL棕色容量瓶并定容，分別配置成1.0mg/ml的儲備液至于4~6°C冷藏備用；稱取30mg DHB溶解于70%甲醇水溶液并定容至lmL，備用。
[0058]儀器與設備
[0059] AB4800串聯飛行時間質譜儀:美國Ab Sciex公司產品，配有基質輔助激光解吸離 子源(MALDI)、200Hz三倍頻Nd: YAG脈沖355nm激光及4000Series Explorer數據處理系統； Mi 11 iplus 2150超純水處理系統：美國Mi 11 ipore公司產品。
[0060]實施例1、一種三文魚中磷脂分子的檢測方法，依次進行以下步驟：
[0061 ] 1)、樣品前處理
[0062]取l.Og三文魚肉洗凈后研磨成糜作為均質后的三文魚肌肉組織樣品放入5mL離心 管，加入18mL氯仿/甲醇混合液（l:2，v/v)后震蕩混勻。探頭式超聲（25kHz)冰浴提取10分 鐘，完畢后向離心管加入12 . 5mL純水并震蕩混勻。混合物用冷凍離心機（美國 ThermoScientif ic公司）于4°C以8000rpm離心15分鐘，離心后離心管內溶液上下分層，三文 魚肌肉組織樣品則呈餅狀居于兩相中間。用移液槍將下相溶液轉移到另一個新的移液管， 繼續向上相和樣品中加入6mL氯仿并重復上述操作提取兩次。將三次提取的有機相合并，用 氮氣低溫吹干，并用甲醇水溶液（甲醇的體積濃度為70 % ) lml復溶;復溶后過0.22mi的PTFE 濾膜，得脂質粗提物。
[0063] 2)、富集和凈化
[0064]固相萃取柱包含空管，上下篩板，篩板中間的固相萃取柱填料為二氧化硅/二氧化 鈦殼核復合材料(l〇〇mg);
[0065] SPE柱使用前預先分別用3mL甲醇、50%甲醇水溶液、乙腈進行活化和平衡。用移液 槍取脂質粗提物1〇〇此后上樣，并以0.6mL/min流速通過柱床。用10 %乙腈3ml清洗SPE柱，棄 去淋洗液后用90%乙腈lmL進行洗脫，收集洗脫液。
[0066]淋洗和洗脫時的流速均為0.6mL/min，所得的洗脫液為磷脂提取液。
[0067] 3)、質譜檢測
[0068] 分別取100此磷脂提取液和lOOyL DHB基質加入到1.5mL的離心管中，振蕩混勻后 靜置;將〇.5yL溶液點在MALDI點樣板上，于空氣中干燥結晶后進行質譜分析。正離子反射模 式，加速電壓20kV，離子萃取時間延遲450ns，掃描范圍為450-1000m/z，激光能量可調整到 高于建議閾值的5-10%。質譜數據采集使用4000Series Explorer v3.5.2(美國AB Sciex 公司），所有譜圖均經同位素校正，確保微量磷脂的離子峰不受其他高濃度磷脂離子峰干 擾。
[0069] 結果如下：
[0070] 一、分別取6份預處理空白樣品（即，磷脂提取液），添加高中低3個水平的DMPC和 DPPE標準溶液，進行方法學驗證，每個加標水平下做6次平行，計算方法的日內精密度和回 收率，連續測定5天，計算日間精密度。各化合物平均加標回收率在74%到83%之間，相對標 準偏差〈7 %，日內和日間精密度的相對標準偏差<8.5 %。
[0071]表1、不同標準品濃度下基質輔助激光解吸質譜磷脂質組學方法的精密度與回收 率
[0073]二、質譜檢測結果如下：
[0074] 共鑒定出磷脂分子種28種，其中信號最強為m/z 806.40，經鑒定是[?038:6+扣+和
[PE38:4+K]+的重疊。實驗還發現，三文魚中高不飽和磷脂種類豐富，如m/z 824.38([PC38: 8+Na]+和[?￡42:5+11] + )，832.41([?040:7+11] +，[?038:4+似]+和[?￡40:5+11] + )等。部分磷脂分 子種更是達到了滿不飽和度，如[PC42:11+H] +，其sn-1和sn-2上兩條脂肪酸鏈分別為二十 碳五烯酸鏈(EPA-)和二十二碳六烯酸鏈(DHA-)。
[0075] 定量結果顯示m/z 806? 40([PC38:6+H]+和[PE38:4+K] + )的總量占了 1/5以上，m/z 826.41，852.38，856.40和878.39雙鏈均為EPA或DHA鏈的磷脂占12.38%。實驗結果表明，三 文魚磷脂種類豐富，多不飽和磷脂含量非常高。PC總量為98.2yg/g，PE總量為87.6yg/g。
[0076] 備注說明：譜圖經4000Series Explorer軟件process-centroid后，得到各個峰 的面積A。基于原理共價化合物在質譜離子化過程中離子化效率取決于其偶極電勢，磷脂的 偶極電勢主要集中在其極性基團，而脂肪酸鏈的偶極電勢可忽略不計，故同類磷脂的離子 峰強度只與其濃度有關。已知標準品DMPC(14:0/14:0)的峰面積(Admpc)、濃度(Cdmpc)，及峰x 的峰面積(Ax)，可計算峰x的濃度(Cx)為：
[0078] PC 的總量為 C = Ci+C2+……+Cn
[0079]同理根據標準品DPPE可計算各個PE分子的含量與總量。
[0080]表2、三文魚中主要磷脂及其含量
[0082]
[0083]驗證實驗1、將實施例1所用的三文魚按照目前常規的液相色譜質譜法進行檢測， 所得結果為PC總量為101 ? 3yg/g，PE總量為91 ? 2yg/g。
[0084] 部分的主要磷脂及其含量如表3所示。
[0085] 表 3
[0088] 其余結果與表2基本無差異。
[0089] 對比例1、將實施例1步驟2)中的二氧化硅/二氧化鈦殼核復合材料改為C18;重量 不變;其余等同于實施例1。
[0090] 所得結果如下：PC總量為61.9yg/g，PE總量為38.2yg/g。
[0091] 部分的主要磷脂及其含量如表4所示。
[0092] 表 4
[0093]
[0094] 對比例2、將實施例1步驟2)中的淋洗液由"10%乙腈"改成"20%乙腈"。體積量不 變;其余等同于實施例1。
[0095] 所得結果如下:PC總量為51.3yg/g，PE總量為32.2yg/g。
[0096] 部分的主要磷脂及其含量如表5所示。
[0097] 表 5
[0099] 對比例3、將實施例1步驟2)中的洗脫液由"90%乙腈"改成"70%乙腈"，體積量不 變，其余等同于實施例1。
[0100] 所得結果如下:PC總量為63.3yg/g，PE總量為43.7yg/g。部分的主要磷脂及其含量 如表6所示。
[0101] 表6
[0103]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發 明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容 直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 三文魚中磷脂分子的檢測方法，其特征是包括以下步驟： 1) 、樣品前處理： 將三文魚肉洗凈后研磨成糜，在三文魚肉糜中加入有機溶劑I后震蕩混勻;超聲冰浴提 取，提取完畢后向加入純水并震蕩混勻； 所得的混合物用冷凍離心機離心，移取下相溶液，將該下相溶液低溫干燥后，用有機溶 劑Π 復溶，得脂質粗提物； 有機溶劑I為甲醇:氯仿= 1:0.5~2體積比的混合液，三文魚肉糜與有機溶劑I的料液 比為I g/15~30ml;所加入純水的量為有機溶劑I的0.5~1體積倍； 所述有機溶劑Π 為體積濃度多30 %的甲醇水溶液或甲醇； 2) 、富集和凈化： 先對固相萃取柱進行活化處理;然后將脂質粗提物經上樣、淋洗、洗脫;所收集的洗脫 液為磷脂提取液； 3) 、將磷脂提取液進行質譜檢測分析。2. 根據權利要求1所述的三文魚中磷脂分子的檢測方法，其特征是： 所述步驟3)為： 將磷脂提取液與DHB基質等體積比混合后的所得物在點樣板上點樣，于空氣中干燥結 晶后進行質譜分析;正離子反射模式，加速電壓20kV，離子萃取時間延遲450ns，掃描范圍為 450~1000m/z;質譜數據采集使用4000Series Explorer，所有譜圖均經同位素校正，確保 微量磷脂的離子峰不受其他高濃度磷脂離子峰干擾。3. 根據權利要求1所述的三文魚中磷脂分子的檢測方法，其特征是： 所述步驟1)中，以移取下相溶液后的離心所得物替代三文魚肉糜，以機溶劑I中的氯仿 替代機溶劑I;再重復提取1~3次;將所有提取后所得的下相溶液合并后進行后續的干燥和 復溶。4. 根據權利要求1~3任一所述的三文魚中磷脂分子的檢測方法，其特征是： 所述步驟1)中超聲條件為25kHz。5. 根據權利要求1~3任一所述的三文魚中磷脂分子的檢測方法，其特征是： 所述步驟2)中，有固相萃取柱填料為二氧化硅/二氧化鈦殼核復合材料； 淋洗液為有機溶劑m水溶液或水，有機溶劑m水溶液中有機溶劑m的體積濃度< 1 〇 %，有機溶劑m為甲醇、乙腈； 洗脫液為有機溶劑IV水溶液或有機溶劑IV，有機溶劑IV水溶液中有機溶劑IV的體積濃 度多75%，有機溶劑IV為甲醇、乙腈。6. 根據權利要求5所述所述的三文魚中磷脂分子的檢測方法，其特征是： 所述步驟2)中，上樣、淋洗和洗脫的流速均為0.2~2mL/min。7. 根據權利要求1~3任一所述所述的三文魚中磷脂分子的檢測方法，其特征是： 所述步驟3)中，在點樣板上的點樣量為0.5~IyL。8. 根據權利要求1~3任一所述所述的三文魚中磷脂分子的檢測方法，其特征是： 所述步驟1)中，用冷凍離心機離心為:于4°C、8000rpm離心15分鐘。9. 根據權利要求1~3任一所述所述的三文魚中磷脂分子的檢測方法，其特征是： 所述步驟1)中，三文魚肉糜與復溶用的有機溶劑Π 的料液比為lg/Ι~2ml。
【文檔編號】G01N27/64GK105911131SQ201610431623
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月17日
【發明人】沈清, 戴志遠, 金仁耀, 馮俊麗, 薛靜, 陳康
【申請人】浙江工商大學