同時檢測煙草及煙草制品中煙草特有亞硝胺和揮發性n-亞硝胺的gc-ms/ms方法
【專利摘要】一種同時檢測煙草及煙草制品中煙草特有亞硝胺和揮發性N?亞硝胺的GC?MS/MS方法，具體包括四種煙草特有亞硝胺：NNN、NAT、NAB、NNK，和八種揮發性N?亞硝胺：NDMA、NPYR、NPIP、NMOR、NEMA、NDEA、NDPA、NDBA；其特征在于：在煙草樣品中加入氫氧化鈉溶液，手持振蕩混合均勻后加入二氯甲烷，振蕩器振蕩，加入無水硫酸鎂，手持振蕩后置于振蕩器中振蕩，然后離心、濃縮，最后用GC?MS/MS分析。本發明的優點在于：樣品前處理簡便、煙草特有亞硝胺和揮發性N?亞硝胺能夠同時被分析，可批量處理，且該方法測定速度快、加標回收率好、精密度高，可為準確評估煙草及煙草制品中煙草特有亞硝胺和揮發性N?亞硝胺的安全風險提供技術支撐。
【專利說明】
同時檢測煙草及煙草制品中煙草特有亞硝胺和揮發性N-亞硝 胺的GC-MS/MS方法
技術領域
[0001] 本發明屬于煙草及煙草制品中煙草特有亞硝胺和揮發性N-亞硝胺檢測技術領域， 具體是使用氣相色譜-串聯質譜法(GC-MS/MS )同時分析煙草及煙草制品中煙草4種特有亞 硝胺和8種揮發性N-亞硝胺，利用該方法可快速定量分析煙草及煙草制品中12種亞硝胺的 含量。
【背景技術】
[0002] 煙草特有亞硝胺(TSNAs)是煙草及煙草制品中最主要的一類致癌物質，而TSNAs中 最關注的4種分別為N-亞硝基降煙堿(NNN)、N-亞硝基新煙草堿(NAT)、N-亞硝基假木賊堿 (NAB)、4-甲基亞硝基吡啶基丁酮(NNK);揮發性N-亞硝胺(VNAs)是一類受到廣泛關注的致 癌類物質，早在1970年以前研究者就已經發現煙草中含有揮發性N-亞硝胺，主要包括N-亞 硝基二甲基胺（NDMA)、N-亞硝基吡咯烷（NPYR)、N-亞硝基哌啶（NPIP)、N-亞硝基嗎啉 (NMOR)、N-亞硝基甲基乙基胺(NEMA)、N-亞硝基二乙胺(NDEA)、N-亞硝基二丙胺(NDPA)和N-亞硝基二丁胺(NDBA)等8種揮發性N-亞硝胺，其中NDMA為2A級致癌物，NPYP、NM0R、NPIP為2B 級致癌物。
[0003] 煙草和煙草制品的基質比較復雜，在亞硝胺的檢測中需要采用相應的前處理方法 凈化基質。固相萃取、液液萃取、固相微萃取等前處理技術可以降低基質效應，但相應地也 增加了樣品分析時間并限制了樣品通量，截至目前，關于同時測定煙草和煙草制品中煙草 特有亞硝胺和揮發性N-亞硝胺的報道很少，有必要進行進一步研究。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的正是基于上述現有技術狀況而專門提供的一種同時檢測煙草及煙 草制品中煙草特有亞硝胺和揮發性N-亞硝胺的GC-MS/MS方法，實現了對煙草特有亞硝胺和 揮發性N-亞硝胺的同時分析，簡化了前處理操作，可以對煙草及煙草制品進行批量快速檢 測 。
[0005] 本發明的目的是通過以下技術方案來實現的： 一種同時檢測煙草及煙草制品中煙草特有亞硝胺和揮發性N-亞硝胺的GC-MS/MS方法， 具體包括四種煙草特有亞硝胺：NNN、NAT、NAB、NNK，和八種揮發性N-亞硝胺:NDMA、NPYR、 NPIP、NMOR、NEMA、NDEA、NDPA、NDBA，是在煙草樣品中加入氫氧化鈉溶液，手持振蕩混合均勻 后加入二氯甲烷，振蕩器振蕩，加入無水硫酸鎂，手持振蕩后置于振蕩器中振蕩，然后離心、 濃縮，最后用GC-MS/MS分析，具體步驟如下： a、 內標溶液的配制：配制內標濃度為1 y g/m 1的_1^-06、匪￡厶-03、_￡厶-010、_卩八-D14、NM0R-D8、NPYR-D8、NPIP-D8、NDBA-D8 的混合內標二氯甲烷工作溶液和 NNK-D4、NAT-D4、 NAB-D4和NNK-D4的混合內標二氯甲烷溶液； b、 混合標準溶液的配制：以二氯甲烷為溶劑，配制煙草特有亞硝胺系列標準溶液，具體 濃度為：5 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、500 ng/ml、1000 ng/ml、 5000 ng/ml;分別加入煙草特有亞硝胺內標溶液，使各內標物的濃度均為400 ng/ml;以二 氯甲烷為溶劑，配制揮發性N-亞硝胺系列標準溶液具體濃度為:0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、l ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/ml 和 100 ng/ml，分別加入揮發性N_ 亞硝胺內標溶液，使各內標物的濃度均為20 ng/ml。
[0006] C、煙草樣品準備:煙草及煙草制品磨碎后冷藏保存以備用； d、 萃取:將準確稱取的4 g樣品放于50 mL離心管中加入4 ml濃度為10%的氫氧化鈉溶 液以提高目標物的提取效果，手持振蕩15 s混合均勻，然后加入30 ml二氯甲烷和相應的內 標溶液(煙草特有亞硝胺內標溶液的加入量為200yl，揮發性N-亞硝胺內標溶液的加入量20 yl)，將離心管置于振蕩器振蕩20 min，振蕩后加入4.5 g無水硫酸鎂，手持振蕩15 s后置于 振蕩器中振蕩2 min; e、 離心:樣品在高速離心機上以11000 r/min離心5 min; f、 濃縮:離心后取上清液在43°C±2°C下氮吹濃縮至2 ml左右，將其轉移至2 mL色譜小 瓶中，以備檢測； g、GC-MS/MS測定，GC-MS/MS儀器工作參數如表1: 表1 GC-MS/MS儀器工作參數
目標物與內標的保留時間和質譜參數如表2: 表2目標物與內標的保留時間和質譜參數
h、結果計算。
[0007] 本發明的優點在于:樣品前處理簡便、煙草特有亞硝胺和揮發性N-亞硝胺能夠同 時被分析，可批量處理，且該方法測定速度快、加標回收率好、精密度高，可為準確評估煙草 及煙草制品中煙草特有亞硝胺和揮發性N-亞硝胺的安全風險提供技術支撐。
【具體實施方式】
[0008] 本發明結合實例作進一步描述，但并不限制本發明。
[0009] 實例 1 按照上述
【發明內容】
中步驟(b)配制系列標準溶液，然后再用GC-MS/MS進行測定，得到線 性方程和相關系數。以信噪比為3和10計算檢出限和定量限。結果表明方法線性好、檢出限 低(結果見表3) 表3煙草特有亞硝胺和揮發性N-亞硝胺的標準曲線、檢出限和定量限
實例2 按照上述
【發明內容】
中步驟d、e和f，在樣品處理前加入定量的標準品溶液，結果如表4所 示，所有目標物的日內回收率在88.5%-117%之間，日間回收率在89.2%-107%之間。日內精密 度和日間精密度分別為4.3%-13.5%和6.2%-15.1%，精密度良好。
實例3 按照上述
【發明內容】
中步驟測定7種樣品中的煙草特有亞硝胺和揮發性N-亞硝胺含量， 結果見表5。
【主權項】
1. 一種同時檢測煙草及煙草制品中煙草特有亞硝胺和揮發性N-亞硝胺的GC-MS/MS方 法，具體包括四種煙草特有亞硝胺:順1嫩1\祖8、順1(，和八種揮發性^亞硝胺 :勵^即￥1?、 NPIP、NMOR、NEMA、NDEA、NDPA、NDBA;其特征在于:在煙草樣品中加入氫氧化鈉溶液，手持振 蕩混合均勻后加入二氯甲烷，振蕩器振蕩，加入無水硫酸鎂，手持振蕩后置于振蕩器中振 蕩，然后離心、濃縮，最后用GC-MS/MS分析。2. 根據權利要求1所述的GC-MS/MS方法，其特征在于:該方法的具體步驟如下： a、內標溶液的配制：配制內標濃度為I μg/ml的NDMA-D6、MffiA-D3、NDEA-D10、NDPA-D14、NM0R-D8、NPYR-D8、NP IP-D8、NDBA-D8 的混合內標二氯甲烷溶液和NNK-D4、NAT-D4、NAB-D4和NNK-D4的混合內標二氯甲烷溶液； b、混合標準溶液的配制：以二氯甲烷為溶劑，配制煙草特有亞硝胺系列標準溶液，并 分別加入煙草特有亞硝胺內標溶液，使各內標物的濃度均為400 ng/ml;以二氯甲烷為溶 劑，配制揮發性N-亞硝胺系列標準溶液，并分別加入揮發性N-亞硝胺內標溶液，使各內標物 的濃度均為20 ng/ml; c、 煙草樣品準備:煙草及煙草制品磨碎后冷藏保存以備用； d、 萃取:將準確稱取的4 g樣品放于50 mL離心管中加入4 ml濃度為10%的氫氧化鈉溶 液，手持振蕩15 s混合均勻，然后加入30 ml二氯甲烷和相應的內標溶液，將離心管置于振 蕩器振蕩20 min，振蕩后加入4.5 g無水硫酸鎂，手持振蕩15 s后置于振蕩器中振蕩2 min; e、 離心:樣品在高速離心機上以11000 r/min離心5 min; f、 濃縮:離心后取上清液在43°C±2°C下氮吹濃縮至2 ml左右，將其轉移至2 mL色譜小 瓶中，以備檢測； g、 GC-MS/MS測定，GC-MS/MS儀器工作參數如下表：h、結果計算。3.根據權利要求1所述的GC-MS/MS方法，其特征在于:煙草特有亞硝胺系列標準溶液的 具體濃度為：5 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、500 ng/ml、1000 ng/ ml、5000 ng/ml;揮發性N-亞硝胺系列標準溶液的具體濃度為：0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、l ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/ml 和I00 ng/ml〇
【文檔編號】G01N30/04GK105891383SQ201610386484
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年6月4日
【發明人】郭軍偉, 謝復煒, 劉顯軍, 劉雷雨, 王洪波, 趙樂, 樊美娟, 潘立寧, 陳黎
【申請人】中國煙草總公司鄭州煙草研究院