用于檢測視黃醇結合蛋白(rbp)的膠體金免疫比色法試劑盒及其制備方法
【專利摘要】一種檢測視黃醇結合蛋白(RBP)的膠體金免疫比色法試劑盒及其制備方法，本發明屬于體外診斷試劑領域，用于判斷個體急性腎損傷的情況是否出現。本方法是以膠體金顆粒為載體，將視黃醇結合蛋白(以下均簡稱為RBP)抗體與膠體金顆粒進行偶聯，在相應的檢測裝置內，使樣品中的RBP蛋白與偶聯后的金顆粒接觸，形成抗原-抗體-金復合物，造成金顆粒在檢測波長下吸光度的改變，并且吸光度的改變量與RBP蛋白濃度程正相關，進而達到檢測樣本中RBP蛋白的目的。本試劑盒并且具備較高的分析靈敏度。
【專利說明】用于檢測視黃醇結合蛋白（RBP)的膠體金免疫比色法試劑 盒及其制備方法 發明領域
[0001] 本發明屬于體外診斷試劑領域，具體涉及用于檢測視黃醇結合蛋白（RBP)的膠體 金免疫比色法試劑盒 技術背景
[0002] 視黃醇結合蛋白（Retinol Binding Protein，RBP)為血液中視黃醇（維生素A) 的轉運蛋白。1961年Berggard在免疫電泳中發現在a 2-球蛋白區域能形成一條長沉淀線 的蛋白質，曾稱為長a 2-球蛋白。在以后幾十年中，人們對這種蛋白質的分子結構、生物學 特性等進行了全面研究，發現這種蛋白質廣泛地分布于正常人體液中，屬a ^球蛋白，具有 從肝細胞中轉運視黃醇至周圍組織的功能。現認為血液中RBP主要以視黃醇、前白蛋白結 合的復合物形式存在，當復合物中視黃醇與靶細胞結合后，RBP便與前白蛋白分離，自腎小 球濾出，由近端腎小管上皮細胞吸收、降解。近年來的深入研究表明RBP含量改變能夠敏感 地反映近端腎小管功能、肝功能損害程度，是反映腎臟、肝臟及營養性疾病發展、轉歸的敏 感指標。
[0003] RBP分子由一條多肽鏈及小部分碳水化合物組成，不含中性糖和氨基已糖，分子量 為21，000,沉降系數S^w 2. 3S，等電點pH 4. 4~4. 8,半衰期3~12小時。RBP經硫酸乙 基葡聚糖層析（SlfoethySephadex Chromatography)得到A、B兩個峰，二乙氨基乙醇葡聚 糖（DEAE-S印hadex)層析A、B兩部分后可獲得六^^與B pB2四組分。免疫擴散法顯示RBP 的四個組分抗原性是一致的。
[0004] RBP主要由肝細胞合成，廣泛分布于人體血清、腦脊液、尿液及其他體液中。在血液 中，RBP與視黃醇、前白蛋白以1 : 1 : l(mol)的復合物形式存在，轉運體內90%的視黃醇 至機體組織，當RBP與細胞表面的RBP受體結合時，視黃醇進入細胞內，復合物解體，游離的 RBP從腎小球濾出，其中絕大部分被近端腎小管上皮細胞重吸收，并被分解，供組織利用，僅 有少量從尿中排出。當體內鋅、鐵缺乏及嚴重感染等疾病能降低RBP的生物合成。
[0005] RBP的提純方法主要有普通提純法、親和層析法和快速蛋白液相層析法（Fast Protein Liquid Chromatography，FPLC)三類。測定血、尿中的RBP方法較多，有放射免疫 擴散、免疫濁度、免疫電泳、酶聯免疫吸附和放射免疫分析，但其中靈敏度高、實用性強的僅 為放射免疫分析法（RLA)和酶聯免疫吸附法（ELISA)。
[0006] 1、與肝病的關系：Smith等用放免法檢測109例正常人和71例肝病患者血清中 RBP的水平。31例肝硬化（經組織學診斷有24例Laenner's肝硬化、6例壞死后肝硬化和 1例膽汁性肝硬化）及急、慢性肝炎的血清RBP水平均顯著低于正常對照組，并發現急性病 毒性肝炎病程早期血清RBP含量降低較晚期更明顯。作者對35例急性病毒性肝炎血清RBP 水平與血清膽紅素、谷草轉氨酶及堿性磷酸酶活力作相關分析，發現RBP與血清膽紅素、谷 草轉氨酶和堿性磷酸酶活力均顯著負相關，提示血清RBP水平能準確、靈敏地反映肝功能 變化。Bosin等用ELISA法測定了 20例肝硬化、5例肝腎綜合征的血、尿RBP水平（20例腎 功能正常的肝硬化均為酒精性肝硬化），發現20例肝硬化患者血清RBP水平均顯著低于正 常對照組，尿RBP水平與正常組相同；5例肝腎綜合征血清RBP顯著低于正常，而尿RBP顯著 高于正常，此結果表明檢測血、尿RBP水平有助于單純性肝硬化與肝腎綜合征的鑒別診斷。
[0007] Bankson等用免疫濁度法測定血清RBP得出了相似的結果，30例肝臟疾病患者血 清RBP水平顯著低于正常對照組。
[0008] 2、與腎臟病的關系：Smith等人用放免法檢測了 26例慢性腎臟疾病血清RBP水 平，慢性腎孟腎炎9例、慢性腎小球腎炎6例、結石腎1例，糖尿病性腎硬化2例、系統性紅斑 狼瘡性腎病2例、腎硬化2例及原因不明腎臟病4例，結果26例患者血清RBP水平顯著高 于正常組。另外，Bosin等人測定了 4例急性腎小管壞死、14例慢性腎功能衰竭患者血、尿 RBP、肌酐、白蛋白的含量，發現急性腎小管壞死、慢性腎功能衰竭血、尿RBP、肌酐含量均顯 著高于正常，白蛋白含量在血液中降低、尿液內增高。作者還分析2例肝腎綜合征發病前后 尿RBP的變化，肝病綜合征發生前后血肌酐及尿RBP各升高35倍和600倍，表明血、尿RBP 的改變與傳統的反映腎功能指標相一致。
[0009] 尿RBP、0 2-微球蛋白（0 2_M)均屬反映近端腎小管功能的小分子蛋白。以往0 2_M 是常規的指標，但近幾年來隨著對小分子蛋白理化特性的深入研究發現，溫度、口!1對02-M 的影響較大。Bernard等人對比了 RBP與02-M作為腎小管功能指標的敏感性以及在酸性 尿液中的穩定性。結果表明150例正常人尿標本中有10%的pH < 5. 5、32. 7% pH < 6,當 pH為5. 5時，尿內0 2-M開始快速分解，甚至尿液在膀胱內就開始分解了，pH 5. 0、37 °C、溫 育2小時后80% 2-M分解；RBP在pH4. 5時仍穩定，僅在pH4. 0、37°C溫育2小時后有40% 分解。作者還對68例各種慢性腎臟疾病患者尿RBP與0 2-M含量作相關分析，發現尿pH調 整前后，二者相關系數各為〇. 86和0. 94,提示如果不存在pH影響，RBP與0 2-M反映腎功 能的靈敏度、特異性非常相似。Blumsohn等觀察pH與溫度對正常及病理狀態下RBP、0 2-M 的影響，報道了相似的結果，當pH等于4、溫度為4°C和20°C、48小時后02-M已分解70% 和90%，RBP僅分解5%和25% ;當pH不變、溫度37°C時，4小時后02-M僅剩5%，而RBP 分解55%，表明在室溫或4°C條件下，正常及異常尿液中RBP穩定性好，是一個比0 2-M更 實用、可靠的腎功能指標。
[0010] 3.與其它疾病關系：Smith等人還測定了 14例甲狀腺機能亢進和低下者血清 RBP水平，結果前者較正常人低（31.2±3. lμg/ml)，后者高于正常人（57. 2±7. lμg/ml)。 Winkler等分析了正在接受營養療法的營養性疾病患者血漿蛋白變化，發現血漿RBP的變 化早于白蛋白和轉鐵蛋白，并與氮平衡的相關性高于白蛋白和轉鐵蛋白，表明血清RBP水 平是反映營養性疾病療效的靈敏、特異性指標。另外，Vaquist等用放免擴散法測定了 19例 正常人和35例消化系統疾病患者血清RBP水平，發現除9例慢性腹瀉外，其余患者血清RBP 水平均顯著低于正常人。作者還分析了血清RBP與維生素A及暗適應能力的關系，發現血 清 RBP與維生素A含量的相關系數為0. 879,當血清RBP低于正常一半時，患者才出現暗適 應能力降低，提示血清RBP含量能更靈敏地反映維生素A缺乏癥。
【發明內容】
[0011] 本發明所要解決的問題是進一步提高檢測人體液樣本中RBP蛋白含量的分析靈 敏度，提供一種特異性好，靈敏度高的分析RBP蛋白的膠體金勻相免疫比色試劑盒，可以用 于精確測定體液樣本中0_140mg/L的RBP蛋白含量。另外本發明還在于提供一種關于RBP 蛋白檢測試劑盒的制備方法。
[0012] 為了解決上述問題，本發明采用膠體金勻相免疫反應法，檢測體液樣本中的RBP 蛋白含量。標記RBP抗體的膠體金顆粒在540nm處有最大吸收峰，當環境中存在RBP蛋白 時，會形成抗原-抗體-金復合物，而此時540nm處的最大吸收峰將隨著樣本濃度的升高而 減弱，且660nm處的最大吸收峰將隨之增加。通過檢測并計算540nm吸光度的減少和660nm 吸光度的增加，與已知濃度的樣本相聯系，進而形成校準曲線，從而即可達到定量測量體液 樣本中RBP蛋白的含量。
[0013] 本發明提供以下技術方案：
[0014] 一種關于RBP檢測膠體金勻相免疫檢測試劑盒，其主要的目的是用于檢測人個體 體液樣本中RBP蛋白的含量，本發明試劑盒中主要由用于形成校準曲線的已知RBP蛋白的 校準品（RBP校準品），反應緩沖液試劑（試劑1)，膠體金標記物試劑（試劑2)三部分組成。 其中RBP校準品是由校準品稀釋液和RBP蛋白按照一定比例配制成不同濃度梯度，其濃度 范圍為〇mg/L-140mg/L，反應緩沖液試劑是由磷酸鹽和牛血清白蛋白配制而成的能夠提供 本發明所需要的免疫學反應的且具有pH緩沖能力的溶液，膠體金標記物試劑是由金標記 的抗人源RBP蛋白的抗體和懸浮標記物的緩沖液組成。
[0015] 首先，根據試劑盒檢測需要制備主吸收峰為450nm± 10nm的膠體金顆粒。
[0016] 其次配制試劑1，其主要組成應為50mM PBS pH8. 0溶液，其中溶解有 PEG6000-20000,聚蔗糖400和牛血清白蛋白等多聚物或生物大分子中的一種物質或兩種 及其以上，并且控制pH值應在7. 0-9. 0之間。
[0017] 第三，配制試劑2為，其主要組成應為50mM PBS pH8. 0溶液，其中溶解有 PEG6000-20000,聚蔗糖400,吐溫20,牛血清白蛋白和Triton X-100等多聚物或生物大分 子中的一種物質或兩種及其以上，并且控制pH值應在7. 0-9. 0之間。將標記RBP抗體后的 金顆粒濃縮，并用此步驟配制的溶液復懸。用去離子水或超純水稀釋復懸后膠體金標記物 試劑（試劑2) 50倍后，并以去離子水或超純水做空白，在540nm± 10nm處的檢測吸光度，若 吸光度在〇. 2000Abs-0. 3000Abs的范圍內，則認為試劑2中標記RBP抗體的金顆粒濃度合 格，若不符合上述要求，則進一步調整試劑2中金顆粒濃度，直至符合要求。
[0018] 最終使用時，將RBP校準品（或樣本），試劑1和試劑2按照一定的比例和次序混 合，檢測吸光度的變化，即可反應出樣本中待檢測的RBP含量。
[0019] 使用本發明方法，具有高靈敏度特性，可以分析RBP含量在140mg/L以下的樣本。 本發明可以同時用于檢測不同基質的體液樣本，如血清，血漿，尿液中RBP蛋白的含量，不 需要對樣本或試劑做其它技術處理，包括增加或減少測試樣本量，增大或降低試劑1和試 劑2的比例，具備高靈敏度，高特異性，高準確度和良好的重復性等優點，適合于全自動生 化儀，半自動生化儀和紫外-可見光分光光度計使用。
[0020] 本發明主要目的在于提高對于人體液樣本中RBP蛋白含量檢測的特異性和分析 靈敏度，在本發明中通過控制標記物的反應條件和金顆粒的大小，以及合適的測量條件，從 而達到上述目的。
[0021] 具體而言，本發明可以提供一種高分析靈敏度的RBP檢測試劑盒，其主要特性在 于在Omg/L-8. 75mg/L的范圍內具備高分析靈敏度，在0mg/L-140mg/L的范圍內具備較好的 線性，對于臨床診斷而言具有較好的指導意義。其中試劑盒內包含的試劑1、試劑2和校準 品，以體積計算，校準品用量（或待測樣本用量）為2uL-10uL，試劑1用量為200uL-250uL， 試劑2用量為50uL-100uL。
[0022] 本發明中所述的金顆粒大小應以最大吸收峰和吸收峰峰寬控制，通過調整氯金酸 與還原劑的比例，使制的膠體金顆粒的最大吸收峰在540nm±20nm范圍內，優化條件使得 顆粒大小進一步得到控制，制的的膠體金顆粒的最大吸收峰在540nm± 10nm范圍內，進一 步對實驗條件優化，制的膠體金顆粒的最大吸收峰在540nm±5nm的范圍內，此時膠體金顆 粒大小最為合適。
[0023] 本發明中所闡述的膠體金勻相試劑1和試劑2中，其緩沖液選用PBS緩沖液，pH 值控制在7. 0-9. 0間，進一步通過實驗優化緩沖條件，pH值控制在7. 5-8. 5間，RBP蛋白 與標記的抗體反應較為合適，再進一步優化實驗條件發現，pH控制在8. 0±0. 2時，RBP蛋 白與標記的抗體反應最為合適。并且在試劑1中所述的多聚物和生物大分子主要包括 PEG6000-20000,聚蔗糖400和牛血清白蛋白，并在其中加入含量約為0. 1% (質量體積比） 的疊氮鈉。試劑2中所述的多聚物和生物大分子PEG6000-20000,聚蔗糖400,吐溫20,牛 血清白蛋白和TritonX-100,并在其中加入含量約為0. 1% (質量體積比）的疊氮鈉。在試 劑2中，標記后的抗體在試劑2中的含量以吸光度的方式進行控制，即將含有標記物的試劑 2用去離子水或超純水稀釋50倍以后，以去離子水或超純水做空白（參比），檢測540nm下 的吸光度應在〇. 20Abs-0. 25Abs范圍內。試劑2中RBP抗體與膠體金的標記依靠金顆粒表 面帶電對RBP抗體的吸附而完成。
[0024] 本發明中所敘述的用于檢測或監測體液樣本中RBP蛋白含量的試劑盒，其中包括 RBP蛋白校準品和校準品稀釋液兩部分組成。校準品稀釋液由PBS緩沖液、牛血清白蛋白和 疊氮鈉組成，其中PBS緩沖液控制pH值在7. 0-9. 0之間，優化后的pH控制在8. 0±0. 5,添 加牛血清白蛋白和疊氮鈉的量為0. 1% -0. 5% (質量體積比）。校準品由校準品稀釋液稀 釋 RBP 蛋白純品制成，含量為 0mg/L，8. 75mg/L，17. 5mg/L，35mg/L，70mg/L，140mg/L。
[0025] 本發明中采用膠體金勻相免疫比色法測定樣本中的RBP蛋白的含量。標記有顆 粒均一，大小合適金顆粒的RBP抗體，與樣本中的RBP蛋白，在緩沖液中形成RBP蛋白-抗 體-金具有三維結構的復合物，從而使原本金顆粒在540nm的吸光度減弱，并且在660nm處 的吸光度加強，通過將這種改變與校準品中已知的RBP蛋白濃度相對應，進而形成檢測系 統的校準曲線，當未知RBP蛋白濃度的體液樣本以同樣的反應模式與標記物反應時，通過 計算上述吸光度的改變，對應校準曲線從而達到定量測量的目的。
【附圖說明】
[0026] 圖1本發明試劑與對照試劑線性驗證結果，以稀釋度為橫坐標，以檢測結果為縱 坐標作圖，本發明試劑具有優于同類檢測項目試劑盒線性的特點。
[0027] 圖2本發明試劑與對照試劑校準曲線實驗結果，樣本中RBP蛋白含量每變化一個 濃度單位，本發明試劑的吸光度信號變化為對照試劑的約2. 5倍，本發明靈敏度明顯優于 對照試劑。
[0028] 圖3標記物沉降檢測實驗結果，本發明試劑標記物在40天內未發生明顯沉降。
【具體實施方式】
[0029] 實施例
[0030] 本發明中若不做特殊說明，則表述含量的百分比濃度均表示質量體積比，即 g/100mL
[0031] 實施例1
[0032] RBP校準品的制備
[0033] 用重組人RBP蛋白（市售）溶于校準品稀釋液（牛血清白蛋白0.5%，疊氮鈉 0. 1%，PBS緩沖液pH 8. 0)制備出不同濃度梯度的校準品，采用九強RBP膠乳免疫比色試 劑盒檢測配制校準品，每個濃度梯度檢測3次，取檢測結果的平均值，定值為Omg/L (校準品 稀釋液，未添加 RBP 蛋白），8. 75mg/L，17. 5mg/L，35mg/L，70mg/L，140mg/L。
[0034] 反應緩沖試劑（試劑1)的制備
[0035] 取 80mL 50mM PBS pH8. 0 的緩沖液中加入 PEG6000-200005g，聚蔗糖-4001g，牛血 清白蛋白〇. 5g，疊氮鈉0. lg，最終用相應的緩沖液定容至100mL，并用0. 22um微孔濾膜過 濾，即制成反應緩沖試劑（試劑1)，其中PEG6000-200005 %，聚蔗糖-4001 %，牛血清白蛋白 0. 5%，疊氮鈉 0. 1%。
[0036] 膠體金標記物試劑（試劑2)的制備
[0037] 膠體金標記物試劑（試劑2)的制備過程主要分為三部分，即標記物制備，空白緩 沖液的制備，標記物的復懸三個步驟。
[0038] 標記物的制備
[0039] 將市售的氯金酸和檸檬酸三鈉溶解，并分別配制成1 %的水溶液，將1L的去離子 水或超純水煮沸，接著加入10mL的氯金酸溶液保持沸騰約lmin后，加入10mL的檸檬酸三 鈉溶液，隨著時間的變化溶液再次沸騰，溶液顏色隨之由明黃色轉變為紫黑色，接著短時間 轉為酒紅色，之后保持沸騰lOmin后，冷卻備用。
[0040] 將制備好的的膠體金溶液用濃度為20 % 1(20)3溶液調整pH值至8. 0后，按比例加 如一定體積的RBP抗體（市售），充分攪拌lh，即完成抗體的標記過程。
[0041] 抗體標記完成以后，可用10% NaCl溶液檢查標記量是否合適，當按照1 : 10的體 積比例加入NaCl溶液后，當不出現黑色沉淀時的抗體最小用量，為最佳標記量。
[0042] 標記物空白緩沖液的制備
[0043] 取 80mL 50mM PBS pH8. 0 的緩沖液中加入 PEG6000-2000020g，聚蔗糖-400 5g，牛血清白蛋白0. 5g，疊氮鈉0. lg，吐溫201g，TritonX-100 lg，最終用相應的緩 沖液定容至100mL，并用0. 22um微孔濾膜過濾，即制成反應緩沖試劑（試劑1)，其中 PEG6000-2000020 %，聚蔗糖-4005 %，牛血清白蛋白0? 5 %，疊氮鈉0? 1 %，吐溫20 1 %， Triton X-100 1%〇
[0044] 標記物復懸
[0045] 將標記好的膠體金顆粒在6000rpm下離心40min，收集沉淀，之后用上述標記物空 白緩沖液復懸收集的沉淀，并將濃度按照本發明的權利要求（4)將標記物調整至合適的濃 度即可。
[0046] 線性驗證
[0047] 1、取一例具有急性腎損傷表象的臨床病人血清樣本約2mL，向其中加入人源的 RBP蛋白純品，制得一線性高值樣本。
[0048] 2、選用市場上技術較為成熟的RBP蛋白膠乳微球比濁法試劑盒做對照試劑，在東 芝120FR全自動生化儀上錄入膠乳比濁法對照試劑盒參數，并用其試劑盒配套校準品校準 其試劑，檢測上述高值樣本三次，已三次檢測結果的均值130. 27mg/L為最終定值結果。
[0049] 3、在東芝120FR全自動生化儀上，錄入本發明的實驗參數，并用已經校正的校準 品經行試劑校準。
[0050] 4、將上述的線性高值樣本用生理鹽水做倍比稀釋，稀釋比例為1/2,1/4,1/8， 1/16,1/32,1/64,與原線性高值樣本組成一個梯度樣本組。
[0051] 5、用上述對照試劑和本發明的試劑分別檢測上述樣本，每個試劑每個樣本檢測三 次，以三次結果均值最終的檢測結果，然后比較本發明和再對照試劑的線性，結果表1和圖 1所示。
[0052] 表1線性驗證結果
[0054] 表1為線性實驗結果數據統計，在本發明和對照試劑盒的檢測范圍內，將高值樣 本倍比6次稀釋，用對照試劑和本發明試劑分別檢測
[0055] 分析靈敏度驗證
[0056] 1、選用市場上技術較為成熟的RBP蛋白膠乳微球比濁法試劑盒做對照試劑，在東 芝120FR全自動生化儀上錄入膠乳比濁法對照試劑盒參數，并用其試劑盒配套校準品校準 其試劑。
[0057] 2、在東芝120FR全自動生化儀上，錄入本發明的實驗參數，并用已經校正的校準 品經行試劑校準。
[0058] 3、比較兩個試劑在200mg/L以下濃度的校準點吸光度的變化，結果如表2和圖2 所示。注：由于對照試劑與本發明試劑的檢測原理不相同，所以在繪制圖2時將對照試劑吸 光度變化做相反數處理。
[0059] 表2分析靈敏度實驗結果
[0060]
[0061] 表2為分析靈敏度實驗結果數據統計，實驗樣分析本發明試劑和對照試劑分析靈 敏度，
[0062] 標記物沉降監測
[0063] 由于標記物溶液為膠體溶液，所以在長時間靜止放置后應驗證其是否發生顆粒沉 降現象。本例目的在于驗證本發明是否會存在標記物沉降現象。
[0064] 1、取兩只50mL燒杯，用酸性重鉻酸鉀浸泡24小時后，用去離子水清洗干凈，100°C 烘干處理4h。
[0065] 2、將對照試劑盒中的標記物試劑倒入其中一只燒杯中，將本發明試劑標記物倒入 另一只燒杯中，兩只燒杯同時攪拌lh。
[0066] 3、用微量移液器在溶液表面2-5mm處分別吸取對照試劑和本發明試劑各60uL，并 用去離子水稀釋只至3mL，震蕩混合均勻。
[0067] 4、以去離子水作為參比，在540nm處檢測兩試劑標記物稀釋后的吸光度，每個試 劑檢測三次，以三次結果的均值，作為最終檢測結果。
[0068] 5、將上述兩只燒杯封口，2_8°C下靜置每隔10天檢測一次，重復上述步驟3和步驟 4,對比靜置前后吸光度變化，實驗結果如表3和圖3所示。
[0069] 表3標記物沉降監測實驗結果
[0070]
[0071] 標記物對反應杯污染實驗
[0072] 由于標記物溶液為金顆粒膠體溶液，所以會在反應杯表面存在吸附現象。本例在 于驗證本發明試劑是否會出現吸附污染現象。
[0073] 取三只潔凈的石英比色杯，以空氣為參比，分別記錄其在540nm處杯空白吸光度。
[0074] 1、用本發明試劑標記物裝填比色杯至其3/5高度處，浸泡lh。
[0075] 2、取出標記物后，每只比色杯用去離子水反復清洗10次
[0076] 3、在每只比色杯中裝填去離子水至比色杯4/5高度處，每隔lh換水一次，共換水 三次。
[0077] 4、自然晾干比色杯中的水分，以空氣為參比，檢測每只比色杯在540nm處吸光度。
[0078] 5、對于對照試劑標記物重復上述步驟1至步驟5操作，比較兩試劑標記物是否會 對比色杯造成吸附污染，實驗結果如表4所示。
[0079] 表4標記物對比色杯污染實驗數據
[0080]
[0081] 根據實驗結果分析，對照試劑標記物長時間放置于比色杯中會吸附至比色杯表 面，本發明試劑標記物在相同時間內未對比色杯有明顯的吸附現象。
【主權項】
1. 一種RBP檢測膠體金勻相免疫檢測試劑盒，包括RBP校準品，反應緩沖液試劑，膠體 金標記物試劑，其特征在于一種勻相定量檢測檢體中RBP含量的基于膠體金比色法的體外 診斷試劑。2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于RBP校準品是由校準品稀釋液和RBP蛋 白按照比例配制成不同濃度梯度，其濃度范圍為0mg/L-140mg/L，反應緩沖液試劑是由磷酸 鹽與牛血清白蛋白配制具有pH緩沖能力的溶液，膠體金標記物試劑是由金標記的抗人源 RBP蛋白的抗體和懸浮標記物的緩沖液組成。3. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于膠體金顆粒的主吸收峰為450nm± 10nm。4. 根據權利要求1-3所述的試劑盒，其特征是反應緩沖液試劑是反應條件的控制性溶 液，包括50mM PBS pH8. 0溶液，PEG6000-20000,聚蔗糖400和牛血清白蛋白等多聚物或生 物大分子中的一種物質或兩種及其以上，并且控制反應緩沖液試劑的PH值為7. 0-9. 0。5. 根據權利要求1-3所述的試劑盒，其特征是膠體金標記物試劑是反應條件的控制 性溶液，包括50mM PBS pH8. 0溶液，PEG6000-20000,聚蔗糖400,吐溫20,牛血清白蛋白和 Triton X-100等多聚物或生物大分子中的一種物質或兩種及其以上，將標記RBP抗體后的 金顆粒懸浮于此溶液中，并且控制pH值應在7. 0-9. 0之間，組成膠體金標記物試劑。6. 根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于中標記RBP抗體的金顆粒濃度合格的 依據為離子水或超純水稀釋膠體金標記物試劑50倍后，以去離子水或超純水做空白，其在 540nm± IOnm 處的吸光度的范圍為 0. 2000Abs-0. 3000Abs。7. 根據權利要求6所述，試劑盒其特征在于反應體系溶液組成為校準液或樣本、反應 緩沖液試劑和膠體金標記物試劑，其中樣本量范圍為2uL-20uL，反應緩沖液試劑的體積應 控制在2-10倍于膠體金標記物試劑的體積。8. 制備權利要求1-7任意一項所述的試劑盒，其特征是RBP蛋白膠體金勻相檢測試劑 盒的制備方法，包括以下幾個步驟： 1) 將多聚物或生物大分子用去離子水或超純水溶解，配制成反應緩沖液試劑。 2) 將氯金酸與還原劑按照一定比例混合，隨之用去離子水或超純水加熱煮沸，制的主 吸收峰為450nm±10nm的膠體金顆粒。 3) 將待標記的RBP抗體與金顆粒相混合制成標記RBP抗體-金標記物。 4) 將制成的標記物與不含有金顆粒的膠體金標記物試劑按照一定比例混合，制成檢測 試劑盒所需要的膠體金標記物試劑 5) 將市售的人源RBP蛋白按照所需濃度梯度，用校準品稀釋液配制成濃度在Omg/ L-140mg/L范圍內的校準品，用于在儀器上配合反應緩沖液試劑和膠體金標記物試劑形成 校準曲線，以達到定量檢測的目的。
【文檔編號】G01N33/68GK105891501SQ201510144082
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2015年3月31日
【發明人】郭成志, 王志新
【申請人】北京科美生物技術有限公司