抗癌劑感受性判定標記的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種能夠判別各個患者的治療反應性的抗癌劑感受性判定標記和利用其的新的癌癥治療方法。選自在質量分析儀中本體或其片段是作為m/z＝149.05～149.06的陰離子被檢測出的分子、作為m/z＝152.99～153.00的陰離子被檢測出的分子、作為m/z＝724.34～724.35的陽離子被檢測出的分子、谷胱甘肽、亞牛磺酸、1?甲基煙酰胺、牛磺酸、谷胱甘肽二硫化物、S?腺苷高半胱氨酸、煙酰胺、γ?谷氨酰半胱氨酸和精胺中的一種以上的分子作為抗癌劑感受性判定標記，在用于判定大腸癌的抗癌劑感受性的試劑盒的制造中的用途，其中，上述抗癌劑是伊立替康、SN?38和/或它們的鹽。
【專利說明】抗癌劑感受性判定標記
[0001 ] 本案是申請日為2010年10月29日、申請號為201080049509.5 (PCT/JP2010/069364)、發明名稱為抗癌劑感受性判定標記的專利申請的分案申請。
技術領域
[0002]本發明涉及用于判定作為對象的患者的癌對于欲使用的抗癌劑是否具有治療反應性的抗癌劑感受性判定標記及其應用。
【背景技術】
[0003]抗癌劑，有烷基化劑、鉑制劑、代謝拮抗劑、抗癌性抗生素、抗癌性植物生物堿等種類。這些抗癌劑中，根據癌的種類不同，有時顯示效果，有時不顯示效果。但是，已知即使是認為有效的種類的癌，也因各個患者而異有時顯示效果，有時不顯示效果。這種抗癌劑對于各個患者的癌是否顯示效果稱為抗癌劑感受性。
[0004]鹽酸伊立替康(CPT-1l)是日本開發的具有I型拓撲異構酶(Topoisomerase I)抑制作用機理的抗癌劑。在日本，CPT-1I作為對非小細胞肺癌、小細胞肺癌、宮頸癌、卵巢癌的有效藥劑而在1994年I月得到認可，并在1995年7月認可其適用于胃癌、結腸-直腸癌、乳腺癌、鱗狀細胞癌、惡性淋巴瘤。CPT-1l特別是在大腸癌領域作為多劑并用療法的一線藥物(First line drug)或者二線藥物(second line drug)占據了世界標準治療用藥的位置，其有用性得到認可(非專利文獻I?6)。
[0005]對晚期-轉移大腸癌的化學療法，通過并用二十世紀90年代登場的CPT-11、奧沙利鈾等關鍵藥物(key drug)和當時作為大腸癌治療的中心藥劑的氟尿啼啶(5-FU)為中心的氟化嘧啶制劑，能夠戲劇般的改善以生存率為基礎的臨床成績，但是現狀是奏效率大約只有50%左右，冒著很重的副作用這樣的高風險投與抗癌劑的患者，有一半是無效的，確立判別個體的治療反應性(反應-無反應)的抗癌劑感受性預測標記是當務之急。
[0006]通常，癌化學療法的治療療程是長期進行的，事實上，只有在觀察副作用的出現而進行了幾個療程的治療之后才能判斷是否取得效果以及是否應該繼續給藥，但是到了這樣的時候，則需要花費長期的時間和高額的醫藥費，也出現了副作用。因此，如果有對于各個患者在治療前或者治療早期就能夠預測是否能夠得到效果的方法，就能夠減輕患者的負擔和副作用表現，削減醫藥費。
[0007]CPT-1I雖然自身具有抗腫瘤活性，但在體內通過羧酸酯酶(Carboxyl esterase)活化，轉換為抗腫瘤活性比CPT-1l強大約100?數千倍的7-乙基-10-羥基喜樹堿(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin，SN-38)。據認為CPT-11和SN-38同時在體內存在，呈現抗腫瘤效果。SN-38在肝細胞內通過UDP-葡萄糖醛酸基轉移酶(UGT:UDP-g lucurono sy Itransferase)接受葡萄糖醛酸化，成為沒有細胞毒性的葡萄糖醛酸化的SN-38(SN-38G)，主要排泄至膽汁中而向腸道移動，其后，排泄到糞便中。排泄到腸道的一部分SN-38G通過腸內細菌所具有的β-葡萄醣醛酸酶脫去葡萄糖醛酸，再次成為活性型SN-38，并經由通過腸道上皮的轉運蛋白再吸收而進行腸肝循環、通過腸上皮細胞內的UGT進行葡萄糖醛酸化等步驟而被代謝、排泄(非專利文獻7)。此時，認為SN-38損害腸道粘膜，誘發腹瀉。此外，還會對細胞分裂活躍的骨髓產生影響，引起紅細胞減少、白細胞減少、血小板減少。
[0008]嚴重的腹瀉、嗜中性粒細胞減少癥等副作用，UGTlAl遺傳多態性所帶來的SN-38體內暴露量的變化顯示為一個原因。但是，涉及治療效果，由于從作為前藥的CPT-1l向活性代謝物SN-38的轉換和其解毒、在腸道循環過程中SN-38的再生成、CPT-1l自身的代謝和從代謝物生成SN-38的所謂體內動態的復雜性，此外，由于抗腫瘤效果多受腫瘤方面的主要原因所決定，因此，還沒有通過藥物動態能夠預測治療效果的報告。還有報告，末梢血單核球細胞的羧酸酯酶mRNA表達量與SN-38和SN-38G的AUC比相關，但是與腫瘤縮小效果不相關(非專利文獻8)。
[0009]作為CPT-1l感受性或耐性相關的腫瘤方面的因子，報告有作為SN-38的標的的I型拓撲異構酶(Topoisomerase I)有無突變及表達量、參與從CPT-11向SN-38轉換的羧酸酯酶活性(非專利文獻9 )、影響CPT-11、SN-3 8的細胞內蓄積量的轉運蛋白(mu 11 i drugresistance protein(MRP)_l、MRP_2、Breast cancer resistant protein(BCRP)/ABCG2)的參與，此外，有關于細胞增殖抗原K1-67、癌抑制基因p53等與使用CPT-11治療的反應性的關聯的研究。最近，在體外(in vitro)，試著通過組合抗癌劑感受性數據和微陣列數據來系統地預測抗癌劑感受性，研究了喜樹堿類的托泊替康(非專利文獻10)。在臨床研究中，最近報告了具有抗細胞凋亡作用的金屬蛋白酶I組織抑制劑(Ti ssue inhibitor ofmetalloproteinase-1，TIMP-1)的血楽中水平，與對轉移結腸-直腸癌的CPT-11+5-FU并用療法的臨床預后的相關有顯著性(非專利文獻11)。
[0010]雖然認識到對CPT-1l的感受性預測生物標記的必要性而做了很多研究，但是也有報告等指出，對于作為標的的I型拓撲異構酶(Topoisomerase I)而言，與作為5-FU感受性預測因子的胸苷酸合酶，均沒有發現與5-FU+CPT-11并用療法的治療反應性之間有明確的關聯性(非專利文獻12)，并未確立預測治療反應性的明確的生物標記。現有技術文獻
[0011]非專利文獻
[0012]非專利文獻1:JClin Oncol 1993;11:909-913
[0013]非專利文獻2:SeminOncol 1999;26(lSuppl5):6-12
[0014]非專利文獻3:Lancet 1998;352:1407-1412
[0015]非專利文獻4:ProASCO 2005；Abstract#3506
[0016]非專利文獻5:NEngl J Med 2000;343:905-914
[0017]非專利文獻6:Lancet 2000;355:1041-1047
[0018]非專利文獻7:Cancer Res 1991;51:4187-4191
[0019]非專利文獻8:Cl in Cancer Res 2005;11:6901-6907
[0020]非專利文獻9:PharmacogenetGenomics 2007 ； 17:1-10
[0021]非專利文獻10:Nat Med 2006;12:1294-1300
[0022]非專利文獻ll:ClinCancer Res 2007;13:4117-4122
[0023]非專利文獻12:1nt J Cancer 2004;111:252-258
【發明內容】
[0024]發明要解決的課題
[0025]本發明的目的在于提供一種能夠判別各個患者的治療反應性的抗癌劑感受性判定標記和利用其的新的癌癥治療方法。
[0026]用于解決課題的方法
[0027]為此，本發明的發明人培養人癌細胞株，使用毛細管電泳-飛行時間型質量分析儀(CE-TOFMS)對SN-38暴露后的細胞內代謝改變進行網羅式分析，進行抗癌劑感受性判定標記的探索，發現在SN-38低感受性細胞中確認SN-38暴露后細胞內水平顯著上升的峰，或在SN-38高感受性細胞中確認SN-38暴露后細胞內水平顯著上升的峰，并發現該峰是在質量分析儀中，本體或其片段是作為m/z = 149.05?149.06的陰離子被檢測出的分子、作為m/z =152.99?153.00的陰離子被檢測出的分子、作為m/z = 724.34?724.35的陽離子被檢測出的分子、甘油三磷酸、二氫生物蝶呤(Dihydrob1pterin:BH2)、γ -氨基丁酸(GABA)、乳酸、2-甲基丁酰肉毒堿。此外，發現SN-38高感受性細胞或SN-38低感受性細胞中，在SN-38暴露后，天冬酰胺、天冬氨酸表現出與對照組不同的細胞內水平的變動，并發現通過將SN-38暴露時的天冬酰胺對天冬氨酸的比除以SN-38非暴露時的天冬酰胺對天冬氨酸的比所算出的值是抗癌劑的感受性判定標記。此外，本發明的發明人培養8種人癌細胞株，對于這些人癌細胞株的細胞內代謝物，使用CE-TOFMS進行抗癌劑感受性判定標記的探索，發現伴隨著對抗癌劑感受性的降低而細胞內水平上升的代謝物，發現該代謝物是GABA、1-甲基腺苷、谷胱甘肽(GSH)所參與的代謝系統上的物質。基于上述見解進一步進行研究，結果發現，如果將來自癌癥患者機體的試樣中的這些代謝物的濃度、上述代謝物濃度的比作為指標，就能夠判定該癌癥患者的癌對于抗癌劑是否有感受性，此外，如果將這些代謝物的濃度、改變、上述代謝物濃度的比作為指標，就能夠進行抗癌劑感受性增強劑的篩選，如果并用該抗癌劑感受性增強劑和作為感受性興奮對象的抗癌劑，就能夠大幅提高該抗癌劑的治療效果，從而完成了本發明。
[0028]即，本發明提供一種抗癌劑感受性判定標記，其包含選自在質量分析儀中，本體或其片段是作為m/z = 149.05?149.06的陰離子被檢測出的分子(以下，稱為代謝物A)、作為m/z = 152.99?153.00的陰離子被檢測出的分子(以下，稱為代謝物B)、作為m/z = 724.34?724.35的陽離子被檢測出的分子(以下，稱為代謝物D)、甘油三磷酸、二氫生物蝶呤、GABA、乳酸、天冬酰胺、天冬氨酸、2-甲基丁酰肉毒堿、1-甲基腺苷、谷胱甘肽和這些分子所參與的代謝系統上的物質中的一種以上的分子。
[0029]此外，本發明提供一種抗癌劑感受性的判定方法，其特征在于，測定檢測體中的上述物質。
[0030]此外，本發明提供一種用于實施抗癌劑感受性的判定方法的試劑盒，其特征在于，包括用于測定上述物質的方案。
[0031 ]此外，本發明提供一種以上述物質的表達改變為指標的抗癌劑感受性增強劑的篩選方法。
[0032]此外，本發明提供一種由上述篩選方法得到的抗癌劑感受性增強劑。
[0033]此外，本發明提供一種含有上述抗癌劑感受性增強劑和作為感受性增強對象的抗癌劑的組合的癌治療用組合物。
[0034]此外，本發明提供用于判定抗癌劑感受性的上述物質。
[0035]發明的效果
[0036]使用本發明的抗癌劑感受性判定標記，就能夠在抗癌劑給藥前或抗癌劑給藥開始后早期適宜判定各個患者的抗癌劑治療反應性，結果，能夠選擇具有更高治療效果的抗癌劑，作為其結果，能夠防止不能期待治療效果的抗癌劑的繼續給藥所帶來的癌癥進展、副作用的增大，并且還能夠期待減少患者的負擔，削減醫療費。此外，使用該標記，就能夠篩選增強抗癌劑感受性的藥劑，如果并用作為其對象的抗癌劑和抗癌劑感受性增強劑，就能夠大幅提高癌治療效果。本發明的抗癌劑感受性判定標記的測定試劑，作為抗癌劑感受性判定試劑是有用的。
【附圖說明】
[0037]圖1為表示50nmol/L SN-38暴露時，HT-29、HCT_116細胞的平均生存率隨時間變化的圖。
[0038]圖2為表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露后的代謝物A的細胞內水平隨時間變化的圖。
[0039]圖3為表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露后的代謝物B的細胞內水平隨時間變化的圖。
[0040]圖4為表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露后的2-甲基丁酰肉毒堿的細胞內水平隨時間變化的圖。
[0041 ] 圖5為表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露后的BH2的細胞內水平隨時間變化的圖。
[0042]圖6為表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露后的代謝物D的細胞內水平隨時間變化的圖。
[0043]圖7為表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露后的甘油三磷酸的細胞內水平隨時間變化的圖。
[0044]圖8為表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露后的GABA的細胞內水平隨時間變化的圖。
[0045]圖9為表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露后的乳酸的細胞內水平隨時間變化的圖。
[0046]圖10為表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露后的天冬酰胺的細胞內水平隨時間變化的圖。
[0047]圖11為表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露后的天冬氨酸的細胞內水平隨時間變化的圖。
[0048]圖12為表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露時的天冬酰胺對天冬氨酸的比除以SN-38非暴露時的天冬酰胺對天冬氨酸的比所計算出的值([天冬酰胺/天冬氨酸]SN-38/[天冬酰胺/天冬氨酸]對照)隨時間變化的圖。
[0049]圖13為表示穩定狀態中的GABA的細胞內水平和各癌細胞株中的SN-38感受性的關系的圖。
[0050]圖14為表示對8種人大腸癌細胞株的SN-38感受性的圖。
[0051 ]圖15為表示穩定狀態下的1-甲基腺苷、GABA、亞牛磺酸、谷胱甘肽、1_甲基煙酰胺的細胞內水平與各癌細胞株中的SN-38感受性的關系的圖。
[0052]圖16為表示穩定狀態下的谷胱甘肽代謝系統上的物質的細胞內水平與各癌細胞株中的SN-38感受性的關系的圖。
【具體實施方式】
[0053]本發明的抗癌劑感受性判定標記，是選自代謝物A、B、D、甘油三磷酸、二氫生物蝶呤、GABA、乳酸、天冬酰胺、天冬氨酸、2-甲基丁酰肉毒堿、1-甲基煙酰胺、谷胱甘肽和這些分子所參與的代謝系統上的物質的分子(以下，也稱為“代謝系統物質”)。其中，作為代謝物A、B、D，是在毛細管電泳-飛行時間型質量分析儀(CE-TOFMS)中，本體或其片段是作為m/z =149.05?149.06的陰離子被檢測出的分子、本體或其片段是作為m/z = 152.99?153.00的陰離子被檢測出的分子、本體或其片段是作為m/z = 724.34?724.35的陽離子被檢測出的分子。此外，包括使得這些分子的濃度改變的代謝系統上的全部的物質，作為該物質，可以舉出增強代謝為這些分子的物質、抑制的物質、促進從這些分子代謝的物質、抑制的物質等。
[0054]本發明的抗癌劑感受性判定標記之一，是甘油三磷酸或其所參與的代謝系統上的物質(也稱為甘油三磷酸代謝系統物質)，作為該物質，除了甘油三磷酸之外，還包括代謝系統中使得甘油三磷酸的濃度改變的所有的物質，可以舉出增強向甘油三磷酸代謝的物質、抑制的物質，促進從甘油三磷酸代謝的物質、抑制的物質等。這些中，特別優選甘油三磷酸。
[0055]本發明中的抗癌劑感受性判定標記之一，是二氫生物蝶呤(BH2)或其所參與的代謝系統上的物質(也稱為BH2代謝系統物質)，作為該物質，除了BH2，還包括代謝系統中使得BH2的濃度改變的全部的物質，可以舉出增強向BH2代謝的物質、抑制的物質、促進從BH2代謝的物質、抑制的物質等。這些中，特別優選BH2。
[0056]本發明中的抗癌劑感受性判定標記之一，是GABA或其所參與的代謝系統上的物質(也稱為GABA代謝系統物質)，作為該物質，除了GABA，還包括代謝系統中使得GABA濃度改變的全部的物質，可以舉出增強向GABA代謝的物質、抑制的物質、促進從GABA代謝的物質、抑制的物質等。這些中，特別優選GABA。
[0057]本發明中的抗癌劑感受性判定標記之一，是乳酸或其所參與的代謝系統上的物質(也稱為乳酸代謝系統物質)，作為該物質，除了乳酸，還包括代謝系統中使得乳酸濃度改變的全部的物質，可以舉出增強向乳酸代謝的物質、抑制的物質、促進從乳酸代謝的物質、抑制的物質等。這些中，特別優選乳酸。
[0058]本發明中的抗癌劑感受性判定標記之一，是天冬酰胺、天冬氨酸或它們所參與的代謝系統上的物質。在為天冬酰胺和天冬氨酸的情況下，它們的比很重要，具體而言，可以舉出根據天冬酰胺和天冬氨酸的濃度算出的天冬酰胺對天冬氨酸的比，更具體而言，抗癌劑暴露時的天冬酰胺對天冬氨酸的比除以抗癌劑非暴露時的天冬酰胺對天冬氨酸的比所算出的值
[0059]([天冬酰胺/天冬氨酸]_^[天冬酰胺/天冬氨酸]*ff1。
[0060]作為計算該比時所使用的物質，除了天冬酰胺、天冬氨酸，能夠使用天冬酰胺、天冬氨酸所參與的代謝系統上的物質(也稱為天冬酰胺代謝系統物質、天冬氨酸代謝系統物質)，還包括代謝系統中使得天冬酰胺、天冬氨酸濃度改變的全部的物質，可以舉出增強向天冬酰胺、天冬氨酸代謝的物質、抑制的物質、促進從天冬酰胺、天冬氨酸代謝的物質、抑制的物質等。這些中，特別優選天冬酰胺、天冬氨酸。
[0061]本發明中的抗癌劑感受性判定標記之一，是2-甲基丁酰肉毒堿或其所參與的代謝系統上的物質(也稱為2-甲基丁酰肉毒堿代謝系統物質)，作為該物質，除了2-甲基丁酰肉毒堿，還包括代謝系統中使得2-甲基丁酰肉毒堿濃度改變的全部的物質，可以舉出增強向2-甲基丁酰肉毒堿代謝的物質、抑制的物質、促進從2-甲基丁酰肉毒堿代謝的物質、抑制的物質等。這些中，特別優選2-甲基丁酰肉毒堿。
[0062]本發明中的抗癌劑感受性判定標記之一，是1-甲基腺苷或其所參與的代謝系統上的物質(也稱為1-甲基腺苷代謝系統物質)，作為該物質，除了 1-甲基腺苷，還包括代謝系統中使得1-甲基腺苷濃度改變的全部的物質，可以舉出增強向1-甲基腺苷的代謝興奮的物質、抑制的物質、促進從1-甲基腺苷代謝的物質、抑制的物質等。這些中，特別優選1-甲基腺苷。
[0063]本發明中的抗癌劑感受性判定標記之一，是谷胱甘肽或其所參與的代謝系統上的物質(也稱為谷胱甘肽代謝系統物質)，作為該物質，除了谷胱甘肽，還包括代謝系統中使得谷胱甘肽濃度改變的全部的物質，可以舉出增強向谷胱甘肽代謝的物質、抑制的物質、促進從谷胱甘肽代謝的物質、抑制的物質等。這些中，優選谷胱甘肽、亞牛磺酸、1-甲基煙酰胺、牛磺酸、谷胱甘肽二硫化物(GSSG)、S_腺苷高半胱氨酸、煙酰胺、γ -谷氨酰半胱氨酸(γ-Glu-Cys)、精胺，特別優選谷胱甘肽、亞牛磺酸、1-甲基煙酰胺。
[0064]代謝物A、B、2_甲基丁酰肉毒堿，如后述的實施例所示，在SN-38暴露后，在作為SN-38低感受性的HT-29中，觀察到細胞內水平顯著上升。另一方面，在作為SN-38高感受性的HCT-116中，沒有觀察到細胞內水平的顯著改變。因此，這些物質，特別是作為CPT-1USN-38等的抗癌劑感受性判定標記是有用的。
[0065]代謝物D、甘油三磷酸、BH2、乳酸，如后述的實施例所示，在SN-38暴露后，在作為SN-38高感受性的HCT-116中，觀察到細胞內水平顯著上升。另一方面，在作為SN-38低感受性的HT-29中，沒有觀察到細胞內水平的顯著變化。因此，這些物質，特別是作為CPT-11、SN-38等的抗癌劑感受性判定標記是有用的。
[0066]GABA，如后述的實施例所示，在SN-38暴露后，在作為SN-38低感受性的HT-29中，觀察到細胞內水平顯著上升。另一方面，在作為SN-38高感受性的HCT-116中，沒有觀察到細胞內水平的顯著改變。此外，作為原先的代謝物水平，在SN-38低感受性的HT-29中，細胞內水平高，在SN-38高感受性的HCT-116中，細胞內水平低。再者，使用8種人癌細胞株進行研究，隨著對SN-38感受性的降低，細胞內GABA水平上升。因此，GABA，特別是作為CPT-1USN38等的抗癌劑感受性判定標記是有用的。
[0067]天冬酰胺，如后述的實施例所示，在作為SN-38高感受性的HCT-116中，在SN-38暴露后表現出與對照組不同的細胞內水平的改變，但是，在作為SN-38低感受性的HT-29中，沒有觀察到SN-38暴露組與對照組存在細胞內水平的差異。此外，天冬氨酸，如后述的實施例所示，在作為SN-38低感受性的HT-29中，在SN-38暴露后，表現出與對照組不同的細胞內水平的改變，但是在作為SN-38高感受性的HCT-116中，沒有觀察到SN-38暴露組與對照組存在細胞內水平的差異。SN-38暴露時的天冬酰胺對天冬氨酸的比除以SN-38非暴露時的天冬酰胺對天冬氨酸的比而算出的值([天冬酰胺/天冬氨酸]I38/[天冬酰胺/天冬氨酸]3?)，在作為SN-38高感受性的HCT-116中，觀察到其顯著上升，另一方面，在作為SN-38低感受性的HT-29中，觀察到其顯著減少。因此，該天冬酰胺與天冬氨酸濃度的比，特別是作為CPT-11、SN-38等的抗癌劑感受性判定標記是有用的。
[0068]1-甲基腺苷、谷胱甘肽代謝系類物質，如后述的實施例所示，使用8種人癌細胞株進行研究，隨著對SN-38感受性的降低，細胞內的這些物質的水平上升。因此，1-甲基腺苷、谷胱甘肽代謝系統物質，特別是作為CPT-1USN-38等的抗癌劑感受性判定標記是有用的。
[0069]作為本發明的抗癌劑感受性判定標記的對象的抗癌劑，沒有特別限定，例如，可以舉出0?1'-11、5?^-38、奧沙利鉬、環磷酰胺(07(31(^1108。1^1111(16)、異磷酰胺(1:[>08€31111(16)、噻替哌(^11；!_(^6口3)、美法侖(11^1口1^1311)、白消安(busulfan)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimus tine)、達卡巴嘆(dacarbaz ine )、丙卡巴餅(procarbaz ine )、替莫挫胺(temozo1mide)、順鉬(cisplatin)、卡鉬(carboplatin)、奈達鉬(nedaplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、氟尿啼啶(f IuorouraciI)、替加氟/尿啼啶(tegaful/uracil)、脫氧氟尿苷(doxifluridine)、替加氟/吉美拉西/奧替拉西(tegaful/gimeraci 1/oteraci I)、卡培他濱(03口60；^313；!_116)、阿糖胞苷(cytarabine)、依諾他濱(enocitabine)、吉西他濱(36111(3；!^313；!_116)、6-疏基嘌呤(6161^3。七(^111'；!_116)、氣達拉濱(f Iudarabin)、噴司他汀(pentostatin)、克拉屈濱(cladribine)、輕基脈(hydroxyurea)、多柔比星(<^010!'1113；!_(3；!_11)、表柔比星(6。；!_1'1113；!_(3；!_11)、佐柔比星((13111101'1113；!_(3；!_11)、依達比星(idarubicine)、卩比柔比星(pirarubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、氨柔比星(amurub icin)、放線菌素 D(actinomycin D)、博來霉素(bleomycine)、派來霉素(pep leomyc in)、絲裂霉素 C(mytomycin C)、阿柔比星(aclarubicin)、凈司他丁(zinostatin)、長春新減(vincristine)、長春地辛(vindesine)、長春減(vinblastine)、長春瑞濱(vinoreIbine)、紫杉醇(pacI i taxeI)、多西紫杉醇(docetaxeI)、托泊替康(nogitecan，topotecan)、依托泊苷(etoposide)、潑尼松龍(prednisolone)、地塞米松(dexame thasone )、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、甲輕孕酮(medroxyprogesterone)、|5可男|3 曲P坐(anastrozole)、依西美坦(exemestane)、來曲 P坐(Ietrozole)、利妥昔(rituximab)、伊馬替尼(;!_11^七;!_11；!_13)、吉非替尼(36:[>;^;!_11；!_13)、吉姆單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、硼替佐米(bortezomib)、厄洛替尼(er1tinib)、西妥昔單抗(cetuximab)、貝伐單抗(be vac i zumab )、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、達沙替尼(dasatinib)、帕尼單抗(panitumumab)、門冬酰胺酶(asparaginase)、維甲酸(tretinoin)、三氧化二砷(arsenic tr1xide)、或它們的鹽、或它們的活性代謝物等。其中，優選植物生物堿類抗癌劑，特別優選CPT-11、SN-38或者它們的土卜
ΠΤΤ.0
[0070]在使用本發明的抗癌劑感受性判定標記判定抗癌劑感受性時，測定檢測體中的這些代謝系統物質即可。在此，作為檢測體，可以列舉來自患有癌的被檢驗者(癌患者)機體的試樣，例如，可以列舉血液、血清、血漿、尿、癌組織-細胞、腹水、胸水、腦脊液、便、痰等，但特別優選血清。
[0071]另外，作為本發明對象的癌，可以列舉以喉癌為代表的唇、口腔和喉癌、以食道癌、胃癌、結腸-直腸癌等為代表的消化器官癌、以肺癌為代表的呼吸器官和胸腔內臟器官癌、骨及關節軟骨癌、皮膚的惡性黑色素瘤、鱗狀細胞癌及其它皮膚癌、以間皮瘤為代表的間皮和軟組織癌、以乳腺癌、子宮癌、卵巢癌為代表的女性性器官癌、以前列腺癌為代表的男性性器官癌、以膀胱癌為代表的尿路癌、以腦腫瘤為代表的眼、腦和中樞神經系統癌、甲狀腺和其它內分泌腺癌，以非何杰金氏淋巴瘤和淋巴細胞性白血病為代表的淋巴組織、造血組織和關聯組織癌、以及以這些癌為原發病灶的轉移組織的癌等，但特別是能夠對非小細胞肺癌、小細胞肺癌、宮頸癌、卵巢癌、胃癌、結腸-直腸癌、鱗狀細胞癌、惡性淋巴瘤適合地利用。
[0072]檢測體中這些代謝系統物質的測定方法，可以根據被測定對象物來適宜決定，例如，可以通過CE-TOFMS、Gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)等各種質量分析裝置、HPLC、免疫學測定方法、生化學測定方法等測定。
[0073]對于代謝物A、B、2_甲基丁酰肉毒堿而言，在判定作為對象的抗癌劑的感受性時，測定抗癌劑給藥前和給藥后的來自癌癥患者機體的試樣中的這些代謝系統物質濃度，如果與抗癌劑給藥前相比，給藥后這些代謝系統物質的濃度上升，則能夠判定該癌沒有抗癌劑感受性，如果在抗癌劑給藥前后這些代謝系統物質的濃度沒有變化，則能夠判定該癌具有抗癌劑感受性。
[0074]此外，在抗癌劑給藥后的初期階段，當這些代謝系統物質的濃度判斷為比規定的標準濃度高時，能夠判定該癌對作為對象的抗癌劑沒有感受性。當對作為對象的抗癌劑沒有感受性時，不能期待該藥效，在將這種不能期待藥效的抗癌劑繼續給藥的情況下，存在癌癥進展、副作用的增大的危險。這樣，本發明的抗癌劑感受性判定標記不僅能夠判定抗癌劑治療反應性，還對防止不能期待藥效的抗癌劑的繼續給藥所帶來的副作用增大有很大貢獻。
[0075]對于代謝物D、甘油三磷酸、BH2、乳酸而言，在判定對作為對象的抗癌劑的感受性時，測定抗癌劑給藥前和給藥后的來自癌癥患者機體的試樣中的這些代謝系統物質濃度，如果與抗癌劑給藥前相比，給藥后這些代謝系統物質的濃度上升，則能夠判定該癌具有抗癌劑感受性，如果在抗癌劑給藥前后這些代謝系統物質的濃度沒有變化，則能夠判定該癌沒有抗癌劑感受性。
[0076]此外，在抗癌劑給藥后初期階段，當這些代謝系統物質的濃度判斷為比規定的標準濃度低時，能夠判定該癌對作為對象的抗癌劑沒有感受性。當對作為對象的抗癌劑沒有感受性時，不能期待該藥效。在將這種不能期待藥效的抗癌劑繼續給藥的情況下，存在癌癥進展、副作用的增大的危險。這樣，本發明的抗癌劑感受性判定標記不僅能夠判定抗癌劑治療反應性，還對防止不能期待藥效的抗癌劑的繼續給藥所帶來的副作用增大有很大貢獻。
[0077]對于GABA而言，在判定對作為對象的抗癌劑的感受性時，測定抗癌劑給藥前和給藥后的來自癌癥患者機體的試樣中的這些代謝系統物質濃度，如果與抗癌劑給藥前相比，給藥后這些代謝系統物質的濃度上升，則能夠判定該癌沒有抗癌劑感受性，如果在抗癌劑給藥前后這些代謝系統物質的濃度沒有變化，則能夠判定該癌具有抗癌劑感受性。
[0078]此外，在抗癌劑給藥前或給藥后初期階段，當這些代謝系統物質的濃度判斷為比規定的標準濃度高時，能夠判定該癌對作為對象的抗癌劑沒有感受性。當對作為對象的抗癌劑沒有感受性時，不能期待該藥效。在將這種不能期待藥效的抗癌劑繼續給藥的情況下，存在癌癥進展、副作用的增大的危險。這樣，本發明的抗癌劑感受性判定標記不僅能夠判定抗癌劑治療反應性，還對防止不能期待藥效的抗癌劑的繼續給藥所帶來的副作用增大有很大貢獻。
[0079]對于天冬酰胺、天冬氨酸的濃度之比而言，在判定對作為對象的抗癌劑的感受性時，測定抗癌劑給藥前和給藥后來自癌癥患者機體的試樣中的天冬酰胺和天冬氨酸的濃度，如果與抗癌劑給藥前相比，給藥后天冬酰胺對天冬氨酸的比上升，則能夠判定該癌具有抗癌劑感受性，如果在抗癌劑給藥前后天冬酰胺對天冬氨酸的比減少，則能夠判定該癌沒有抗癌劑感受性。
[0080]此外，在抗癌劑給藥后初期階段，當天冬酰胺對天冬氨酸的比判斷為比規定的標準低時，能夠判定該癌對作為對象的抗癌劑沒有感受性。當對作為對象的抗癌劑沒有感受性時，不能期待該藥效。在將這種不能期待藥效的抗癌劑繼續給藥的情況下，存在癌癥進展、副作用的增大的危險。這樣，本發明的抗癌劑感受性判定標記不僅能夠判定抗癌劑治療反應性，還對防止不能期待藥效的抗癌劑的繼續給藥所帶來的副作用增大有很大貢獻。
[0081]對于1-甲基腺苷、谷胱甘肽代謝系統物質而言，在判定對作為對象的抗癌劑的感受性時，在抗癌劑給藥前階段，當這些代謝系統物質的濃度判斷為比規定的標準濃度高時，能夠判定該癌對作為對象的抗癌劑沒有感受性。當對作為對象的抗癌劑沒有感受性時，不能期待該藥效。在將這種不能期待藥效的抗癌劑繼續給藥的情況下，存在癌癥進展、副作用的增大的危險。這樣，本發明的抗癌劑感受性判定標記不僅能夠判定抗癌劑治療反應性，還對防止不能期待藥效的抗癌劑的繼續給藥所帶來的副作用增大有很大貢獻。
[0082]在實施本發明的抗癌劑感受性的判定方法時，優選使用含有用于測定檢測體中的這些代謝系統物質的方案的試劑盒。該試劑盒中，包含這些代謝系統物質的測定試劑、測定試劑的使用方法、以及用于判定抗癌劑感受性有無的基準等。該基準包括這些代謝系統物質的標準濃度或標準比、判定為高的濃度或比、判斷為低的濃度或比、對測定結果產生影響的主要原因和其影響程度等，這些濃度能夠針對每個作為對象的抗癌劑進行設定。使用該基準，能夠如前所述進行判定。
[0083]如果以抗癌劑暴露后的代謝物A、B、2_甲基丁酰肉毒堿、GABA、1_甲基腺苷、谷胱甘肽代謝系統物質的表達改變，具體而言，以改變的抑制或濃度的降低為指標，就能夠篩選抗癌劑感受性增強劑。即，在體外(in vitro)或體內(in vivo)，使得代謝物A、B、2_甲基丁酰肉毒堿、GABA、1-甲基腺苷、谷胱甘肽代謝系統物質的抗癌劑暴露前的濃度降低的物質、抑制抗癌劑暴露后的改變或使得濃度降低的物質，增強抗癌劑感受性。例如，在體外(invitro)，用某種物質處理抗癌劑暴露前的各種癌細胞株時，使得細胞內的代謝物A、B、2-甲基丁酰肉毒堿、GABA、1-甲基腺苷、谷胱甘肽代謝系統物質的濃度降低的物質，是增強該抗癌劑感受性的物質(抗癌劑感受性增強劑)。此外，在體外(in vitro)，抑制各種癌細胞株中抗癌劑暴露后的細胞內的代謝物A、B、2-甲基丁酰肉毒堿、GABA、1-甲基腺苷、谷胱甘肽代謝系統物質的改變的物質，是增強該抗癌劑感受性的物質(抗癌劑感受性興奮及)。此外，在體內(in vivo)，使得荷癌動物中抗癌劑暴露前的代謝物A、B、2_甲基丁酰肉毒堿、GABA、1_甲基腺苷、谷胱甘肽代謝系統物質的濃度降低的物質，抑制抗癌劑暴露后的代謝物A、B、2-甲基丁酰肉毒堿、GABA、1-甲基腺苷、谷胱甘肽代謝系統物質的改變或使得濃度降低的物質，是增強該抗癌劑感受性的物質(抗癌劑感受性增強劑)。
[0084]此外，如果以抗癌劑暴露后的代謝物D、甘油三磷酸、BH2、乳酸的表達改變，具體而言，以改變的促進或濃度的上升為指標，就能夠篩選抗癌劑感受性增強劑。即，在體外(invitro)或體內(in vivo)，促進代謝物D、甘油三磷酸、BH2、乳酸在抗癌劑暴露后的改變或使濃度上升的物質，增強抗癌劑感受性。例如，在體外(in vitro)，促進各種癌細胞株中的抗癌劑暴露后的細胞內的代謝物D、甘油三磷酸、BH2、乳酸的改變的物質，是增強該抗癌劑感受性的物質(抗癌劑感受性增強劑)。此外，在體內(i η V i V ο )，促進荷癌動物中的抗癌劑暴露后的代謝物D、甘油三磷酸、BH2、乳酸的改變或使濃度上升的物質，是增強該抗癌劑感受性的物質(抗癌劑感受性增強劑)。
[0085]此外，如果以抗癌劑暴露后的天冬酰胺對天冬氨酸的比的改變、具體而言，以比的上升為指標，就能夠篩選抗癌劑感受性增強劑。即，在體外(in vitro)或體內(in vivo)，使得抗癌劑暴露后的天冬酰胺與天冬氨酸濃度之比上升的物質，增強抗癌劑感受性。例如，在體外(in vitro)，使得各種癌細胞株中抗癌劑暴露后的細胞內天冬酰胺與天冬氨酸濃度之比上升的物質，是增強該抗癌劑感受性的物質(抗癌劑感受性增強劑)。此外，在體內(i ηvivo)，使得荷癌動物中的抗癌劑暴露后的天冬酰胺與天冬氨酸濃度之比上升的物質，是增強該抗癌劑感受性的物質(抗癌劑感受性增強劑)。其中，作為這些濃度的比，可以使用抗癌劑暴露時的天冬酰胺對天冬氨酸的比除以抗癌劑非暴露時的天冬酰胺對天冬氨酸的比所算出的值，當使用該值時，能夠以敏銳的靈敏度篩選抗癌劑感受性增強劑。
[0086]此外，如果以代謝物A、B、2-甲基丁酰肉毒堿、GABA、1_甲基腺苷、谷胱甘肽代謝系統物質為指標，就能夠篩選抗癌劑。即，在體外(in vitro)或體內(in vivo)，如果某種物質使得這些代謝系統物質的濃度改變，則該物質為抗癌劑。例如，在體外(in vitro)，如果將某種物質暴露于各種癌細胞株后，與暴露前相比，代謝物A、B、2-甲基丁酰肉毒堿、GABA、1-甲基腺苷、谷胱甘肽代謝系統物質的濃度改變，則該物質為抗癌劑。此外，如果向荷癌動物投與某種物質后，這些代謝系統物質的濃度發生改變，則該物質為抗癌劑。如果是能夠期待藥效的抗癌劑，則這些代謝系統物質的濃度改變比腫瘤的縮小或殺死細胞效果更早出現，因此，通過以這些代謝系統物質為指標進行篩選，就能夠以更短時間的研究判定該物質作為抗癌劑是否是有用的。在削減抗癌劑開發所需的勞力和費用方面，能夠期待很好的效果。
[0087]此外，如果以代謝物D、甘油三磷酸、BH2、乳酸為指標，就能夠篩選抗癌劑。即，在體夕Kin vitro)或體內(in vivo)，如果某種物質使得這些代謝系統物質的濃度上升，則該物質為抗癌劑。例如，在體外(in vitro)，如果將某種物質暴露于各種癌細胞株后，與暴露前相比，代謝物D、甘油三磷酸、BH2、乳酸的濃度上升，則該物質為抗癌劑。此外，如果向荷癌動物投與某種物質后，這些代謝系統物質的濃度上升，則該物質為抗癌劑。如果是能夠期待藥效的抗癌劑，則這些代謝系統物質的濃度上升比腫瘤的縮小或殺死細胞效果更早出現，因此，通過以這些代謝系統物質為指標進行篩選，就能夠以更短時間的研究判定該物質作為抗癌劑是否是有用的。在削減抗癌劑開發所需的勞力和費用方面，能夠期待很好的效果。
[0088]此外，如果以天冬酰胺對天冬氨酸的比為指標，就能夠篩選抗癌劑。即，在體外(invitro)或體內(in vivo)，如果某種物質使得天冬酰胺與天冬氨酸濃度之比上升，則該物質為抗癌劑。例如，在體外(in vitro)，如果某種物質暴露于各種癌細胞株后，與暴露前相比，天冬酰胺與天冬氨酸濃度之比上升，則該物質為抗癌劑。此外，如果向荷癌動物投與某種物質后，天冬酰胺與天冬氨酸濃度之比上升，則該物質為抗癌劑。如果是能夠期待藥效的抗癌劑，天冬酰胺與天冬氨酸濃度之比的上升比腫瘤的縮小或殺死細胞效果更早出現，因此，通過以天冬酰胺與天冬氨酸濃度之比為指標進行篩選，就能夠以更短時間的研究判定該物質作為抗癌劑是否是有用的。在削減抗癌劑開發所需的勞力和費用方面，能夠期待很好的效果O
[0089]其中，作為天冬酰胺與天冬氨酸濃度之比，可以使用抗癌劑暴露時的天冬酰胺對天冬氨酸的比除以抗癌劑非暴露時的天冬酰胺對天冬氨酸的比所算出的值，當使用該值時，能夠以敏銳的靈敏度篩選抗癌劑。
[0090]如果并用這樣得到的抗癌劑感受性增強劑和作為感受性增強對象的抗癌劑，就能夠大幅提高該抗癌劑的治療效果。作為組合抗癌劑感受性增強劑和作為感受性增強對象的抗癌劑的方式，可以是包含這些成分兩者的一種組合物，也可以是各自分別的制劑的組合。此外，也可以將這些成分分別以各自的給藥方式給藥。作為在此使用的作為對象的抗癌劑，與前述同樣，可以舉出CPT-1 1、SN-38、奧沙利鉬、環磷酰胺(cyclophosphamide )、異磷酰胺(ifosfamide)、噻替哌(th1tepa)、美法侖(meIphaIan)、白消安(busulfan)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、達卡巴嘆(dacarbazine)、丙卡巴餅(procarbazine)、替莫挫胺(temozo1mide)、順鉬(cisplatin)、卡鉬(carboplatin)、奈達鉬(nedaplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、氣尿啼啶(f Iuorouracil)、替加氟/尿啼啶(tegaful/uracil )、脫氧氟尿苷(doxifluridine)、替加氟/吉美拉西 / 奧替拉西<^633:[>111/^；!_1116作(3；!_1/(^6以(3；!_1)、卡培他濱(03。6(3；^313；!_116)、阿糖胞苷(cytarabine)、依諾他濱(6110(3；^313；!_116)、吉西他濱(36111(3；^313；!_116)、6-巰基嘌呤(6-11161'0&卩七0卩111'；!_116)、氟達拉濱(:[>111(1&^13；!_11)、噴司他汀(卩61^08七&七；!_11)、克拉屈濱(cladribine)、輕基脈(hydroxyurea)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、佐柔比星(daunorubicin)、依達比星(idarubicine)、卩比柔比星(pirarubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone )、氨柔比星(amurubicin)、放線菌素D(actinomycin D)、博來霉素(131601117(3；!_116)、派來霉素(卩6卩1601117(3；!_11)、絲裂霉素(^(1117七01117(3；!_11 C)、阿柔比星(aclarubicin)、凈司他丁(zinostatin)、長春新減(vincristine)、長春地辛(vindesine)、長春堿(vinblastine)、長春瑞濱(vinore I bine)、紫杉醇(pac I i taxe I)、多西紫杉醇(do cet axel)、托泊替康(nogitecan，topotecan)、依托泊苷(etoposide)、潑尼松龍(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、他莫昔芬(tamoxi f en)、托瑞米芬(toremifene)、甲輕孕酮(medroxyprogesterone)、阿那曲挫(anastrozole)、依西美坦(exemestane)、來曲挫(Ietrozole)、利妥昔(rituximab)、伊馬替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、硼替佐米(bortezomib)、厄洛替尼(erlotinib)、西妥昔單抗(cetuximab)、貝伐單抗(be vac i zumab )、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、達沙替尼(dasatinib)、帕尼單抗(panitumumab)、門冬酰胺酶(asparaginase)、維甲酸(tretinoin)、三氧化二砷(arsenic tr1xide)、或它們的鹽、或它們的活性代謝物等。其中，優選植物生物堿類抗癌劑，特別優選CPT-1USN-38或者它們的鹽。
[0091]實施例
[0092]接著，舉出實施例，進一步詳細說明本發明。
[0093]實施例1
[0094](I)方法
[0095](a)使用細胞
[0096]使用2種人大腸癌細胞株(HCT-116、HT-29)，這些細胞從株式會社益力多本社獲得。
[0097]培養在以下條件下進行，即，Φ lOOmm/Tissue Culture Dish( IffAKI)，培養基(Doulbecco’s modified Eagle’s Medium, 10%Fetal Bovine Serum)，37°C，5%C02。
[0098](b)藥劑
[0099]SN-38散裝粉末從株式會社益力多本社獲得。SN-38溶解在DMSO中，以使在各實驗中培養基中的DMSO的濃度稀釋到0.1 %以下的方式使用。
[0100](C)對SN-38的感受性評價
[0101]對兩株細胞，通過MTS assay (Ce I ITi ter96?AQueous One Solut1n Ce 11Proliferat1n 48 8&7，？1'011168&)評價在50111]101凡的31^-38暴露24、48、72小時后的細胞生存率。在感受性評價中，用不同培養代數的細胞實施3次，每次進行3個樣品的測定，計算其平均值和標準偏差。
[0102](d)SN_38的暴露和細胞內代謝物的采取
[0103]對兩株細胞，通過更換為含有50nmol/L的SN-38的培養基而開始抗癌劑的暴露(使用僅除去SN-38的培養基作為對照組)ο在Ohr、3hr、8hr、24hr暴露后，在冰上，用5 %的甘露醇(4°C)清洗細胞后，迅速添加甲醇(4°C，含有內部標準物質)，使酶失活，保存在一80°C。其中，分別準備用于細胞計數的細胞和用于提取代謝物的細胞，進行同樣的處理后，進行細胞計數，用于細胞數補正。
[0104](e)代謝組樣品的制備
[0105]向一80 °C保存的甲醇溶液中加入氯仿和Mi I1-QA，進行液-液萃取，除去雜質成分。采取包含代謝物的水-甲醇層，使用分子量篩截5000Da的離心超濾膜進行除蛋白，之后，減壓干燥濾液，在一80°C保存。臨測定前在Mi I 1-Q水中溶解，供給代謝組測定。
[0106](f)代謝組測定
[0107]細胞內代謝物的網羅式測定由Agilent Technologies公司的毛細管電泳-飛行時間型質量分析儀(CE-TOFMS)進行。在陽離子性代謝物的網羅式測定中，以使毛細管的出口為陰極的方式施加電壓，此外，在陰離子性代謝物的網羅式測定中，以使毛細管的出口為陽極的方式施加電壓，一齊定量分析m/z = 50?1000的代謝物。
[0108]⑵結果
[0109]通過MTS assay對50nmol/L的SN-38暴露后隨時間變化的細胞生存率進行研究，各細胞的生存率在24hr暴露后幾乎沒有差異。但是，隨著暴露時間的延長，各細胞的生存率降低，其差異隨時間而擴大。72hr暴露后的細胞生存率，HT-29為大約85%，HCT-116為大約35%,與HCT-1I相比，HT-29確認為SN-38低感受性(圖1)。
[0110]通過使用CE-TOFMS進行的網羅式代謝組分析方法，對SN-38暴露所伴有的細胞內代謝組改變進行網羅式分析。對兩株細胞，比較SN-38暴露24小時的組和對照組，提取兩組中差異大的峰。對這些峰，將SN-38暴露后隨時間的改變繪成圖表，發現顯示出特征性改變的以下的代謝物(圖2?7、9?11)。
[0111](I)SN-38暴露后，在HT-29中觀察到細胞內水平顯著上升的代謝物.m/z = 149.05?149.06(陰咼子)
[0112].m/z = 152.99?153.00(陰離子)
[0113].m/z = 246.16?246.17(陽離子)
[0114](2)SN-38暴露后，在HCT-116中觀察到細胞內水平顯著上升的代謝物
[0115]m/z = 171.00(陰離子)
[0116]m/z = 240.10 ?240.11(陽離子)
[0117]m/z = 724.34 ?724.35(陽離子)
[0118]m/z = 89.02(陰離子)
[0119](3)在HCTl 16中，觀察到SN-38暴露后表現出與對照組不同的細胞內水平改變的峰
[0120]m/z = 133.06(陽離子)
[0121](4)在HT-29中，觀察到SN-38暴露后表現出與對照組不同的細胞內水平改變的峰
[0122]m/z = 134.04(陽離子)
[0123]關于m/z= 171.00的峰，使用分析軟件Analyst? QS(Applied B1systems，Inc.)，進行組成的推定。根據相對于母峰的同位素的比例、精密質量等信息推定組成，結果，作為候補峰的m/z = 171.00的離子組成為C3H8O6P13使用京都大學制作的KEGG:生命系統信息統和數據庫(http: //www.kegg.jp/)的代謝數據庫，檢索由該離子組成所推定的物質，判定該峰為甘油三磷酸。通過使用甘油三磷酸標品進行的研究，確認毛細管電泳的移動時間也是一致的。
[0124]關于m/Z= I49.05?149.06(陰離子)的峰，使用Capillary electrophoresis_quadrupole time-of-flight mass spectrometry(CE-QTOFMS)進行組成的推定。其結果，認為m/z = 149.05?149.06的離子組成為C5H9O5。
[0125]此外，關于m/z = 152.99?153.00(陰離子)的峰，使用CE-QT0FMS進行組成的推定。其結果，認為m/z = 152.99?153.00的離子組成為C3H6O5P13
[0126]此外，關于m/z = 246.16?246.17(陽離子)的峰，使用CE-QT0FMS進行組成的推定。其結果，m/z = 246.16?246.17的離子組成為&21124勵4。使用11111]1&11 Metabolome Database(http://www.hmdb.ca)檢索由該離子組成所推定的物質，判定該峰為2-甲基丁酰肉毒堿。通過使用2-甲基丁酰肉毒堿標品進行的研究，確認毛細管電泳的移動時間也是一致的。
[0127]此外，關于m/z = 240.10?240.11 (陽離子)的峰，使用CE-QT0FMS進行組成的推定。其結果，m/z = 240.10?240.11的離子組成為091114他03。使用11111]1&11 Metabolome Database(http: //www.hmdb.ca)檢索由該離子組成所推定的物質，判定該峰為二氫生物蝶呤。通過使用二氫生物蝶呤標品進行的研究，確認毛細管電泳的移動時間也是一致的。
[0128]關于m/z= 89.02的峰，使用分析軟件Analyst TMQS(Applied b1systems , Inc.)進行組成的推定。根據相對于母峰的同位素的比例、精密質量等信息推定組成，結果，作為候補峰的m/z = 89.02的離子組成為C3H5O3t3使用京都大學制作的KEGG:生命系統信息統和數據庫(http://www.kegg.jp/)的代謝數據庫，檢索由該離子組成所推定的物質，判定該峰為乳酸。通過使用乳酸標品進行的研究，確認毛細管電泳的移動時間也是一致的。
[0129]此外，對于對照組，比較兩株細胞，提取差異大的峰。其中，對于m/z = 104.070的峰，在SN-38低感受性的HT-29中，其細胞內水平高，在SN-38高感受性的HCT-116中，其細胞內水平低。此外，將SN-38暴露后隨時間的改變繪成圖表，顯示特征性的改變，由此認為是與SN-38感受性關聯的代謝物(圖8)。關于該峰，使用分析軟件Analyst ? QS(AppliedB1systems, Inc.)進行組成的推定。根據相對于母峰的同位素的比例、精密質量等信息推定組成，結果，作為候補峰的m/z = 104.070的離子組成為C4H1Q02。使用京都大學制作的KEGG:生命系統信息統和數據庫(http: //www.kegg.jp/)的代謝數據庫，檢索由該離子組成所推定的物質，判定該峰為丫 -氨基丁酸(T _aminobutyricacid，GABA)。通過使用GABA標品進行的研究，確認毛細管電泳的移動時間也是一致的。
[0130]關于m/z= 133.06，使用分析軟件Analyst TM QS(Applied B1systems，Inc.)進行組成的推定。根據相對于母峰的同位素的比例、精密質量等信息推定組成，結果，作為候補峰的m/z = 133.06的離子組成為C4H9N203。使用京都大學制作的KEGG:生命系統信息統和數據庫(http: //www.kegg.jp/)的代謝數據庫，檢索由該離子組成所推定的物質，判定該峰為天冬酰胺。通過使用天冬酰胺標品進行的研究，確認毛細管電泳的移動時間也是一致的。
[0131]關于m/z= 134.04的峰，使用分析軟件Analyst TM QS(Appl ied B1systems ,Inc.)進行組成的推定。根據相對于母峰的同位素的比例、精密質量等信息推定組成，結果，作為候補峰的m/z = 134.04的離子組成為C4H8N04。使用京都大學制作的KEGG:生命系統信息統和數據庫(http://www.kegg.jp/)的代謝數據庫，檢索由該離子組成所推定的物質，判定該峰為天冬氨酸。通過使用天冬氨酸標品進行的研究，確認毛細管電泳的移動時間也是一致的。
[0132]接著，計算天冬酰胺對天冬氨酸的比([天冬酰胺/天冬氨酸])，將SN-38暴露時的[天冬酰胺/天冬氨酸]除以SN-38非暴露時的[天冬酰胺/天冬氨酸]([天冬酰胺/天冬氨酸]sn-38/[天冬酰胺/天冬氨酸]_0。其結果，確認SN-38高感受性的HCT-116中，上述值顯著上升。另一方面，確認SN-38低感受性的HT-29中，上述值顯著減少(圖12)。
[0133]實施例2
[0134](I)方法
[0135](a)使用細胞
[0136]使用8種人大腸癌細胞株(!1(:1'-116、!11'-29、!1(:1'-15、1^^0、1^1741'、5財80、51620、WiDr) οHCT-116、HT-29由株式會社益力多本社獲得，Lovo、SW480、WiDr由大日本住友制藥株式會社獲得，HCT-15、LS174T由東北大學加齡醫學研究所醫用細胞資源中心獲得，SW620由住商醫藥株式會社獲得。
[0137](b)藥劑
[0138]SN-38散裝粉末從株式會社益力多本社獲得。SN-38溶解在DMSO中，以使在各實驗中培養基中的DMSO的濃度稀釋到0.1 %以下的方式使用。
[0139](c)對SN-38的感受性評價
[0140]對各株細胞，通過MTS assay (Ce I ITi ter96?AQueous One Solut1n Ce 11Proliferat1n Assay，Promega)評價在0]11]101凡?541]101凡的31^-38暴露72小時后的細胞生存率，計算IC5q值(相對于SN-38未處理的孔細胞數抑制50%的濃度)，作為各細胞中的SN-38感受性。實驗進行2次，每次3個樣品。
[0141](d)細胞內代謝物的采取
[0142]對于穩態的各細胞，除去培養基，在冰上，用5%的甘露醇(4%)清洗細胞后，迅速添加甲醇(4°C，含有內部標準物質)，使酶失活，保存在一80°C。其中，分別準備用于細胞計數的細胞和用于提取代謝物的細胞，進行同樣的處理后，進行細胞計數，用于細胞數補正。實驗進行2次，每次3個樣品。
[0143](e)代謝組樣品的制備
[0144]向一80 °C保存的甲醇溶液中加入氯仿和Mi I 1-Q水，進行液_液萃取，除去雜質成分。采取包含代謝物的水-甲醇層，使用分子量篩截5000Da的離心超濾膜進行除蛋白，之后，減壓干燥濾液，在一80°C保存。臨測定前在Mi I 1-Q水中溶解，供給代謝組測定。
[0145](f)代謝組測定
[0146]細胞內代謝物的網羅式測定由Agilent Technologies公司的毛細管電泳-飛行時間型質量分析儀(CE-TOFMS)進行。在陽離子性代謝物的網羅式測定中，以使毛細管的出口為陰極的方式施加電壓，此外，在陰離子性代謝物的網羅式測定中，以使毛細管的出口為陽極的方式施加電壓，一齊定量分析m/z = 50?1000的代謝物。
[0147](g)GABA與SN-38感受性的相關分析
[0148]對于通過CE-TOFMS從各細胞樣品檢測出的表示GABA的峰，對峰面積與各細胞的IC50值(50%細胞增殖抑制濃度)的關系進行相關分析。
[0149](2)結果
[0150](a)8種人大腸癌細胞株的SN-38感受性評價
[0151]各細胞中的IC5q值為0.74 ± 0.23?68.94 ± 6.83nmol/L，確認其感受性具有大幅度(圖 13)。
[0152](b)GABA與SN-38感受性的相關分析
[0153]對于通過CE-TOFMS檢測出的表示GABA的峰，對峰面積與各細胞的IC5q值的關系進行相關分析，確認尚的正相關(圖13)。
[0154]實施例3
[0155](I)方法
[0156]—次次重復進行與實施例2同樣的實驗，對分別合計3次的實驗得到的數據進行詳細的分析。對于通過CE-TOFMS從各細胞樣品檢測出的峰，與m/z和移動時間已知的278個標品數據進行對照，由此識別確認在任一株細胞中檢測的146種代謝物。對該146種代謝物，通過簡單回歸分析研究了8種人大腸癌細胞中的細胞內量與各個的細胞的Log[IC5Q]的關系。
[0157]⑵結果
[0158](a)8種人大腸癌細胞株中的SN-38感受性評價
[0159]8 種人大腸癌細胞株(HCT-116、HT-29、HCT-15、Lovo、LS174T、SW480、SW620、WiDr)的感受性以通過MTS as say計算的IC5Q為指標進行評價。其結果，WiDr的I C5Q( 63.27 土10.95nM)最高，表現出SN-38低感受性。另一方面，LS174T的IC5o(0.71±0.18nM)最低，表現出SN-38高感受性(圖14)。
[0160](b)細胞內代謝量和SN-38感受性的關系
[0161]從8種人大腸癌細胞中提取細胞內代謝物，通過CE-TOFMS—齊分析。對于得到的數據，與該研究室所有的278種標品數據進行對照，確認在任一種細胞中的檢測，對能夠識別的146種代謝物，通過簡單回歸分析研究8種人大腸癌細胞中的細胞內量與各個的細胞的Log[IC5Q]的關系。其結果，作為細胞內量與L0g[IC5Q]之間確認有關聯的代謝物(p<0.01、R22 0.7)，得到1-甲基腺苷、GABA、亞牛磺酸、谷胱甘肽(GSH)、1-甲基煙酰胺(圖15)。這些代謝物均在SN-38高感受性細胞中的細胞內水平低，在SN-38低感受性細胞中的細胞內水平高。
[0162]而且，確認了亞牛磺酸、谷胱甘肽、1-甲基煙酰胺這樣的谷胱甘肽代謝系統的物質的細胞內量與SN-38感受性之間相關，因此，嘗試研究屬于谷胱甘肽代謝系統的其他的物質的細胞內水平與SN-38感受性的關系，除了亞牛磺酸、谷胱甘肽、1-甲基煙酰胺外，確認了牛磺酸(R2 = 0.688)、谷胱甘肽二硫化物(GSSG,R2 = 0.634),S-腺苷高半胱氨酸(R2 = 0.496),煙酰胺(1?2 = 0.357)、丫-谷氨酰半胱氨酸(丫-6111氣78，1?2 = 0.319)、精胺(1?2 = 0.295)的細胞內代謝物水平與對SN-38感受性之間的關聯(圖16)。
【主權項】
1.選自在質量分析儀中本體或其片段是作為m/z= 149.05?149.06的陰離子被檢測出的分子、作為m/z = 152.99?153.00的陰離子被檢測出的分子、作為m/z = 724.34?724.35的陽離子被檢測出的分子、谷胱甘肽、亞牛磺酸、1-甲基煙酰胺、牛磺酸、谷胱甘肽二硫化物、S-腺苷高半胱氨酸、煙酰胺、γ-谷氨酰半胱氨酸和精胺中的一種以上的分子作為抗癌劑感受性判定標記，在用于判定大腸癌的抗癌劑感受性的試劑盒的制造中的用途， 其中，所述抗癌劑是伊立替康、SN-38和/或它們的鹽。2.一種大腸癌的抗癌劑感受性的判定方法，其特征在于: 測定檢測體中的、選自在質量分析儀中本體或其片段是作為m/z = 149.05?149.06的陰離子被檢測出的分子、作為m/z = 152.99?153.00的陰離子被檢測出的分子、作為m/z =724.34?724.35的陽離子被檢測出的分子、谷胱甘肽、亞牛磺酸、1-甲基煙酰胺、牛磺酸、谷胱甘肽二硫化物、S-腺苷高半胱氨酸、煙酰胺、γ-谷氨酰半胱氨酸和精胺中的一種以上的分子， 其中，所述抗癌劑是伊立替康、SN-38和/或它們的鹽。3.如權利要求2所述的判定方法，其特征在于: 檢測體是來自患有癌的被檢驗者的機體試樣。4.如權利要求2或3所述的判定方法，其特征在于: 檢測體是來自被投與了抗癌劑的患有癌的被檢驗者的機體試樣。5.—種用于判定大腸癌的抗癌劑感受性的試劑盒，其特征在于: 其包括用于測定檢測體中的、選自在質量分析儀中本體或其片段是作為m/z = 149.05?149.06的陰離子被檢測出的分子、作為m/z = 152.99?153.00的陰離子被檢測出的分子、作為m/z = 724.34?724.35的陽離子被檢測出的分子、谷胱甘肽、亞牛磺酸、1-甲基煙酰胺、牛磺酸、谷胱甘肽二硫化物、S-腺苷高半胱氨酸、煙酰胺、γ -谷氨酰半胱氨酸和精胺中的一種以上的分子的操作說明書， 其中，所述抗癌劑是伊立替康、SN-38和/或它們的鹽。6.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于: 檢測體是來自患有癌的被檢驗者的機體試樣。7.如權利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于: 檢測體是來自被投與了抗癌劑的患有癌的被檢驗者的機體試樣。8.一種大腸癌的抗癌劑感受性增強劑的篩選方法，其特征在于: 以選自在質量分析儀中本體或其片段是作為m/z = 149.05?149.06的陰離子被檢測出的分子、作為m/z = 152.99?153.00的陰離子被檢測出的分子、作為m/z = 724.34?724.35的陽離子被檢測出的分子、谷胱甘肽、亞牛磺酸、1-甲基煙酰胺、牛磺酸、谷胱甘肽二硫化物、S-腺苷高半胱氨酸、煙酰胺、γ-谷氨酰半胱氨酸和精胺中的一種以上的分子的表達改變作為指標， 其中，所述抗癌劑是伊立替康、SN-38和/或它們的鹽。9.一種由權利要求8所述的方法得到的大腸癌的抗癌劑感受性增強劑， 其中，所述抗癌劑是伊立替康、SN-38和/或它們的鹽。10.一種癌治療用組合物，其特征在于: 含有權利要求9所述的大腸癌的抗癌劑感受性增強劑和作為感受性增強對象的抗癌劑的組合， 其中，所述抗癌劑是伊立替康、SN-38和/或它們的鹽。11.抗癌劑感受性判定標記的測定試劑在用于判定抗癌劑感受性的試劑盒的制造中的用途， 所述抗癌劑感受性判定標記為選自在質量分析儀中本體或其片段是作為m/z = 149.05?149.06的陰離子被檢測出的分子、作為m/z = 152.99?153.00的陰離子被檢測出的分子、作為m/z = 724.34?724.35的陽離子被檢測出的分子、谷胱甘肽、亞牛磺酸、1-甲基煙酰胺、牛磺酸、谷胱甘肽二硫化物、S-腺苷高半胱氨酸、煙酰胺、γ -谷氨酰半胱氨酸和精胺中的一種以上的分子， 其中，所述抗癌劑是伊立替康、SN-38和/或它們的鹽， 作為感受性判定對象的癌是大腸癌。
【文檔編號】G01N33/15GK105891317SQ201610344306
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2010年10月29日
【發明人】谷川原祐介, 鈴木哲也, 西牟田章戶, 杉本伸二, 五十嵐義晃
【申請人】學校法人慶應義塾, 株式會社益力多本社