一種舒洛地特組分精細結構分析檢測方法
【專利摘要】本發明公布了一種舒洛地特組分精細結構檢測方法，包括：(1)肝素組分結構解析：硫酸軟骨素ABC酶酶解硫酸皮膚素后進行肝素組分完整糖鏈分析，再經肝素酶I部分酶解后進行肝素糖鏈分析，或經肝素酶I、II、III全酶解后進行肝素二糖分析；(2)肝素組分特征基團結構解析：肝素酶I酶解肝素后經P10柱進行寡糖分離收集，然后用凝膠G25脫鹽柱脫鹽后用質譜進行肝素特征基團結構解析；(3)硫酸皮膚素組分結構解析：用亞硝酸鈉降解肝素組分后，再用硫酸軟骨素ABC酶酶解硫酸皮膚素，進行硫酸皮膚素二糖分析。本發明分析準確、重現性好，可改進現有理化檢測分析手段的不足。
【專利說明】
一種舒洛地特組分精細結構分析檢測方法 一.
技術領域
[0001] 本發明涉及一種多組分產品舒洛地特各組分精細結構分析方法，屬于多組分生化 原料藥分析技術領域。 二.
【背景技術】
[0002] 舒洛地特是一種新型天然糖胺聚糖，從豬腸黏膜提取精制。含有兩個主成分，其作 用原理不同而協同增效，具有抗凝、溶栓、抗心血管疾病、降血脂、保護腎臟、治療糖尿病并 發癥等作用。與同類藥肝素相比，舒洛地特可口服，生物利用度高，副作用小，具有更長的半 衰期以及較低的凝血作用和出血參數，因而近年來備受關注，國內許多廠家也處于積極的 研發仿制階段。
[0003] 糖胺聚糖為長鏈不分支的雜多糖，具有羧基與硫酸酯基，其基本單位是由己糖醛 酸和氨基己糖組成的二糖，再重復聚合為糖胺聚糖。舒洛地特主要由肝素鈉和硫酸皮膚素 兩種糖胺聚糖組分組成。由于糖胺聚糖具有多分散性、結構不均一性、硫酸化程度不一致 性、殘基數量多變性、糖鏈長度不同等特點使得糖胺聚糖的結構解析非常復雜。糖胺聚糖自 身組成復雜，舒洛地特為兩種糖胺聚糖的混合物，且其中的肝素組分經過了一系列的加工 處理，使得舒洛地特的結構更加錯綜復雜，為舒洛地特的結構分析及其仿制藥的研制開發 帶來了巨大挑戰。
[0004] 目前報道的舒洛地特各組分檢測方法主要為瓊脂糖凝膠電泳法，此方法為理化檢 測法，精密度不夠理想，無法通過此方法確定舒洛地特具體的組分及精細結構。 三.
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于改進現有分析技術手段的不足，從而提供一種較為先進的舒洛 地特組分精細結構的分析方法，采用高效液相色譜及質譜的檢測方法進行。本發明具有分 析準確，重現性好的特點。
[0006] 本發明的目的可以通過下述技術方案實現：1)針對舒洛地特含有肝素和硫酸皮 膚素兩種組分，首先選擇性的降解其中一種組分，使其轉化為單一組分，然后通過多種手段 對該單一組分進行詳細解析，從而確定其精細結構。2)，肝素組分解析：用硫酸軟骨素ABC 酶降解硫酸皮膚素，對肝素組分進行結構解析，包括完整糖鏈分析（見附圖1)、肝素酶I部 分酶解后糖鏈分析（見附圖2)、肝素酶I、II、III全酶解后二糖分析（見附圖3)。肝素組 分特征基團解析步驟如下：首先用肝素酶I適度降解肝素組分，再用Bio-Gel P10自裝凝膠 柱進行寡糖分離并依次收集各組分（見附圖4)，最后用交聯葡聚糖凝膠G25自裝脫鹽柱分 別脫鹽后（見附圖5)，用質譜對各組分精細結構進行解析（見附圖6)。硫酸皮膚素組分解 析：先用亞硝酸鈉降解肝素組分，然后用硫酸軟骨素ABC酶酶解硫酸皮膚素，進行硫酸皮 膚素二糖分析（見附圖7)。
[0007] 本發明的測定方法如下步驟所示：
[0008] 1. 1硫酸軟骨素ABC酶酶解步驟
[0009] 100 y 1樣品+100 y 1軟骨素ABC酶+800 y 1 Tris，混勻，置于37°C水浴中反應4h， 滅活，過濾后進樣。
[0010] 1. 2酶解后肝素組分完整糖鏈分析條件
[0011] 色譜柱：TSK 3000SWxl (7. 8mm*30cm)
[0012] 流動相：0.77%乙酸銨+0.02%疊氮鈉
[0013] 流速：0? 4ml/min
[0014] 柱溫：3(TC
[00彳5] 進樣體積：20yl
[0016] 檢測器：示差折光檢測器
[0017] 1. 3肝素酶I部分酶解步驟
[0018] 20 y 1樣品+70 y 1乙酸鈣溶液（pH = 7. 0) +100 y 1肝素酶I溶液（pH 7. 0磷酸二 氫鈉溶液溶解），混勻，置于25°C水浴中反應24h，滅活，過濾后進樣。
[0019] 部分酶解糖鏈分析條件
[0020] 色譜柱：Waters Spherisorb S5 SAX (4. 0*250mm)
[0021] 流動相：A-NaH2P04(0 . 04% ) ；BNaH2P04(0 . 04% )+NaC104(14% )
[0022] 流速：0? 45ml/min
[0023] 柱溫：35°C
[0024] 進樣體積：10 yl
[0025] 檢測器：紫外檢測器
[0026] 波長：234nm [0027] 流動相梯度如下：
[0028]
[0029] 1. 4肝素酶I、II、III完全酶解步驟
[0030] 20 y 1樣品+70 y 1乙酸鈣溶液（pH = 7. 0)+100 y 1肝素酶I、II、III混合溶液 (pH 7. 0磷酸二氫鈉溶液溶解），混勻，置于25 °C水浴中反應48h，滅活，過濾后進樣。
[0031] 肝素基本二糖單位分析條件同1. 3部分酶解糖鏈分析條件
[0032] 1. 5部分酶解步驟同1. 3肝素酶I部分酶解步驟
[0033] 1.6Bio_Gel P10自裝凝膠柱分離寡糖條件
[0034] 色譜柱：Bio_Gel P10自裝凝膠柱
[0035] 流動相：1. Omol. L 1氯化鈉
[0036] 流速：0? 4ml/min
[0037] 進樣體積：lml
[0038] 檢測器：紫外檢測器
[0039] 波長：232nm
[0040] 1. 7交聯葡聚糖凝膠G25自裝脫鹽柱脫鹽條件
[0041] 色譜柱：交聯葡聚糖凝膠G25自裝脫鹽柱
[0042] 流動相：超純水
[0043] 流速：0? 9ml/min
[0044] 進樣體積：lml
[0045] 檢測器：紫外檢測器
[0046] 波長：215nm
[0047] 1. 8質譜解析條件
[0048] 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C 18(5 ym，0. 5 X 250mm)毛細柱
[0049] 流動相 A :15mmol. L 1 三丁胺水溶液（pH = 7. 0)
[0050] 流動相 B :15mmol. L 1 三丁胺，75% 乙腈溶液（pH = 7. 0);
[0051] 流速：10lil/min
[0052] 洗脫梯度：0 ~5min，20% B ;5 ~65min，20 ~60% B。
[0053] 質譜條件為：噴霧電壓：+3. 6kV ;噴霧氣流速：0. 5L/min ;掃描質量范圍：900~ 3000 〇
[0054] 2. 1亞硝酸鈉降解步驟
[0055] 取樣品溶液500 y 1，加lmol. L 1鹽酸溶液250 y 1混合，加入250mg/ml的亞硝酸 鈉溶液50 y 1，
[0056] 輕輕混勻，并在室溫放置40min，加入lmol. L 1氫氧化鈉溶液200 y 1終止反應。
[0057] 2. 2DS二糖單位分析條件
[0058] 色譜柱：Waters Spherisorb S5 SAX (4. 0*250mm)
[0059] 流動相：A---超純水（鹽酸調pH至3. 5) ;B---lmol. L 1氯化鈉（鹽酸調pH至3. 5)
[0060] 流速：1.0ml/min 柱溫：35°C進樣體積：20 y 1
[0061] 檢測器：紫外檢測器波長：240nm流動相梯度如下：
[0062] 四.【附圖說明】 圖1 :舒洛地特肝素組分完整糖鏈色譜圖 圖2 :舒洛地特肝素組分部分酶解糖鏈色譜圖 圖3 :舒洛地特肝素組分全酶解二糖色譜圖 圖4 :舒洛地特肝素組分部分酶解P10分析寡糖色譜圖 圖5 :舒洛地特肝素寡糖脫鹽色譜圖 圖6 :舒洛地特肝素寡糖總離子流色譜圖 圖7 :舒洛地特硫酸皮膚素組分全酶解二糖色譜圖。
【主權項】
1. 一種進行舒洛地特組分精細結構確定的分析方法，包含對硫酸皮膚素及肝素組分的 酶解、分離，最后采用高效液相色譜或液質聯用檢測方法進行肝素組分及硫酸皮膚素組分 結構分析，其特征在于： 肝素組分結構分析：先用硫酸軟骨素 ABC酶對硫酸皮膚素組分進行特異性酶解得到肝 素組分，其次用肝素酶I進行部分酶解，得到肝素寡糖及部分二糖；或用肝素酶I、II、III進 行完全酶解得到二糖后進行肝素組分結構分析； 肝素組分特征基團結構解析：首先用肝素酶I輕度降解肝素組分，再用Bio-Gel PlO自 裝凝膠柱進行寡糖分離并依次收集各組分，最后用交聯葡聚糖凝膠G25自裝脫鹽柱分別脫 鹽后，用質譜對肝素各組分精細結構進行解析； 硫酸皮膚素組分解析：先用亞硝酸鈉降解肝素，得到硫酸皮膚素組分，然后用硫酸軟骨 素 ABC酶酶解硫酸皮膚素，進行其二糖結構分析。2. 根據權利要求1所述的一種舒洛地特組分精細結構確定的分析方法，其特征在于： (1) 前處理方式：硫酸軟骨素 ABC酶酶解硫酸皮膚素組分，酶解溫度37°C，酶解時間為 4h ;肝素酶部分酶解（單獨用肝素酶I或III酶解）的酶解溫度為25°C，酶解時間為24h ; 肝素酶全酶解（肝素酶I、II、III混合酶解）的酶解溫度為25°C，酶解時間為48h ; 亞硝酸鈉降解肝素組分：取濃度為l〇mg/ml的樣品溶液500 μ 1，加 lmol. L 1鹽酸溶液 250 μ 1混合，加入250mg/ml的亞硝酸鈉溶液50 μ 1，輕輕混勾，并在室溫放置40min，加入 lmol. L 1氫氧化鈉溶液200 μ 1終止反應； (2) Bi〇-Gel PlO自裝凝膠柱分離寡糖條件：色譜柱=Bio-Gel PlO自裝凝膠柱；流動 相：1. Omol. L 1氯化鈉溶液；流速：0. 4ml/min ;進樣體積：1ml ;檢測器：紫外檢測器；檢測波 長：232nm ; (3) 交聯葡聚糖凝膠G25自裝脫鹽柱脫鹽條件：色譜柱：交聯葡聚糖凝膠G25自裝脫 鹽柱；流動相：超純水；流速：〇. 9ml/min ;進樣體積：1ml ;檢測器：紫外檢測器；檢測波長： 215nm〇3. 根據權利要求1所述的一種舒洛地特組分精細結構確定的分析方法，其特征在于： 酶解后肝素組分結構分析高效液相色譜檢測條件： (1) 完整糖鏈分析檢測條件：色譜柱為TSK 3000SWxl (7. 8mm*30cm);流動相為0. 77% 乙酸銨溶液（含〇.〇2%疊氮鈉溶液）；流速為0.41]11/1]1丨11;柱溫為30°(： ;進樣體積為20以1; 檢測器為示差折光檢測器；檢測依據為以酶解標樣的保留時間為定性依據來檢測待測樣品 的酶解產物； (2) 肝素酶I部分酶解后糖鏈分析檢測條件：色譜柱為Waters Spherisorb S5SAX (4. 0*250mm);流動相 A 為 0. 04% 的 NaH2PO4溶液，流動相 B 為 0. 04% 的 NaH 2P04-14% 的NaClO4溶液；流速為0. 45ml/min ;柱溫為35°C;進樣體積為10 μ 1 ;檢測器為紫外檢測器， 檢測波長為234nm ;采用梯度洗脫方式； (3) 肝素酶I、II、III全酶解后二糖分析檢測條件同（3)-②檢測條件。4. 根據權利要求1所述的一種舒洛地特組分精細結構確定的分析方法，其特征在于： 肝素組分特征基團結構質譜解析條件：色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18 (5 μπι， 0· 5X250mm)毛細柱；流動相A :15mmol. L 1三丁胺水溶液（pH = 7· 0)，流動相B :15mmol. 1^三丁胺，75%乙腈溶液（?!1 = 7.0);流速：1(^1/1^11;洗脫梯度：0~51^11，20%8;5~ 65min，20~60% B ;質譜條件為：噴霧電壓：+3. 6kV ;噴霧氣流速：0. 5L/min ;掃描質量范 圍：900 ~3000。5.根據權利要求1所述的一種舒洛地特組分精細結構確定的分析方法，其特 征在于：硫酸皮膚素二糖結構高效液相色譜檢測條件：色譜柱：Waters Spherisorb 353厶乂(4.0*250臟）；流動相4:超純水（鹽酸調？!1至3.5)，流動相8:1臟〇1丄 1氯化鈉（鹽 酸調pH至3. 5);流速：1.0ml/min ;柱溫：35°C ;進樣體積：20 μ 1 ;檢測器：紫外檢測器；檢 測波長：240nm ;采用梯度洗脫方式。
【文檔編號】G01N30/02GK105891343SQ201410758914
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年12月6日
【發明人】田立華, 曹紅光, 李穎穎, 王建強, 苗偉, 趙永強, 閻冬明, 祁靜
【申請人】煙臺東誠藥業集團股份有限公司