一種補骨脂酚電化學檢測方法及其專用er-go/gce修飾電極的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種補骨脂酚電化學檢測方法，具體為制備中藥材或中成藥制劑的供試液，采用ER?GO/GCE修飾電極作為工作電極對供試液進行檢測分析，確定補骨脂酚含量。結果顯示本發明提供的ER?GO/GCE修飾電極對于補骨脂酚具有良好的電催化活性，線性范圍寬，電流響應速度快，檢測限低，靈敏度高，抗干擾能力強，重現性和穩定性好，并成功應用于不同產地中藥補骨脂中補骨脂酚含量檢測。成功建立了一種快速、靈敏測定中藥補骨脂中補骨脂酚含量的新方法。
【專利說明】
一種補骨脂酚電化學檢測方法及其專用ER-GO/GCE修飾電極
技術領域
[0001] 本發明涉及一種中藥活性成分檢測方法，更具體的說涉及補骨脂酚電化學檢測方 法及其專用ER-G0/GCE修飾電極。 技術背景
[0002] 補骨脂為豆科植物補骨脂(Psoralea corylifolia L.)的干燥成熟果實，在唐宋 時期引種到中國，沿用歷史悠久，早在《開寶本草》中就有其溫腎助陽、納氣平喘、溫脾止瀉 的記載，民間常以破故紙、婆固脂、胡韭子、黑故子等別名沿用。國外主要分布于印度、緬甸、 斯里蘭卡等，國內主要分布于山西、陜西、安徽、浙江、江西、河南、湖北、廣東、四川、貴州、云 南等地區。具有溫脾止瀉、補腎壯陽、固精縮尿等功效，常用于治療脾虛寒瀉、腎虛陽痿、遺 精尿頻、腰膝冷痛等。現代藥理研究表明，補骨脂具有顯著的免疫調節、抗腫瘤、肝藥酶誘 導、壯骨、抗抑郁、抗過敏等作用。此外，補骨脂是常見的藥食同源的大宗藥材，在食品與保 健品開發中具有很好的應用價值，并在驅殺害蟲、日用化工、改良土壤等方面具有可觀的應 用。
[0003] 補骨脂中的主要化學成分包含香豆素類、黃酮類、單萜酚類、脂類、揮發油、樹脂、 皂苷等。1966年，Mehta等從醚提物中分離得到補骨脂酚。姚祥珍等根據對補骨脂生品、老品 及新品的藥效和毒性研究，提出補骨脂酚含量與補骨脂的毒性可能存在一定的聯系。迄今 為止，關于補骨脂酚質量評價的研究報道較少，為了有效控制補骨脂的質量，確保臨床療 效，有必要建立一系列快速、靈敏的檢測方法以實現對中藥補骨脂的質量控制。目前，補骨 脂中補骨脂酚含量的測定方法有氣象色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、HPLC-UV、超高 效液相色譜-質譜聯用等。與傳統方法相比，電化學方法具有省時、廉價、制備簡單、操作簡 單、靈敏度高、選擇性好、能夠實現微型化和在線檢測等優點，在中草藥活性成分等檢測上 逐漸引起了關注。
[0004] 石墨烯，一種二維碳材料，是一種由碳原子以SP2雜化組成的六角型呈蜂巢晶格的 平面薄膜，由于其獨特的物理和化學性質而受到廣泛的關注，例如:大的比表面積，化學穩 定性，良好的導電性及機械強度。可以通過多種方法獲得石墨烯，但是，大部分的石墨烯是 通過電化學還原氧化石墨烯(G0)制得。電化學方法是目前認為最為環保的石墨烯制備方 法。電化學還原氧化石墨烯(ER-G0)是一種簡單、廉價、有效和環保的制備石墨烯的電化學 方法。到目前為止，尚未有ER-G0修飾電極用于補骨脂中補骨脂酚含量檢測的報道。
[0005] 本研究利用具有良好電催化性能、良好導電性、大的比表面積和良好生物相容性 的G0,通過一步電化學聚合法，成功制備了一種快速、靈敏、抗干擾能力強的補骨脂酚電化 學傳感器，并成功應用于不同產地中藥補骨脂中補骨脂酚含量分析，建立了一種快速、靈敏 測定中藥補骨脂中補骨脂酚含量的新方法。
【發明內容】
[0006] 針對上述問題，本發明提供了一種補骨脂酚電化學檢測方法及其專用ER-G0/GCE 修飾電極。
[0007] 其中，補骨脂酚電化學檢測方法具體為制備中藥材或中成藥制劑的供試液，采用 ER-G0/GCE修飾電極作為工作電極對供試液進行檢測分析(具體模式參見圖1所示），確定補 骨脂酚含量。
[0008] 所述檢測分析的方法是采用差分脈沖伏安法，其參數為電位梯度:0.004V;振幅： 0.05V;脈沖寬度:0.05s;脈沖間隔:0.2s。
[0009] 補骨脂酚電化學檢測的專用ER-G0/GCE修飾電極，包括以下步驟：
[0010] 1)將直徑為3mm的GCE，在含有0.05WI1氧化鋁泥漿的麂皮上打磨至出現光滑的鏡 面，隨后依次用去離子水、無水乙醇和去離子水中各超聲5分鐘清洗電極。鉑絲電極要用酒 精燈灼燒除去表面的雜物，再依次用乙醇、丙酮沖洗，自然晾干后得到預處理GCE裸電極；
[0011] 2)稱量G0,分別加入不同量的去離子水，加入O.lmoL I/1的LiCl〇4,不斷攪拌，混合 均勾，制得O.lmg mL-\0.3mg mL-\0.5mg mL-\l.0mg mL-\l.5mg mL-1 和2.0mg mL-1 的G0分 散液；
[0012] 3)采用一步電化學聚合，在預處理裸GCE電極表面，-1.5V電化學聚合400s制得ER- G0/GCE修飾電極。
[0013] 所述預處理裸GCE電極或ER-G0/GCE修飾電極的電化學阻抗表征為:在經典的三電 極體系中測試過程中工作電極為GCE裸電極或ER-G0/GCE修飾電極，對電極為直徑為1mm鉑 絲，參比電極則是飽和甘汞電極(SCE);將三電極體系置于含有5mM的[Fe(CN) 6]4-/3-的0.1M KC1底液中，頻率范圍為100mHz-10kHz。
[0014] 所述的補骨脂酚電化學檢測方法在檢測補骨脂藥材或含有補骨脂酚制劑中的補 骨脂酚的應用。
[0015] 本發明的有益技術效果是:本研究利用氧化石墨烯良好導電性、大的比表面積和 良好電催化活性，通過一步電化學聚合的方法成功的制備了一種快速、靈敏、抗干擾能力強 的補骨脂酚電化學傳感器，通過掃描電子顯微鏡(SEM)、循環伏安法(CV)、差示脈沖伏安法 (DPV)和電化學交流阻抗(El S)等對ER-G0/GCE修飾電極的表面形貌和電化學性能進行研 究，研究了補骨脂酚在修飾電極上的電化學行為，結果顯示該修飾電極對于補骨脂酚具有 良好的電催化活性，線性范圍寬，電流響應速度快，檢測限低，靈敏度高，抗干擾能力強，重 現性和穩定性好，并成功應用于不同產地中藥補骨脂中補骨脂酚含量檢測。成功建立了一 種快速、靈敏測定中藥補骨脂中補骨脂酚含量的新方法。
【附圖說明】
[0016] 圖1 ER-G0/GCE電化學檢測補骨脂酚示意圖；
[0017]圖2 (A)富集時間和(B)G0濃度對含有20yM補骨脂酚的0.1M PBS(pH 6.0)溶液在 ER-G0/GCE的電流響應的影響；
[0018]圖3在含有補骨脂酚的0.1M PBS(pH 6.0)中，pH值對陽極峰電流(a)和陽極峰電位 (b)的影響；
[0019]圖4 (A)不同濃度的補骨脂酚對ER-G0/GCE的DPV曲線。補骨脂酚的濃度(從下往 上）：0.000、0.048、0.38、0.98、1.38、3.88、5.68、7.88、13.8、21.4、25.5、33.1、41.5和55處； (B)標準曲線圖。支持電解質為0.1M PBS(pH 6.0);富集時間：120s。
【具體實施方式】
[0020] 實施例1 ER-G0/GCE修飾電極的制備 [0021] 1.電極的預處理
[0022]修飾電極前，將裸玻碳電極(GCE，〇 =3mm)在含有0.05m氧化鋁泥漿的麂皮上打 磨至出現光滑的鏡面，隨后依次用去離子水、無水乙醇和去離子水中各超聲5分鐘清洗電 極。鉑絲電極要用酒精燈灼燒除去表面的雜物，再依次用乙醇、丙酮沖洗，自然晾干后使用。 [0023] 2.修飾電極的制備
[0024] 稱量一定量G0,分別加入不同量的去離子水，加入O.lmoL L-1的LiCKk，不斷攪拌， 混合均勻，制得不同濃度的G0分散液，濃度分別為O.lmg mL'OJmg mL'O.Smg ml/1、 l.Omg mL'l.Smg ml/1和2.0mg ml/1。采用一步電化學聚合，在GCE表面，-1.5V電化學聚合 400s制得ER-G0/GCE。室溫干燥備用。
[0025] 3.電化學性能測試和阻抗表征
[0026]修飾電極的電化學性能測試、參數的優化和阻抗表征均在CHI660B電化學工作站 控制下進行，采用經典的三電極體系。測試過程中工作電極為修飾電極或裸GCE(?=3mm)， 對電極為鉑絲（? = lmm)，參比電極則是飽和甘汞電極(SCE)。電化學阻抗表征:將三電極體 系置于含有5mM的[Fe(CN)6] 4V3-的0.1M KC1底液中，頻率范圍為lOOmHz-lOkHz。
[0027] 按不同的時間將ER-G0/GCE浸入到含有20yM補骨脂酚的0.1MPBS(pH 6.0)溶液中。 如圖所示，峰電流隨著富集時間的增加逐漸變大，最終在120 s時達到飽和。因此，120 s被選 作最佳的富集時間。富集時間對補骨脂酚在ER-G0/GCE上的陽極峰電流的影響，如圖2(A)所 不。
[0028] G0的濃度分別是0 ? lmg mL-1、0 ? 3mg mL-工、。? 5mg mL-工、1 ? Omg mL-1、1 ? 5mg mL-1 和 2. Omg ml/1。從圖中看到，峰電流隨著GO濃度的增加而增大，最終在1. Omg ml/1達到最大值， 可能是因為隨著電極表面G0濃度的增加，電化學活性物質增加所致。然而，隨著G0濃度從 l.Omg ml/1增加到2.Omg ml/1，氧化峰電流卻急劇減小，可能是因為膜的厚度阻礙了分析物 與電極之間的電子轉移。因此，1. 〇mg ml^GO為最佳濃度。實驗過程中富集時間為120s，G0濃 度對補骨脂酚電流響應的影響，如圖2(B)所示。
[0029] 通過0?￥來研究口11值對￡1^0/^￡檢測補骨脂酚的影響411值范圍為4.0-9.0內。從 圖3(a線）中可以看出，補骨脂酚在ER-G0/GCE上的氧化峰電流隨著pH值增大而逐漸增大，在 pH 6.0達到最大值，當pH值進一步增大時，電流反而減小。這可能與堿性介質導致補骨脂酸 降解和H+參與到補骨脂酚的不可逆還原有關。因此，pH 6.0選作補骨脂酚檢測的最佳pH值。 氧化峰電位(EP)與pH值的關系，圖3(b線)所示，EP隨著pH值的增加而降低，關系式為:E P(V) =-0 ? 0595pH+0 ? 724(R2 = 0 ? 991)。等式的斜率59 ? 5mV pH-1 與理想值58 ? 5mV pH-1 相近的，表 明此電化學反應是等質子和等電子參與的反應。
[0030] 實施例2補骨脂酚的檢測
[0031]本研究中采用的檢測方法均為差分脈沖伏安法。檢測前用移液槍移取5mL PBS (0.1M)溶液，通入氮氣10min除氧后，用移液槍或微量注射器向密閉的電化學反應池中不斷 地添加一定濃度的檢測物質。差分脈沖伏安法的實驗參數:電位梯度:0.004V;振幅:0.05V; 脈沖寬度:0.05s;脈沖間隔:0.2s。
[0032] DPV法在痕量檢測與分析中具有非常高的靈敏度，因此選用DPV法檢測補骨脂酚的 含量。圖4(A)是在最佳條件下，不同濃度的補骨脂酚在ER-G0/GCE的DPV響應曲線，檢測前修 飾電極分別在不同濃度補骨脂酚中富集120s。如4(B)圖所示，峰電流與補骨脂酚的濃度在 濃度范圍0.004-55處成比例，線性方程式為：I (yA) = 1.047+0.279C(yM) (R2 = 0.998)，最低 檢測限為〇.〇12yM(S/N=3)。富集時間較短，線性范圍寬，檢測限低和靈敏度高。可嘗試將制 備的修飾電極應用于實際樣品中藥補骨脂中補骨脂酚的含量檢測。
[0033] 在同一條件同種方法下制備5支修飾電極，分別對補骨脂酚進行電化學檢測，五次 單獨檢測的相對標準偏差(RSD)為2.5%。將每根修飾電極分別對補骨脂酚連續檢測30次， 檢測結果所得RSD為2.6%。結果表明ER-G0/GCE具有良好的重復性。
[0034]在最優實驗條件下，通過干擾實驗評估ER-G0/GCEE的選擇性，對檸檬酸、草酸、抗 壞血酸、葡萄糖、賴氨酸、尿素、甘露醇以及Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Ni 2+、Zr2+、Al3+、Fe3+、S〇42-、 ?0 43'勵32_、〇)22等物質均無響應，補骨脂酚的峰電流變化小于5%(98.6-104.3%)，說明此 修飾電極具有很好的選擇性。
[0035] 實施例3不同產地中藥補骨脂中補骨脂酚的檢測
[0036] 因制備的ER-G0/GCE具有很好的靈敏度、穩定性和選擇性，此電化學傳感器可以用 于實際樣品分析。將市場上購買的不同產地(浙江、四川、云南、安徽、江西）中藥材補骨脂洗 凈、烘干、稱重〇. 25g、研磨，置于50mL容量瓶中，然后加入30mL甲醇，超聲lh，室溫冷卻定容。 通過標準加入法進行實驗。實驗結果如表3所示，相對標準偏差小于5%，表明了未經樣品純 化過程，制備的傳感器仍可用于中藥材秦皮中補骨脂酚含量的分析，結果表明此方法對于 檢測實際樣品中的補骨脂酚是準確的、適當的和有效的。
[0037] 表3中藥材補骨脂中補骨脂酚含量的檢測結果(n = 5)
[0039]本研究利用氧化石墨烯良好導電性、大的比表面積和良好電催化活性，通過一步 電化學聚合的方法成功的制備了一種快速、靈敏、抗干擾能力強的補骨脂酚電化學傳感器， 通過SEM、CVs、DPV和EIS等對ER-G0/GCE修飾電極的表面形貌和電化學性能進行研究，研究 了補骨脂酚在修飾電極上的電化學行為，結果顯示該修飾電極對于補骨脂酚具有良好的電 催化活性，線性范圍寬，電流響應速度快，檢測限低，靈敏度高，抗干擾能力強，重現性和穩 定性好，并成功應用于不同產地中藥補骨脂中補骨脂酚含量檢測。成功建立了一種快速、靈 敏測定中藥補骨脂中補骨脂酚含量的新方法。
【主權項】
1. 一種補骨脂酚電化學檢測方法，其特征在于:具體為制備中藥材或中成藥制劑的供 試液，采用ER-GO/GCE修飾電極作為工作電極對供試液進行檢測分析，確定補骨脂酚含量。2. 根據權利要求1所述的補骨脂酚電化學檢測方法，其特征在于:所述檢測分析的方法 是采用差分脈沖伏安法，其參數為電位梯度:0.004 V;振幅:0.05 V;脈沖寬度:0.05 s;脈 沖間隔:0.2 s。3. -種補骨脂酚電化學檢測的專用ER-GO/GCE修飾電極，其特征在于:所述專用ER-GO/ GCE修飾電極的制備方法包括以下步驟： 1) 將直徑為3 mm的GCE，在含有0.05 μπι氧化鋁泥漿的麂皮上打磨至出現光滑的鏡面， 隨后依次用去離子水、無水乙醇和去離子水中各超聲5分鐘清洗電極； 鉑絲電極要用酒精燈灼燒除去表面的雜物，再依次用乙醇、丙酮沖洗，自然晾干后得到 預處理裸GCE電極； 2) 稱量G0,分別加入不同量的去離子水，加入0.1 moL I/1的LiCKk，不斷攪拌，混合均 勾，制得0.1 mg mL-^0.3 mg mL-^0.5 mg mL-1J-O mg mL-^1.5 mg mL-1 和2.0 mg mL-1 的 GO分散液； 3) 采用一步電化學聚合法，在預處理裸GCE電極表面，-I.5 V電化學聚合400 s制得 ER-GO/GCE修飾電極。4. 根據權利要求3所述的補骨脂酚電化學檢測的專用ER-GO/GCE修飾電極，其特征在 于:所述預處理裸GCE電極或ER-GO/GCE修飾電極的電化學阻抗表征為:在經典的三電極體 系中測試過程中工作電極為裸GCE電極或ER-G0/GCE修飾電極，對電極為直徑為I mm鉑絲， 參比電極則是飽和甘汞電極;將三電極體系置于含有5 mM的[Fe(CN)6]4V31^0.1 M KCl底 液中，頻率范圍為100 mHz-10 kHz。5. 權利要求1、2所述的補骨脂酚電化學檢測方法在檢測補骨脂藥材或含有補骨脂酚制 劑中的補骨脂酚的應用。
【文檔編號】G01N27/30GK105911121SQ201610452061
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月21日
【發明人】勵娜, 姚媛媛, 張小梅, 陳龍, 陳一龍, 梁旭明, 楊大堅
【申請人】重慶市中藥研究院