用于檢測α1-微球蛋白(AMG)的膠體金免疫比色法試劑盒及其制備方法
【專利摘要】一種檢測或監測α1-微球蛋白(AMG)的膠體金免疫比色法試劑盒及其制備方法，本發明屬于體外診斷試劑領域，用于判斷個體急性腎損傷的情況是否出現。本方法是以膠體金顆粒為載體，將α1-微球蛋白(以下均簡稱為AMG)抗體與膠體金顆粒進行偶聯，在相應的檢測裝置內，使樣品中的AMG蛋白與偶聯后的金顆粒接觸，形成抗原-抗體-金復合物，造成金顆粒在檢測波長下吸光度的改變，并且吸光度的改變量與AMG蛋白濃度程正相關，進而達到檢測樣本中AMG蛋白的目的。本試劑盒并且具備較高的分析靈敏度。
【專利說明】用于檢測a 1-微球蛋白（AMG)的膠體金免疫比色法試劑盒 及其制備方法 發明領域
[0001] 本發明屬于體外診斷試劑領域，具體涉及用于檢測a 1-微球蛋白（AMG)的膠體金 免疫比色法試劑盒 技術背景
[0002] a 1-微球蛋白（alpha-1-microglobulin，a 1-MG 或 AMG)是人體內的一種相對 分子量較小的糖蛋白，又稱人復合蛋白（humancomplex-Formingprotein，HCprotein)，由 Ekstrom等于20世紀70年代初首先從鎘中毒患者的尿液中分離、提純，因電泳時位于a 1 區帶故而得名。近幾年來國內外有關a 1-MG的生物學特性、檢測及臨床應用的研究日益增 多，發現a 1-MG的測定對各種腎臟疾病有重要價值。
[0003] 現代研究表明，a 1-MG是由人體的肝臟和淋巴細胞合成，分子量約為33000道爾 頓的糖蛋白。它由167個氨基酸組成.與人類白細胞抗原HLA-A 11，HLA-B20和HLA-51等 抗原決定簇有交叉反應。
[0004] a 1-MG廣泛存在于人體各種體液及淋巴細胞膜表面，血液中的a 1-MG以兩種形 式存在，即游離的a 1-MG和與IgA結合的a l-MG(a lMG-IgA)。正常情況下，a lMG-IgA約 占血液中總a 1-MG的40-70%，血液中免疫球蛋白水平對a 1-MG及a lMG-IgA之間的比例 有影響。血液中游離的a 1-MG可自由通過腎小球濾過膜，95%-99%在腎近曲小管重吸收 和代謝，只有微量從終尿排出；而結合型的a 1-MG則不能通過腎小球，其在尿液中的濃度 為零。
[0005] 在現代臨床研究中發現，對于原發性腎病患者中，血、尿a 1-MG可以分別作為腎 小球、腎小管早期功能損害的指標。通過監測血、尿a 1-MG的含量，并結合病理學檢查發現 a 1-MG在血、尿中的水平與腎功能的惡化有明顯的相關性，a 1-MG的含量在反映腎臟病理 變化的過程中具有高度的敏感性。
[0006] 另外在風濕性疾病的檢測中a 1-MG也是一個較為重要的指標，由于自身免疫系 統的病變，會造成免疫系統攻擊自身臟器，而腎臟最早被累及，對于及時發現自身免疫系統 的疾病，對阻止腎功能的衰竭具有較好的臨床意義。
【發明內容】
[0007] 本發明所要解決的問題是進一步提高檢測人體液樣本中AMG蛋白含量的分析靈 敏度，提供一種特異性好，靈敏度高的分析AMG蛋白的膠體金勻相免疫比色試劑盒，可以用 于精確測定體液樣本中0_200mg/L的AMG蛋白含量。另外本發明還在于提供一種關于AMG 蛋白檢測試劑盒的制備方法。
[0008] 為了解決上述問題，本發明采用膠體金勻相免疫反應法，檢測體液樣本中的AMG 蛋白含量。標記AMG抗體的膠體金顆粒在540nm處有最大吸收峰，當環境中存在AMG蛋白 時，會形成抗原-抗體-金復合物，而此時540nm處的最大吸收峰將隨著樣本濃度的升高而 減弱，且660nm處的最大吸收峰將隨之增加。通過檢測并計算540nm吸光度的減少和660nm 吸光度的增加，與已知濃度的樣本相聯系，進而形成校準曲線，從而即可達到定量測量體液 樣本中AMG蛋白的含量。
[0009] 本發明的主要技術路線如下：
[0010] -種關于AMG檢測膠體金勻相免疫檢測試劑盒，其主要的目的是用于檢測人個體 體液樣本中AMG蛋白的含量，本發明試劑盒中主要由用于形成校準曲線的已知AMG蛋白的 校準品（AMG校準品），反應緩沖液試劑（試劑1)，膠體金標記物試劑（試劑2)三部分組成。 其中AMG校準品是由校準品稀釋液和AMG蛋白按照一定比例配制成不同濃度梯度，其濃度 范圍為〇mg/L-200mg/L，反應緩沖液試劑是由磷酸鹽和牛血清白蛋白配制而成的能夠提供 本發明所需要的免疫學反應的且具有pH緩沖能力的溶液，膠體金標記物試劑是由金標記 的抗人源AMG蛋白的抗體和懸浮標記物的緩沖液組成。
[0011] 首先，根據試劑盒檢測需要制備主吸收峰為450nm± 10nm的膠體金顆粒。
[0012] 其次配制試劑1，其主要組成應為50mM PBS pH8. 0溶液，其中溶解有 PEG6000-20000,聚蔗糖400和牛血清白蛋白等多聚物或生物大分子中的一種物質或兩種 及其以上，并且控制pH值應在7. 0-9. 0之間。
[0013] 第三配制試劑2,其主要組成應為50mM PBS pH8. 0溶液，其中溶解有 PEG6000-20000,聚蔗糖400,吐溫20,牛血清白蛋白和Triton X-100等多聚物或生物大分 子中的一種物質或兩種及其以上，并且控制pH值應在7. 0-9. 0之間。將標記AMG抗體后的 金顆粒濃縮，并用此步驟配制的溶液復懸。用去離子水或超純水稀釋復懸后膠體金標記物 試劑（試劑2) 50倍后，并以去離子水或超純水做空白，在540nm± 10nm處的檢測吸光度，若 吸光度在〇. 2000Abs-0. 3000Abs的范圍內，則認為試劑2中標記AMG抗體的金顆粒濃度合 格，若不符合上述要求，則進一步調整試劑2中金顆粒濃度，直至符合要求。
[0014] 最終使用時，將AMG校準品（或樣本），試劑1和試劑2按照一定的比例和次序混 合，檢測吸光度的變化，即可反應出樣本中待檢測的AMG含量。
[0015] 使用本發明方法，具有高靈敏度特性，可以分析AMG含量在200mg/L以下的樣本。 本發明可以同時用于檢測不同基質的體液樣本，如血清，血漿，尿液中AMG蛋白的含量，不 需要對樣本或試劑做其它技術處理，包括增加或減少測試樣本量，增大或降低試劑1和試 劑2的比例，具備高靈敏度，高特異性，高準確度和良好的重復性等優點，適合于全自動生 化儀，半自動生化儀和紫外-可見光分光光度計使用。
[0016] 本發明主要目的在于提高對于人體液樣本中AMG蛋白含量檢測的特異性和分析 靈敏度，在本發明中通過控制標記物的反應條件和金顆粒的大小，以及合適的測量條件，從 而達到上述目的。
[0017] 具體而言，本發明可以提供一種高分析靈敏度的AMG檢測試劑盒，其主要特性在 于在Omg/L-12. 5mg/L的范圍內具備高分析靈敏度，在0mg/L-200mg/L的范圍內具備較好的 線性，對于臨床診斷而言具有較好的指導意義。其中試劑盒內包含的試劑1、試劑2和校準 品，以體積計算，校準品用量（或待測樣本用量）為2uL-10uL，試劑1用量為200uL-250uL， 試劑2用量為50uL-100uL。
[0018] 本發明中所述的金顆粒大小應以最大吸收峰和吸收峰峰寬控制，通過調整氯金酸 與還原劑的比例，使制的膠體金顆粒的最大吸收峰在540nm±20nm范圍內，優化條件使得 顆粒大小進一步得到控制，制的的膠體金顆粒的最大吸收峰在540nm± lOnm范圍內，進一 步對實驗條件優化，制的膠體金顆粒的最大吸收峰在540nm±5nm的范圍內，此時膠體金顆 粒大小最為合適。
[0019] 本發明中所闡述的膠體金勻相試劑1和試劑2中，其緩沖液選用PBS緩沖液，pH 值控制在7. 0-9. 0間，進一步通過實驗優化緩沖條件，pH值控制在7. 5-8. 5間，AMG蛋白 與標記的抗體反應較為合適，再進一步優化實驗條件發現，pH控制在8.0±0.2時，AMG蛋 白與標記的抗體反應最為合適。并且在試劑1中所述的多聚物和生物大分子主要包括 PEG6000-20000,聚蔗糖400和牛血清白蛋白，并在其中加入含量約為0. 1% (質量體積比） 的疊氮鈉。試劑2中所述的多聚物和生物大分子PEG6000-20000,聚蔗糖400,吐溫20,牛血 清白蛋白和Triton X-100,并在其中加入含量約為0.1% (質量體積比）的疊氮鈉。在試 劑2中，標記后的抗體在試劑2中的含量以吸光度的方式進行控制，即將含有標記物的試劑 2用去離子水或超純水稀釋50倍以后，以去離子水或超純水做空白（參比），檢測540nm下 的吸光度應在〇. 20Abs-0. 25Abs范圍內。試劑2中AMG抗體與膠體金的標記依靠金顆粒表 面帶電對AMG抗體的吸附而完成。
[0020] 本發明中所敘述的用于檢測或監測體液樣本中AMG蛋白含量的試劑盒，其中包括 AMG蛋白校準品和校準品稀釋液兩部分組成。校準品稀釋液由PBS緩沖液、牛血清白蛋白和 疊氮鈉組成，其中PBS緩沖液控制pH值在7. 0-9. 0之間，優化后的pH控制在8. 0±0. 5,添 加牛血清白蛋白和疊氮鈉的量為0. 1% -0. 5% (質量體積比）。校準品由校準品稀釋液稀 釋 AMG 蛋白純品制成，含量為 Omg/L，12. 5mg/L，25mg/L，50mg/L，100mg/L，200mg/L。
[0021] 本發明中采用膠體金勻相免疫比色法測定樣本中的AMG蛋白的含量。標記有顆 粒均一，大小合適金顆粒的AMG抗體，與樣本中的AMG蛋白，在緩沖液中形成AMG蛋白-抗 體-金具有三維結構的復合物，從而使原本金顆粒在540nm的吸光度減弱，并且在660nm處 的吸光度加強，通過將這種改變與校準品中已知的AMG蛋白濃度相對應，進而形成檢測系 統的校準曲線，當未知AMG蛋白濃度的體液樣本以同樣的反應模式與標記物反應時，通過 計算上述吸光度的改變，對應校準曲線從而達到定量測量的目的。
【附圖說明】
[0022] 圖1本發明試劑與對照試劑線性驗證結果，以稀釋度為橫坐標，以檢測結果為縱 坐標作圖，本發明試劑具有優于同類檢測項目試劑盒線性的特點。
[0023] 圖2本發明試劑與對照試劑校準曲線實驗結果，樣本中AMG蛋白含量每變化一個 濃度單位，本發明試劑的吸光度信號變化為對照試劑的約6. 5倍，本發明靈敏度明顯優于 對照試劑。
[0024] 圖3標記物沉降檢測實驗結果，本發明試劑標記物在40天內未發生明顯沉降。
【具體實施方式】
[0025] 實施例
[0026] 本發明中若不做特殊說明，則表述含量的百分比濃度均表示質量體積比，即 g/100mL
[0027] 實施例1
[0028] AMG校準品的制備
[0029] 用重組人AMG蛋白（DAK0公司）溶于校準品稀釋液（牛血清白蛋白0. 5%，疊氮 鈉0. 1%，PBS緩沖液pH 8.0)制備出不同濃度梯度的校準品，采用九強AMG膠乳免疫比色 試劑盒檢測配制校準品，每個濃度梯度檢測3次，取檢測結果的平均值，定值為Omg/L (校準 品稀釋液，未添加 AMG 蛋白），12. 5mg/L，25mg/L，50mg/L，100mg/L，200mg/L。
[0030] 反應緩沖試劑（試劑1)的制備
[0031] 取 80mL 50mM PBS pH8. 0 的緩沖液中加入 PEG6000-200005g，聚蔗糖-400 lg，牛 血清白蛋白〇. 5g，疊氮鈉0. lg，最終用相應的緩沖液定容至100mL，并用0. 22um微孔濾膜過 濾，即制成反應緩沖試劑（試劑1)，其中PEG6000-200005 %，聚蔗糖-4001 %，牛血清白蛋白 0. 5%，疊氮鈉 0. 1%。
[0032] 膠體金標記物試劑（試劑2)的制備
[0033] 膠體金標記物試劑（試劑2)的制備過程主要分為三部分，即標記物制備，空白緩 沖液的制備，標記物的復懸三個步驟。
[0034] 標記物的制備
[0035] 將市售的氯金酸和檸檬酸三鈉溶解，并分別配制成1 %的水溶液，將1L的去離子 水或超純水煮沸，接著加入10mL的氯金酸溶液保持沸騰約lmin后，加入10mL的檸檬酸三 鈉溶液，隨著時間的變化溶液再次沸騰，溶液顏色隨之由明黃色轉變為紫黑色，接著短時間 轉為酒紅色，之后保持沸騰l〇min后，冷卻備用。
[0036] 將制備好的的膠體金溶液用濃度為20 % 1(20)3溶液調整pH值至8. 0后，按比例加 如一定體積的AMG抗體（DAK0公司），充分攪拌lh，即完成抗體的標記過程。
[0037] 抗體標記完成以后，可用10% NaCl溶液檢查標記量是否合適，當按照1 : 10的體 積比例加入NaCl溶液后，當不出現黑色沉淀時的抗體最小用量，為最佳標記量。
[0038] 標記物空白緩沖液的制備
[0039] 取 80mL 50mM PBS pH8. 0 的緩沖液中加入 PEG6000-2000020g，聚蔗糖-400 5g，牛血清白蛋白0. 5g，疊氮鈉0. lg，吐溫20 lg，Triton X-100 lg，最終用相應的緩 沖液定容至100mL，并用0. 22um微孔濾膜過濾，即制成反應緩沖試劑（試劑1)，其中 PEG6000-2000020%，聚蔗糖-400 5%，牛血清白蛋白0.5%，疊氮鈉0.1%，吐溫20 1%， Triton X-100 1%〇
[0040] 標記物復懸
[0041] 將標記好的膠體金顆粒在6000rpm下離心40min，收集沉淀，之后用上述標記物空 白緩沖液復懸收集的沉淀，并將濃度按照本發明的權利要求（4)將標記物調整至合適的濃 度即可。
[0042] 線性驗證
[0043] 1、取一例具有急性腎損傷表象的臨床病人血清樣本約2mL，向其中加入人源的 AMG蛋白純品，制得一線性高值樣本。
[0044] 2、選用市場上技術較為成熟的AMG蛋白膠乳微球比濁法試劑盒做對照試劑，在東 芝120FR全自動生化儀上錄入膠乳比濁法對照試劑盒參數，并用其試劑盒配套校準品校準 其試劑，檢測上述高值樣本三次，已三次檢測結果的均值196mg/L為最終定值結果。
[0045] 3、在東芝120FR全自動生化儀上，錄入本發明的實驗參數，并用已經校正的校準 品經行試劑校準。
[0046] 4、將上述的線性高值樣本用生理鹽水做倍比稀釋，稀釋比例為1/2,1/4,1/8， 1/16,1/32,1/64,與原線性高值樣本組成一個梯度樣本組。
[0047] 5、用上述對照試劑和本發明的試劑分別檢測上述樣本，每個試劑每個樣本檢測三 次，以三次結果均值最終的檢測結果，然后比較本發明和再對照試劑的線性，結果表1和圖 1所示。
[0048] 表1線性驗證結果
[0050] 表1為線性實驗結果數據統計，在本發明和對照試劑盒的檢測范圍內，將高值樣 本倍比6次稀釋，用對照試劑和本發明試劑分別檢測
[0051] 分析靈敏度驗證
[0052] 1、選用市場上技術較為成熟的AMG蛋白膠乳微球比濁法試劑盒做對照試劑，在東 芝120FR全自動生化儀上錄入膠乳比濁法對照試劑盒參數，并用其試劑盒配套校準品校準 其試劑。
[0053] 2、在東芝120FR全自動生化儀上，錄入本發明的實驗參數，并用已經校正的校準 品經行試劑校準。
[0054] 3、比較兩個試劑在12. 5mg/L以下濃度的校準點吸光度的變化，結果如表2和圖2 所示。注：由于對照試劑與本發明試劑的檢測原理不相同，所以在繪制圖2時將對照試劑吸 光度變化做相反數處理。
[0055] 表2分析靈敏度實驗結果
[0056]
[0057] 表2為分析靈敏度實驗結果數據統計，實驗樣分析本發明試劑和對照試劑分析靈 敏度，
[0058] 標記物沉降監測
[0059] 由于標記物溶液為膠體溶液，所以在長時間靜止放置后應驗證其是否發生顆粒沉 降現象。本例目的在于驗證本發明是否會存在標記物沉降現象。
[0060] 1、取兩只50mL燒杯，用酸性重鉻酸鉀浸泡24小時后，用去離子水清洗干凈，100°C 烘干處理4h。
[0061 ] 2、將對照試劑盒中的標記物試劑倒入其中一只燒杯中，將本發明試劑標記物倒入 另一只燒杯中，兩只燒杯同時攪拌lh。
[0062] 3、用微量移液器在溶液表面2-5mm處分別吸取對照試劑和本發明試劑各60uL，并 用去離子水稀釋只至3mL，震蕩混合均勻。
[0063] 4、以去離子水作為參比，在540nm處檢測兩試劑標記物稀釋后的吸光度，每個試 劑檢測三次，以三次結果的均值，作為最終檢測結果。
[0064] 5、將上述兩只燒杯封口，2_8°C下靜置每隔10天檢測一次，重復上述步驟3和步驟 4,對比靜置前后吸光度變化，實驗結果如表3和圖3所示。
[0065] 表3標記物沉降監測實驗結果
[0067] 標記物對反應杯污染實驗
[0068] 由于標記物溶液為金顆粒膠體溶液，所以會在反應杯表面存在吸附現象。本例在 于驗證本發明試劑是否會出現吸附污染現象。
[0069] 取三只潔凈的石英比色杯，以空氣為參比，分別記錄其在540nm處杯空白吸光度。
[0070] 1、用本發明試劑標記物裝填比色杯至其3/5高度處，浸泡lh。
[0071] 2、取出標記物后，每只比色杯用去離子水反復清洗10次
[0072] 3、在每只比色杯中裝填去離子水至比色杯4/5高度處，每隔lh換水一次，共換水 三次。
[0073] 4、自然晾干比色杯中的水分，以空氣為參比，檢測每只比色杯在540nm處吸光度。
[0074] 5、對于對照試劑標記物重復上述步驟1至步驟5操作，比較兩試劑標記物是否會 對比色杯造成吸附污染，實驗結果如表4所示。
[0075] 表4標記物對比色杯污染實驗數據
[0076]
[0077] 根據實驗結果分析，對照試劑標記物長時間放置于比色杯中會吸附至比色杯表 面，本發明試劑標記物在相同時間內未對比色杯有明顯的吸附現象。
【主權項】
1. 一種AMG檢測膠體金勻相免疫檢測試劑盒，包括AMG校準品，反應緩沖液試劑，膠體 金標記物試劑，其特征在于一種勻相定量檢測檢體中AMG含量的基于膠體金比色法的體外 診斷試劑。2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于AMG校準品是由校準品稀釋液和AMG蛋 白按照比例配制成不同濃度梯度，其濃度范圍為0mg/L-200mg/L，反應緩沖液試劑是由磷酸 鹽與牛血清白蛋白配制而成的具有pH緩沖能力的溶液，膠體金標記物試劑是由金標記的 抗人源AMG蛋白的抗體和懸浮標記物的緩沖液組成。3. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于膠體金顆粒的主吸收峰為450nm± 10nm。4. 根據權利要求1-3所述的試劑盒，其特征在于反應緩沖液試劑是反應條件的控制性 溶液，包括50mM PBS pH8. 0溶液，PEG6000-20000,聚蔗糖400和牛血清白蛋白等多聚物或 生物大分子中的一種物質或兩種及其以上，并且控制反應緩沖液試劑的PH值為7. 0-9. 0。5. 根據權利要求1-3所述的試劑盒，其特征在于膠體金標記物試劑是反應條件的控制 性溶液，包括50mM PBS pH8. 0溶液，PEG6000-20000,聚蔗糖400,吐溫20,牛血清白蛋白和 Triton X-100等多聚物或生物大分子中的一種物質或兩種及其以上，將標記AMG抗體后的 金顆粒懸浮于此溶液中，并且控制pH值應在7. 0-9. 0之間，組成膠體金標記物試劑。6. 根據權利要求5所述的AMG試劑盒，其特征在于中標記AMG抗體的金顆粒濃度合格 的依據為離子水或超純水稀釋膠體金標記物試劑50倍后，以去離子水或超純水做空白，其 在540nm± IOnm處的吸光度的范圍為0. 2000Abs-0. 3000Abs。7. 根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于反應體系溶液組成為校準液或樣本、反 應緩沖液試劑和膠體金標記物試劑，其中樣本量范圍為2uL-20uL，反應緩沖液試劑的體積 應控制在2-10倍于膠體金標記物試劑的體積。8. 制備權利要求1-7任意一項所述的試劑盒，其特征在于AMG蛋白膠體金勻相檢測試 劑盒的制備方法，包括以下幾個步驟： 1) 將多聚物或生物大分子用去離子水或超純水溶解，配制成反應緩沖液試劑。 2) 將氯金酸與還原劑按照一定比例混合，隨之用去離子水或超純水加熱煮沸，制的主 吸收峰為450nm±10nm的膠體金顆粒。 3) 將待標記的AMG抗體與金顆粒相混合制成標記AMG抗體-金標記物。 4) 將制成的標記物與不含有金顆粒的膠體金標記物試劑按照一定比例混合，制成檢測 試劑盒所需要的膠體金標記物試劑 5) 將市售的人源AMG蛋白按照所需濃度梯度，用校準品稀釋液配制成濃度在Omg/ L-200mg/L范圍內的校準品，用于在儀器上配合反應緩沖液試劑和膠體金標記物試劑形成 校準曲線，以達到定量檢測的目的。
【文檔編號】G01N33/68GK105891502SQ201510144084
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2015年3月31日
【發明人】郭成志, 王志新
【申請人】北京科美生物技術有限公司