一種曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒及其制備方法與應用

一種曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒及其制備方法與應用
【專利摘要】本發明提供了一種曲霉菌半乳甘露聚糖(GM)抗原免疫檢測試劑盒，包括GM抗原包被的固相載體、抗GM抗原多克隆抗體和GM抗原標準品，所述試劑盒先將GM抗原包被在固相載體上，檢測時，待檢樣本或GM抗原標準品與包被抗原競爭結合有限的抗體結合位點，再經酶與底物發生顯色反應，測定結果的顏色深淺和待檢抗原的濃度呈負相關，可根據GM抗原標準品繪制標準曲線，根據標準曲線方程計算待檢抗原的濃度值。該試劑盒具有較好的敏感性和特異性，結果與參比試劑符合率高，能提供更準確可靠的檢驗結果，其操作簡便易行，檢測快速靈敏，所用酶標儀簡單、普及，價格低廉，該檢測試劑盒為GM抗原定量檢測提供了一種有效工具。
【專利說明】
一種曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒及其制備方法 與應用
技術領域
[0001 ]本發明涉及生物技術領域，尤其是一種曲霉菌半乳甘露聚糖(Galactomannan，GM) 抗原免疫檢測試劑盒及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002] 曲霉菌(Aspergillus)是廣泛存在于自然界的一種腐生菌及正常人體皮膚黏膜的 常駐真菌。曲霉孢子較小，直徑2-3μπι，可以在空氣中漂浮，并且通過呼吸道進入人體。由于 曲霉主要通過呼吸道進入人體，所以曲霉感染主要發生在肺部。
[0003] 在免疫抑制患者中侵襲性曲霉病（Invasive Aspergillosis，ΙΑ)的發病率由于抗 生素的濫用而逐年增高，并成為其死亡的主要原因，煙曲霉菌是引起免疫抑制患者嚴重深 部曲霉菌感染的最常見病原菌，其次還有黃曲霉菌、黑曲霉菌、土曲霉菌等。IA在血液病和 造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplants，HSCT)患者中死亡率高達70%-90%，造成這種高死亡率的主要原因在于不能在病程早期對ΙΑ進行有效檢測診斷，以至患 者得不到及時有效的治療而死亡，因此選擇早期檢測診斷方法具有重要的意義。
[0004] 目前國際上開展的檢測方法主要有以下4大類：
[0005] (1)組織病理學檢查，該法為有創性檢查，不易取材；
[0006] (2)血培養方法，該法敏感性差，耗時長，有些真菌樣本采集難，陽性檢出率不高， 且臨床最多見的痰培養曲霉陽性并不能診斷曲霉感染；
[0007] (3)影像學檢查，該法敏感性差，在疾病早期很難見到特征性表現；
[0008] (4)免疫學檢測法:通過特異性針對GM抗原的抗體實現對曲霉菌的檢測，檢測血液 敏感性達到80%以上。免疫學檢測方法靈敏度和特異性都較前三種方法有明顯的優勢，正 逐漸成為曲霉菌檢測的常用方法。在國內外IFI的診斷標準中，均認為血清曲霉抗原陽性可 作為微生物學診斷標準，因此測定血清中的GM抗原水平有助于ΙΑ的早期診斷、早期治療。
[0009] 免疫檢測技術是利用抗原抗體間能發生特異性結合反應，通過檢測標記在反應物 上的標記物，對抗原或抗體實現定性或定量檢測的方法。根據標記物的不同，分為酶聯免疫 分析技術(Enzyme-Linked Immunosorbant Assay，ELISA)、免疫焚光檢測技術、化學發光免 疫分析技術、免疫微球技術、免疫膠體金技術等。其中ELI SA技術具有操作簡單，靈敏度高， 檢測時間短的特點，在臨床檢測和科學研究中被廣泛使用。
[0010] 在曲霉菌的臨床檢測中，目前國際市場上免疫檢測產品為數不多，現有的有美國 Bio-Rad公司的ELISA法檢測試劑盒產品，該產品采用雙抗夾心法，其方法是先將曲霉菌的 特異單克隆抗體包被在酶標板上，再加入待檢樣本和辣根過氧化物酶(HRP)標記的同一單 克隆抗體，37 °C反應1.5個小時，待檢樣本中的抗原會與特異單克隆抗體結合并形成夾心結 構，再加入顯色劑顯色，顏色的深淺和待檢抗原的濃度呈正相關，從而實現對GM抗原的檢 測，該Bio-Rad曲霉菌試劑盒定性判定陰陽性結果。然而，該方法采用夾心免疫方法進行檢 測，檢測步驟繁瑣，且單克隆抗體制備成本高，不利于試劑盒在臨床檢測中的推廣和普及。 目前，國內還沒有真正用于曲霉菌臨床檢測的免疫學檢測產品，因此，在曲霉菌臨床檢測領 域內，迫切需要一種使用簡單、成本低且特異性高的國內自主研發的定量檢測GM抗原的診 斷試劑盒產品。

【發明內容】

[0011] 本發明所要解決的技術問題在于提供一種使用簡單、成本低且特異性高的曲霉菌 半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒。
[0012] 本發明所要解決的另一技術問題在于提供上述曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢 測試劑盒的制備方法。
[0013] 本發明所要解決的還一技術問題在于提供上述曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢 測試劑盒的應用。
[0014] 為解決上述技術問題，本發明提供一種曲霉菌半乳甘露聚糖(簡稱GM)抗原免疫檢 測試劑盒，所述試劑盒包括GM抗原包被的固相載體、抗GM抗原多克隆抗體和GM抗原標準品， 所述GM抗原標準品包括至少三種已知濃度的GM抗原溶液，所述GM抗原標準品的濃度在0-50ng/mL范圍內。
[0015]優選的，所述GM抗原標準品的濃度在0-10ng/mL范圍內，最優選的，在0-5ng/mL范 圍內。所述GM抗原采用0. lmol/L PBS緩沖液進行配制。
[0016] 本發明所述GM抗原可由下述方法得到：
[0017] 將曲霉菌采用固體培養基培養至培養基長滿綠色孢子;過濾除去菌絲，滅活菌體 及孢子;離心后，收集孢子并洗滌;孢子經破碎后過濾除去孢子碎片；將濾液經醇沉、洗滌 后，得到GM抗原粗提物;將GM抗原粗提物經脫色、超濾后得到所述GM抗原。
[0018] 其中，所述固體培養基選自PDA培養基、沙氏培養基或察氏培養基;優選為PDA培養 基，其中TOA培養基成分為每升培養基含300g土豆煮沸后的上清液，40g D-葡萄糖，15g瓊脂 粉。
[0019] 在本發明一【具體實施方式】中，上述GM抗原的制備方法具體包括如下步驟：
[0020] 1)將曲霉菌采用PDA固體培養基，其中，PDA培養基成分為每升培養基含300g 土豆 煮沸后的上清液，40g D-葡萄糖，15g瓊脂粉;培養溫度為25-30°C，培養時間為3-5天，至培 養基長滿綠色孢子；
[0021] 2)用無菌生理鹽水沖洗孢子，孢子懸液經無菌紗布過濾除去菌絲，在孢子懸液中 加入終濃度為3.7 %的甲醛在4°C靜置24-48h，滅活菌體及孢子；
[0022] 3)4°C，12,000g離心30min收集孢子，用無菌生理鹽水洗滌孢子；
[0023] 4)用液氮研磨冷凍的孢子，加入無菌生理鹽水，使用勻漿儀或超聲細胞破碎儀破 碎孢子，所得孢子破碎液經定性濾紙過濾，濾液經〇. 45μπι濾膜過濾以除去孢子碎片；
[0024] 5)將所得濾液轉移至潔凈容器中，加入2.5倍體積無水乙醇，4°C靜置過夜;4°C， 12，000g離心30min，將沉淀溶于去離子水中；加2.5倍體積無水乙醇，靜置2小時；離心分離 沉淀，沉淀用無水乙醇洗滌；
[0025] 6)4°C，12,000g離心30min，棄上清;將所得沉淀用去離子水溶解，再加入活性炭粉 末，4 °C攪拌4小時脫色;室溫抽濾，除去活性炭顆粒;所得濾液經0.22μπι濾膜過濾;濾液轉移 至10KD離心超濾管，4000g離心20min，即得到所述GM抗原。
[0026] 本發明所述抗GM抗原多克隆抗體，可與GM抗原特異性結合，用SDS-PAGE顯示為均 一抗體產物，用GM抗原包被，間接法ELISA檢測顯示其效價不低于1:1 X 105，所述抗體可由 下述方法得到：
[0027] 用GM抗原作為免疫原免疫動物，對得到的血清進行分離純化，得到所述抗GM抗原 多克隆抗體;其中，免疫采用皮下注射、足墊注射、脾內注射、靜脈注射或腹腔注射，免疫劑 量為0.01-0. lmg，所述動物為大鼠、小鼠、豚鼠、兔、雞、羊、馬、豬或驢，優選兔，所述純化方 法為飽和硫酸銨鹽析沉淀法和親和層析法。
[0028]在本發明一【具體實施方式】中，上述抗GM抗原多克隆抗體的制備方法具體包括如下 步驟：
[0029] 1)用GM抗原作為免疫原免疫兔，測定免疫后兔的血清效價，取免疫后的兔的耳動 脈血，分離抗血清；
[0030] 2)用飽和硫酸銨鹽析法進行初步純化：
[0031]取2mL抗血清樣本，加等體積的生理鹽水，再加入4mL飽和硫酸銨溶液，于4 °C沉淀 過夜；
[0032] 10000g低溫離心10min，棄上清，將沉淀用2mL PBS溶解，緩慢滴加lmL飽和硫酸銨 溶液，在4°C靜置1小時；
[0033] 10000g低溫離心10min，棄上清，將沉淀用lmL PBS溶解，用PBS溶液4°C透析過夜；
[0034] 3)用親和層析的方法進一步純化：
[0035] 用5-10倍柱床體積的洗脫緩沖液洗柱；
[0036] 用5_10倍柱床體積的偶聯緩沖液洗柱；
[0037] 用飽和硫酸銨鹽析法初步純化過的樣品上樣；
[0038] 用5-10倍柱床體積的偶聯緩沖液洗柱；
[0039]用2-5倍柱床體積的洗脫緩沖液洗脫，得到抗GM抗原多克隆抗體；
[0040] 其中，所述洗脫緩沖液選自0. lmol/L甘氨酸緩沖液、1?緩沖液、檸檬酸-磷酸鹽緩 沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液或醋酸-醋酸鈉緩沖液，pH為3.0;所述偶聯緩沖液選自roS緩 沖液、Tr i s-HCl緩沖液、醋酸-醋酸鈉緩沖液中的一種，優選為PBS緩沖液。
[0041] 在本發明一【具體實施方式】中，所述固相載體為酶標板、微孔板、試管或微孔濾膜， 優選的，所述固相載體為酶標板;固相載體的材質例如可為聚苯乙烯、硝酸纖維素、尼龍等。
[0042] 在本發明一【具體實施方式】中，所述抗GM抗原多克隆抗體為標記酶的抗GM抗原多克 隆抗體;優選的，所述抗GM抗原多克隆抗體為標記酶的兔源抗GM抗原多克隆抗體。
[0043] 在本發明其它實施方式中，所述抗GM抗原多克隆抗體為未標記酶的抗GM抗原多克 隆抗體，所述試劑盒還包括酶標二抗，所述酶標二抗可與抗GM抗原多克隆抗體相結合;優選 的，所述抗GM抗原多克隆抗體為未標記酶的兔源抗GM抗原多克隆抗體，所述試劑盒還包括 酶標羊抗兔二抗。
[0044] 在本發明一【具體實施方式】中，所述酶為辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP)、喊性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，AP)或葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，G0);更優選的，所述酶為辣根過氧化物酶。
[0045] 在本發明一【具體實施方式】中，所述GM抗原標準品包括GM抗原標準品a，GM抗原標準 品b，GM抗原標準品c，GM抗原標準品d，GM抗原標準品e，其中，所述GM抗原標準品a的濃度為 5ng/mL、GM抗原標準品b的濃度為2.5ng/mL、GM抗原標準品c的濃度為Ing/mL、GM抗原標準品 d的濃度為0.5ng/mL、GM抗原標準品e的濃度為0.25ng/mL。
[0046] 在本發明一【具體實施方式】中，所述曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒，還 包括樣本處理液、濃縮洗液、樣本稀釋液、底物溶液和終止液中的一種或多種。
[0047] 優選的，所述樣本處理液為蛋白變性溶液;更優選的，選自以下蛋白變性溶液中的 一種或多種：〇·05-0·2mg/mL蛋白酶K;pH2-pH10的0·03-0· 18mol/L EDTA(乙二胺四乙酸二 鈉)溶液;5-30 % DMS0 (二甲基亞砜)溶液;pH7.0-pH8.0的1 -8mo 1 /L的尿素。
[0048] 優選的，所述濃縮洗液為含吐溫-20的roS溶液(簡稱TOST溶液），其中，所述PBST溶 液中可包含生物液體防腐劑如ProCl in300;更優選的，所述濃縮洗液按重量份數計為:氯化 鈉160.0份，氯化鉀4.0份，十二水合磷酸氫二鈉31.6份，磷酸二氫鉀2.8份，吐溫-200.2份， ProClin3002份，超純水 1000份。
[0049] 優選的，所述樣本稀釋液為含5-15%脫脂乳粉、BSA或牛血清的的CBS稀釋液;優選 為含10%脫脂乳粉的CBS稀釋液。
[0050] 優選的，所述底物溶液選自0PD (鄰苯二胺）、0T (鄰聯甲苯胺）、ABTS(2，2 ' -連氮-雙 (3-乙基苯并噻唑-6-磺酸））或p-NPP(對硝基苯磷酸酯）；優選為TMB。
[0051 ]優選的，所述終止液為HOmol/L的硫酸溶液，優選2mol/L的硫酸溶液。
[0052] 在本發明一【具體實施方式】中，所述試劑盒還包括樣本處理液、濃縮洗液、樣本稀釋 液、底物溶液和終止液，所述的樣本處理液、濃縮洗液，樣本稀釋液、底物溶液和終止液的組 分及配比如下：
[0053] 樣本處理液:選自以下蛋白變性溶液:0 · 05-0 · 2mg/mL蛋白酶1(;?!12-?!110 0.03-0 · 18mol/LEDTA 溶液；5-30 %DMS0 溶液；
[0054]濃縮洗液:按重量份數計為:氯化鈉160.0份，氯化鉀4.0份，十二水合磷酸氫二鈉 31.6份，磷酸二氫鉀2.8份，吐溫-200.2份，ProCl in3002份，超純水1000份；
[0055]樣本稀釋液:含10%脫脂乳粉的CBS稀釋液；
[0056] 底物溶液:TMB;
[0057] 終止液:2mo 1 /L的硫酸溶液。
[0058] 在本發明一【具體實施方式】中，所述標記或未標記酶的抗GM抗原多克隆抗體、GM抗 原標準品、酶標二抗、樣本處理液、濃縮洗液、樣本稀釋液、底物溶液和/或終止液分別放入 各個試劑瓶中，上述各試劑瓶由海綿托架固定，并同GM抗原包被的固相載體和封板膜一同 置于試劑盒盒體內。
[0059] 本發明還提供一種曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備方法，包括如 下步驟：
[0060] 1)制備GM抗原包被的固相載體
[0061 ] 配制GM抗原包被液:采用緩沖溶液將GM抗原稀釋至lOOng/mL-lOyg/mL;所述緩沖 溶液選自：Tr is-HCl緩沖液，PBS緩沖液，CBS緩沖液或生理鹽水；
[0062] 配制封閉液:將2%_8%的新生牛血清加入緩沖溶液中，配制成封閉液;所述緩沖 溶液選自：Tr is-HCl緩沖液，PBS緩沖液，CBS緩沖液或生理鹽水；
[0063] 包被固相載體:將配制的GM抗原包被液加入固相載體中；將固相載體置于12_18°C 恒溫包被;將配制的封閉液加入固相載體中，置于12-18°C恒溫;棄去固相載體中的封閉液， 置于20-25°C恒溫，即得；
[0064] 2)配制標準品
[0065]用PBS緩沖液配制至少三種已知濃度的GM抗原溶液，使GM抗原標準品的濃度在0-50ng/mL范圍內；
[0066] 3)制備抗GM抗原多克隆抗體
[0067] 將抗GM抗原多克隆抗體用酶偶聯物穩定劑以1:20000-1:40000的比例稀釋而成。
[0068] 本發明中，酶偶聯物穩定劑能夠保持抗體與酶偶聯物之間穩定性的試劑，能夠保 持抗體及酶的活性。優選的，其可為HRP酶偶聯物穩定劑，本發明中酶偶聯物物穩定劑可為 市售產品。
[0069] 在本發明一【具體實施方式】中，所述抗GM抗原多克隆抗體為標記酶的抗GM抗原多克 隆抗體，其制備方法包括:采用過碘酸鹽氧化法或戊二醛交聯法將酶標記在抗GM抗原多克 隆抗體上;將標記酶的抗GM抗原多克隆抗體用酶偶聯物穩定劑以1: 20000-1:40000的比例 稀釋而成。
[0070] 在本發明其它實施方式中，所述抗GM抗原多克隆抗體為未標記酶的抗GM抗原多克 隆抗體，所述試劑盒還包括酶標二抗，其制備方法還包括:將酶標二抗用酶偶聯物穩定劑以 1:5000-1:20000的比例稀釋而成。
[0071] 在本發明一【具體實施方式】中，所述試劑盒的制備方法還包括配制樣本處理液、濃 縮洗液、樣本稀釋液、底物溶液和終止液中的一種或多種的步驟。
[0072]本發明所述試劑盒的制備方法中GM抗原、抗GM抗原多克隆抗體、酶標二抗、固相載 體、酶、樣本處理液、濃縮洗液、樣本稀釋液、底物溶液和終止液可與本發明前述試劑盒中相 同，在此不作贅述。
[0073]在本發明一【具體實施方式】中，所述曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制 備方法，具體步驟如下：
[0074] 1)制備GM抗原包被的酶標板
[0075] 配制GM抗原包被液:采用緩沖溶液將GM抗原稀釋至lOOng/mL-lOyg/mL;所述緩沖 溶液選自：· lmol/LTri s-HCl緩沖液，其ρΗ6 · 0-pH9 · 0 ; 0 · lmol/LPBS緩沖液，其口!16.0-pH9 · 0 ; 0 · 05-0 · 2mol/L CBS緩沖液，其ρΗ6 · 0-pH9 · 0 ;或生理鹽水；優選的，所述緩沖液為 0 · lmol/LPBS緩沖液，其ρΗ6 · 0-pH9 · 0;
[0076]配制封閉液:將2%_8%的新生牛血清加入緩沖溶液中，配制成封閉液;所述緩沖 溶液選自：0.1111〇1/11^8-?：1緩沖液，其口冊.01!19.0;0.1111〇1/1?85緩沖液，其口冊.0-pH9.0; 0.05-0.2mol/L CBS緩沖液，其pH6.0-pH9.0;或生理鹽水;優選的，將5%的新生牛血 清加入生理鹽水中，配制成封閉液；
[0077]包被酶標板:將配制的GM抗原包被液加入酶標板孔中，每孔分別加入50-150yL包 被液;酶標板置于12-18Γ環境下包被6-8h;將配制的封閉液加入酶標板孔中，每孔分別加 入50-150μΙ^?閉液，置于12-18°C恒溫箱，2-4h;從恒溫箱取出酶標板后棄去封閉液，20-25 °C十旦溫2_4h，即得；
[0078] 2)配制標準品
[0079] 將GM抗原用0. lmol/L PBS緩沖液配制，使GM抗原的濃度分別是5ng/mL，2.5ng/mL， lng/mL，0·5ng/mL，0·25ng/mL;
[0080] 3)配制標記酶的抗GM抗原多克隆抗體溶液
[0081]采用過碘酸鹽氧化法或戊二醛交聯法將酶標記在抗GM抗原多克隆抗體上，將標記 酶的抗GM抗原多克隆抗體用酶偶聯物穩定劑以1:20000-1:40000的比例稀釋而成；
[0082] 4)配制樣本處理液、濃縮洗液、樣本稀釋液、底物溶液和終止液
[0083]所述的樣本處理液、濃縮洗液，樣本稀釋液、底物溶液和終止液的組分及配比如 下：
[0084] 樣本處理液：選自以下蛋白變性溶液：0.05-0.2mg/mL蛋白酶K; pH2-pH100.03-0 · 18mol/LEDTA溶液;5-30%DMS0溶液;優選的，所述樣本處理液為pH2-pH100 · 03-0 · 18mol/ L EDTA溶液；
[0085] 濃縮洗液:按重量份數計氯化鈉160.0份，氯化鉀4.0份，十二水合磷酸氫二鈉31.6 份，磷酸二氫鉀2.8份，吐溫-20 0.2份，ProCl in300 2份，超純水1000份，混合均勻；
[0086] 樣本稀釋液:含10%脫脂乳粉的CBS稀釋液；
[0087] 底物溶液:TMB;
[0088] 終止液：2mol/L的硫酸溶液。
[0089] 在本發明一【具體實施方式】中，所述曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制 備方法，具體步驟如下：
[0090] 1)制備GM抗原包被的酶標板
[0091] 配制61抗原包被液:采用緩沖溶液將61抗原稀釋至100即/11^-1(^8/1^;所述緩沖 溶液選自：0.1111〇1/11^8-?：1緩沖液，其口冊.01!19.0;0.1111〇1/1?85緩沖液，其口冊.0-pH9 · 0 ; 0 · 05-0 · 2mol/L CBS緩沖液，其ρΗ6 · 0-pH9 · 0 ;或生理鹽水；優選的，所述緩沖液為 0 · lmol/LPBS緩沖液，其ρΗ6 · 0-pH9 · 0;
[0092]配制封閉液:將2%_8%的新生牛血清加入緩沖溶液中，配制成封閉液;所述緩沖 溶液選自：0.1111〇1/11^8-?：1緩沖液，其口冊.01!19.0;0.1111〇1/1?85緩沖液，其口冊.0-pH9.0; 0.05-0.2mol/L CBS緩沖液，其pH6.0-pH9.0;或生理鹽水;優選的，將5%的新生牛血 清加入生理鹽水中，配制成封閉液；
[0093]包被酶標板:將配制的GM抗原包被液加入酶標板孔中，每孔分別加入50-150yL包 被液;酶標板置于12-18Γ環境下包被6-8h;將配制的封閉液加入酶標板孔中，每孔分別加 入50-150μΙ^?閉液，置于12-18°C恒溫箱，2-4h;從恒溫箱取出酶標板后棄去封閉液，20-25 °C十旦溫2_4h，即得；
[0094] 2)配制標準品
[0095] 將GM抗原用0. lmol/L PBS緩沖液配制，使GM抗原的濃度分別是5ng/mL，2.5ng/mL， lng/mL，0·5ng/mL，0·25ng/mL;
[0096] 3)配制抗GM抗原多克隆抗體溶液
[0097] 將抗GM抗原多克隆抗體用酶偶聯物穩定劑以1:20000-1:40000的比例稀釋而成； [0098] 4)配制酶標二抗溶液
[0099] 將酶標二抗用酶偶聯物穩定劑以1:5000-1:20000的比例稀釋而成；
[0100] 5)配制樣本處理液、濃縮洗液、樣本稀釋液、底物溶液和終止液
[0101]所述的樣本處理液、濃縮洗液，樣本稀釋液、底物溶液和終止液的組分及配比如 下：
[0102] 樣本處理液：選自以下蛋白變性溶液，0.05-0.2mg/mL蛋白酶K; pH2-pH100.03-0· 18mol/L EDTA溶液；5-30%DMS0溶液；優選的，所述樣本處理液為口!121!1100.03-0.18mol/L EDTA溶液；
[0103] 濃縮洗液:按重量份數計氯化鈉160.0份，氯化鉀4.0份，十二水合磷酸氫二鈉31.6 份，磷酸二氫鉀2.8份，吐溫-20 0.2份，ProCl in300 2份，超純水1000份，混合均勻；
[0104] 樣本稀釋液:含10%脫脂乳粉的CBS稀釋液；
[0105] 底物溶液:TMB;
[0106] 終止液:2mol/L的硫酸溶液。
[0107] 本領域技術人員知曉，上述試劑盒制備方法中各組分的配制順序不用于限定本發 明，本領域技術人員可根據實際需求任意調整順序。
[0108] 本發明還提供一種所述曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒在檢測GM抗原 中的應用。
[0109] 在本發明一【具體實施方式】中，本發明試劑盒檢測GM抗原的應用采用競爭ELISA法， 其應用原理如下：
[0110] a)將GM抗原包被在固相載體上；
[0111] b)將待檢樣本處理后與標記酶的抗GM抗原多克隆抗體加入固相載體，使待檢樣本 中的抗原與包被后的抗原競爭結合有限的抗體結合位點；
[0112] 或者，將待檢樣本處理后與未標記酶的抗GM抗原多克隆抗體加入固相載體，使待 檢樣本中的抗原與包被后的抗原競爭結合有限的抗體結合位點，恒溫反應并徹底洗滌，加 入酶標二抗；
[0113] c)經過恒溫反應并徹底洗滌，再加入酶的底物溶液顯色，顏色的深淺和待檢樣本 中GM濃度呈負相關；
[0114] d)用酶標儀在一定波長下測定吸光度(A值），通過標準曲線實現對抗原的檢測。
[0115] 采用本發明試劑盒可實現對GM抗原的定量檢測。
[0116] 在本發明一【具體實施方式】中，所述曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒檢測 GM抗原中的應用為競爭ELISA方法(一步法），具體步驟如下：
[0117] a)取待檢樣本與樣本處理液以1:1-5:1的體積比混合并煮沸l-10min后離心得到 待檢測物；
[0118] b)將GM抗原標準品和步驟a)的待檢測物分別與標記酶的抗GM抗原多克隆抗體等 體積混勻并加入GM抗原包被的酶標板中同時孵育60-120min，孵育后洗板；
[0119] c)向步驟b)的酶標板中加入底物溶液顯色10-15min后，加入終止液后進行檢測， 于酶標儀上讀取450納米處的吸光光度值，通過標準曲線實現對抗原的檢測。
[0120] 在本發明一【具體實施方式】中，所述曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒檢測 GM抗原中的應用為競爭ELISA方法(兩步法），具體步驟如下：
[0121] a)取待檢樣本與樣本處理液以1:1-5:1的體積比混合并煮沸l-10min后離心得到 待檢測物；
[0122] b)將GM抗原標準品和步驟a)的待檢測物分別與標記酶的抗GM抗原多克隆抗體等 體積混勻并孵育60-120min;
[0123] c)將步驟b)的混合物加入GM抗原包被的酶標板中并孵育60min-120min，孵育后洗 板；
[0124] d)向步驟c)的酶標板中加入底物溶液顯色10-15min后，加入終止液后進行檢測， 于酶標儀上讀取450納米處的吸光光度值，通過標準曲線實現對抗原的檢測。
[0125] 在本發明一【具體實施方式】中，所述曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒檢測 GM抗原中的應用為競爭ELISA方法(一步法），具體步驟如下：
[0126] a)取待檢樣本與樣本處理液以1:1-5:1的體積比混合并煮沸l-10min后離心得到 待檢測物；
[0127] b)將GM抗原標準品和步驟a)的待檢測物分別加入GM抗原包被的酶標板中，再加入 等體積抗GM抗原多克隆抗體混勻并同時孵育60-120min，孵育后洗板；
[0128] c)向步驟b)的酶標板中加入酶標二抗并孵育20-60min，孵育后洗板；
[0129] d)向步驟c)的酶標板中加入底物溶液顯色10_15min后，加入終止液后進行檢測， 于酶標儀上讀取450納米處的吸光光度值，通過標準曲線實現對抗原的檢測。
[0130]在本發明一【具體實施方式】中，所述曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒檢測 GM抗原中的應用為競爭ELISA方法(兩步法），具體步驟如下：
[0131] a)取待檢樣本與樣本處理液以1:1-5:1的體積比混合并煮沸l-10min后離心得到 待檢測物；
[0132] b)將GM抗原標準品和步驟a)的待檢測物分別與抗GM抗原多克隆抗體等體積混勻 并孵育 60min-120min;
[0133] c)將步驟b)的混合物加入GM抗原包被的酶標板中并孵育60min-120min，孵育后洗 板；
[0134] d)向步驟c)的酶標板中加入酶標二抗并孵育20-60min，孵育后洗板；
[0135] e)向步驟d)的酶標板中加入底物溶液顯色10_15min后，加入終止液后進行檢測， 于酶標儀上讀取450納米處的吸光光度值，通過標準曲線實現對抗原的檢測。
[0136] 本領域技術人員知曉，對曲霉菌半乳甘露聚糖的檢測包括不以/以疾病的診斷和 治療為目的。
[0137] 本發明的有益效果是：
[0138]本發明所述曲霉菌半乳甘露聚糖(6&]^(：1:〇11^111^11，61〇抗原免疫檢測試劑盒采用 競爭法，先將GM抗原包被在酶標板上，再將待檢樣本或GM抗原標準品分別與包被抗原競爭 結合有限的抗體結合位點，經酶與底物發生顯色反應，測定結果的顏色深淺和待檢抗原的 濃度呈負相關，所用抗體為抗GM抗原多克隆抗體，可根據GM抗原標準品繪制標準曲線，根據 標準曲線方程計算待檢抗原的濃度值。該檢測試劑盒具有較好的敏感性和特異性，結果與 參比試劑符合率高，能提供更準確可靠的檢驗結果，所述試劑盒操作簡便易行，檢測快速靈 敏，所用酶標儀簡單、普及，價格低廉，該檢測試劑盒為GM抗原定量檢測提供了一種有效工 具。
【附圖說明】
[0139] 圖1顯示了實施例1中GM抗原純品中多糖含量測定標準曲線；
[0140] 圖2顯示了實施例1中GM抗原純品的HPLC檢測結果；
[0141] 圖3顯示了實施例2中兔源抗GM抗原多克隆抗體的SDS-PAGE檢測的結果，其中，pAb 泳道為多抗，Μ泳道為蛋白Marker;
[0142] 圖4顯示了實施例2中兔源抗GM抗原多克隆抗體的效價測定的結果；
[0143] 圖5顯示了實施例24中GM抗原免疫檢測試劑盒標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0144] 實施例1曲霉菌半乳甘露聚糖(GM)抗原的制備
[0145] 采用曲霉菌制備GM抗原，本發明所采用的曲霉菌株購買自中國醫學微生物菌種保 藏管理中心(CMCC)。
[0146] -、提取GM，其步驟如下：
[0147] 配制PDA固體培養基2.0L，其成分為600g 土豆煮沸后的上清液，D-葡萄糖80.0g，瓊 脂粉30.0g，將曲霉菌株置于培養基中，25°C培養3天，至培養基長滿綠色孢子。用無菌生理 鹽水沖洗孢子，孢子懸液經8層無菌紗布過濾3次除去菌絲，在孢子懸液中加入終濃度為 3.7%的甲醛4°(：靜置241 1，滅活菌體及孢子。4°(：，12,00(^離心301^11收集孢子，用無菌生理 鹽水洗滌6次，除去可能存在的甲醛。用液氮反復研磨冷凍的孢子，再加入無菌生理鹽水，再 用超聲細胞破碎儀破碎孢子。所得孢子破碎液經定性濾紙過濾，濾液經〇.45μπι濾膜過濾以 除去孢子碎片。將所得濾液轉移至潔凈容器中，加入2.5倍體積無水乙醇，4°C靜置過夜。4 °C，12，000g離心30min，將沉淀溶于去離子水中，加2.5倍體積無水乙醇，靜置2小時，離心分 離沉淀，沉淀用無水乙醇洗滌三次。4°C，12，000g離心30min，棄上清，得到粗提的GM。
[0148] 二、用活性炭吸附的方法對粗提的GM進行脫色，具體步驟如下：
[0149] 將GM溶于200mL去離子水，邊攪拌邊緩慢加入活性炭粉末3.0g，4°C脫色4小時，待 溶液棕黃色褪去，用布氏漏斗過濾，反復過濾至溶液澄清，即得到去除色素的GM提取物。
[0150] 三、用超濾的方法對GM進行純化，具體步驟如下：
[0151] 室溫抽濾，除去活性炭顆粒，所得濾液經0.22μπι濾膜過濾。濾液轉移至10KD離心超 濾管，4000g離心20min，即得到高純度GM。
[0152] 四、對GM進行純化，對得到的GM樣品進行多糖、蛋白質及核酸含量檢測：
[0153] 1)用Dubois-硫酸苯酚法對上述得到的GM抗原純品進行多糖含量測定，檢測結果 如表1-1，表1-2,附圖1所不：
[0154] 表1-1 GM抗原純品中多糖含量
[0156] 表1-2 GM抗原純品中多糖含量
[0158] 由檢測結果可知，采用該制備方法從2L煙曲霉培養基最終可得到220mg煙曲霉菌 半乳甘露聚糖抗原純品。
[0159] 2)對該制備方法得到的GM抗原純品樣本進行紫外吸收檢測。分別在UV260nm、 UV280nm、UV320nm波長下檢測樣本，結果如下表2。由檢測結果可知，核酸及蛋白質的總含量 不超過樣本總質量的4%。
[0160] 表2 GM抗原純品中DNA和蛋白質含量
[0162] 五、對GM進行純化，對得到的GM樣品進行HPLC檢測：
[0163] 對該制備方法得到的GM抗原純化樣品進行HPLC檢測。檢測器為示差折光檢測器。 檢測結果如附圖2所示。從圖中可看出，樣品出峰單一，尖窄，并無明顯雜峰出現，說明所含 物質大小均一，純度較高。
[0164] 六、用該制備方法對GM抗原進行純化，對得到的GM抗原純品樣本用Bio-Rad公司的 煙曲霉抗原檢測試劑盒進行抗原鑒定。
[0165] 目前國際上通常采用美國Bio-Rad公司的煙曲霉抗原檢測試劑盒對GM抗原進行檢 測。用該試劑盒對GM抗原樣品進行檢測，樣本濃度為Ing/mL。檢測結果見下表3,由結果可 知，GM抗原呈陽性，且0D值大于陽性質控，說明用本發明中的方法可以獲得煙曲霉的半乳甘 露聚糖抗原。
[0166] 表3采用Bio-Rad煙曲霉抗原檢測試劑盒進行抗原鑒定檢測結果
[0168] 實施例2抗GM抗原多克隆抗體的制備
[0169] -、抗GM抗原的多克隆抗體的制備
[0170] 1.免疫動物
[0171] 將GM抗原與弗氏完全佐劑等體積混合至合適體積，充分乳化后對新西蘭大耳兔進 行皮下多點注射，每只兔免疫劑量控制在0.01-0. lmg。免疫前3天取耳血，分離血清做陰性 對照。初次免疫后每2周免疫1次，方法與第1次相同。
[0172] 2.多克隆抗體的獲得
[0173] 1)效價測定:免疫過程中，免疫后每隔7天采血測效價1次，免疫次數6次。
[0174] 2)分離抗血清:血清效價達到很高時，用頸動脈放血的方法大量采血。待血液凝 固，血清分離出后，高速離心，取上清，在-20 °C下保存。
[0175] 3)用飽和硫酸銨鹽析法進行初步純化
[0176] 取2mL抗血清樣本，加等體積的生理鹽水，再加入4mL飽和硫酸銨溶液，于4 °C沉淀 過夜；
[0177] 10000g低溫離心10min，棄上清，將沉淀用2mL PBS溶解，緩慢滴加lmL飽和硫酸銨 溶液，在4°C靜置1小時；
[0178] 10000g低溫離心10min，棄上清，將沉淀用lmL PBS溶解，用PBS溶液4°C透析過夜。
[0179] 4)用親和層析的方法進一步純化
[0180]用7倍柱床體積的洗脫緩沖液(0.01M PB磷酸緩沖液)洗柱；
[0181]用7倍柱床體積的偶聯緩沖液(0.01M PBS磷酸鹽緩沖液)洗柱；
[0182]用飽和硫酸銨鹽析法初步純化過的樣品上樣；
[0183]用7倍柱床體積的偶聯緩沖液(0.01M PBS磷酸鹽緩沖液)洗柱；
[0184] 用3倍柱床體積的洗脫緩沖液(0.1M甘氨酸)洗脫，得到抗GM抗原多克隆抗體。
[0185] 二、抗體的檢測
[0186] 1 · SDS-PAGE 電泳檢測
[0187] 對實施例2制得的多克隆抗體進行SDS-PAGE電泳，對得到的凝膠進行考馬斯亮藍 染色。實驗結果見附圖3(pAb泳道為多抗，Μ泳道為蛋白Marker)。由圖中可看出，在25KD和 50KD分子量區有清晰明顯的條帶，說明抗體純度很高。
[0188] 2.效價測定
[0189] 用間接ELISA法對多克隆抗體效價進行測定。所用酶標二抗為辣根過氧化物酶標 記的羊抗兔IgG，陰性對照為PBS溶液，以抗體溶液的0D值大于陰性對照0D值的2倍為陽性判 定標準。檢測結果見附圖4。從結果可看出，該抗體效價較高，大于1:1 X 105。
[0190] 實施例3曲霉菌半乳甘露聚糖(GM)抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0191] -、制備GM抗原包被的酶標板
[0192] 1.配制GM抗原包被液：
[0193] 采用〇.lm〇l/L Tris-HCl緩沖液將GM抗原稀釋至 100ng/mL，pH6.0-pH 9.0。
[0194] 2.配制封閉液：
[0195] 將2%的新生牛血清加入生理鹽水中，配制成封閉液。
[0196] 3.包被酶標板：
[0197] 1)將配制的GM抗原包被液加入酶標板孔中，每孔分別加入100yL包被液；
[0198] 2)上述酶標板置于12_18°C環境下包被6h;
[0199] 3)將配制的封閉液加入酶標板孔中，每孔分別加入100yL封閉液，置于12-18Γ溫 箱，2h;
[0200] 4)從溫箱取出酶標板后棄去封閉液，20-25 °C恒溫2h。
[0201 ]二、配制標準品（定量標準曲線的建立）
[0202] 標準品的制備是將GM抗原用0. lmol/L PBS稀釋液配制而成，GM抗原的濃度分別是 5ng/mL，2·5ng/mL，1ng/mL，0·5ng/mL，0·25ng/mL 〇
[0203] 三、配制抗GM抗原多克隆抗體溶液
[0204] 抗GM抗原多克隆抗體溶液的配制是將抗GM抗原多克隆抗體用酶偶聯物穩定劑以 1:20000的比例稀釋而成。
[0205]四、配制酶標二抗溶液
[0206]酶標二抗溶液的配制是將辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗用HRP酶偶聯 物穩定劑以1:5000的比例稀釋而成。
[0207] 五、樣本處理液
[0208] 用超純水溶解乙二胺四乙酸二鈉，配制成0.03mol/L EDTA溶液，pH 2.0-ρΗΙΟ.Ο。
[0209]六、濃縮洗液（20X0.01M PBS)
[0210]按重量份數計氯化鈉160.0份，氯化鉀4.0份，十二水合磷酸氫二鈉31.6份，磷酸二 氫鉀2.8份，吐溫-200.2份，ProCl in3002份，超純水1000份，混合均勻。
[0211] 七、樣本稀釋液
[0212]含10%脫脂乳粉的CBS稀釋液。
[0213] 八、底物溶液
[0214]四甲基聯苯胺（3，3'，5，5'-Tetramethylbenzidine，TMB)。
[0215] 九、終止液
[0216] 2mol/L硫酸溶液，將濃硫酸與超純水按1:8比例稀釋，配制成終止液。
[0217] 實施例4曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0218] 所述的GM抗原包被液，采用0. lmol/L PBS磷酸鹽緩沖溶液將GM抗原稀釋至100ng/ mL，pH6.0-pH9.0，其余步驟同實施例3。
[0219] 實施例5曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0220] 所述的GM抗原包被液，采用0.05mol/LCBS碳酸鹽緩沖溶液將GM抗原稀釋至100ng/ mL，pH6.0-pH9.0，其余步驟同實施例3。
[0221 ]實施例6曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0222] 所述的GM抗原包被液，采用O.lmol/LCBS碳酸鹽緩沖溶液將GM抗原稀釋至100ng/ mL，pH6.0-pH9.0，其余步驟同實施例3。
[0223] 實施例7曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0224] 所述的GM抗原包被液，采用0.2mol/L CBS碳酸鹽緩沖溶液將GM抗原稀釋至100ng/ mL，pH6.0-pH9.0，其余步驟同實施例3。
[0225] 實施例8曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0226] 所述的GM抗原包被液，采用生理鹽水將GM抗原稀釋至100ng/mL，其余步驟同實施 例3〇
[0227]實施例9曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備 [0228] 一、制備GM抗原包被的酶標板
[0229] 1.配制GM抗原包被液：
[0230] 采用0. lmol/L Tris-HCl緩沖液將GM抗原稀釋至5yg/mL，其pH6.0-pH9.0。
[0231] 2 ·配制封閉液：
[0232] 將5%的新生牛血清加入生理鹽水中，配制成封閉液。
[0233] 3.包被酶標板：
[0234] 1)將配制的GM抗原包被液加入酶標板孔中，每孔分別加入100yL包被液；
[0235] 2)上述酶標板置于12-18 °C環境下包被7h;
[0236] 3)將配制的封閉液加入酶標板孔中，每孔分別加入100yL封閉液，置于12-18Γ溫 箱，3h;
[0237] 4)從溫箱取出酶標板后棄去封閉液，20-25 °C恒溫3h。
[0238]二、配制標準品（定量標準曲線的建立）
[0239] 標準品的制備是將GM抗原用0. lmol/L PBS稀釋液配制而成，GM抗原的濃度分別是 5ng/mL，2·5ng/mL，1ng/mL，0·5ng/mL，0·25ng/mL 〇
[0240] 三、配制抗GM抗原多克隆抗體溶液
[0241] 抗GM抗原多克隆抗體溶液的配制是將抗GM抗原多克隆抗體用酶偶聯物穩定劑以 1:30000的比例稀釋而成。
[0242] 四、配制酶標二抗溶液
[0243]酶標二抗溶液的配制是將辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗用HRP酶偶聯 物穩定劑以1:10000的比例稀釋而成。
[0244] 五、樣本處理液
[0245] 用超純水溶解乙二胺四乙酸二鈉，配制成0.1mol/L EDTA溶液，pH 2.0-ρΗΙΟ.Ο。
[0246] 六、濃縮洗液（20X0.01M PBS)
[0247] 濃縮洗液:按重量份數計氯化鈉160.0份，氯化鉀4.0份，十二水合磷酸氫二鈉31.6 份，磷酸二氫鉀2.8份，吐溫-200.2份，ProCl in3002份，超純水1000份，混合均勻。
[0248] 七、樣本稀釋液
[0249] 含10%脫脂乳粉的CBS稀釋液。
[0250] 八、底物溶液
[0251 ]四甲基聯苯胺（3，3'，5，5'-Tetramethylbenzidine，TMB) 〇
[0252] 九、終止液
[0253] 2mol/L硫酸溶液，將濃硫酸與超純水按1:8比例稀釋，配制成終止液。
[0254] 實施例10曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0255] 所述的封閉液，采用生理鹽水溶液，將8 %的新生牛血清加入上述溶液中，配制成 封閉液，其余步驟同實施例9。
[0256] 實施例11曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0257] -、制備GM抗原包被的酶標板
[0258] 1.配制GM抗原包被液：
[0259] 采用0· lm〇l/L Tris-HCl緩沖液將GM抗原稀釋至 10yg/mL，其ρΗ6·0-pH9·0。
[0260] 2.配制封閉液：
[0261 ]將8%的新生牛血清加入生理鹽水中，配制成封閉液。
[0262] 3.包被酶標板：
[0263] 1)將配制的GM抗原包被液加入酶標板孔中，每孔分別加入100yL包被液；
[0264] 2)上述酶標板置于12_18°C環境下包被8h;
[0265] 3)將配制的封閉液加入酶標板孔中，每孔分別加入100yL封閉液，置于12-18Γ溫 箱，4h;
[0266] 4)從溫箱取出酶標板后棄去封閉液，20-25 °C恒溫4h。
[0267]二、配制標準品（定量標準曲線的建立）
[0268] 標準品的制備是將GM抗原用0. lmol/L PBS稀釋液配制而成，GM抗原的濃度分別是 5ng/mL，2·5ng/mL，1ng/mL，0·5ng/mL，0·25ng/mL 〇
[0269] 三、配制抗GM抗原多克隆抗體溶液
[0270] 抗GM抗原多克隆抗體溶液的配制是將抗GM抗原多克隆抗體用酶偶聯物穩定劑以 1:40000的比例稀釋而成。
[0271] 四、配制酶標二抗溶液
[0272]酶標二抗溶液的配制是將辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗用HRP酶偶聯 物穩定劑以1:20000的比例稀釋而成。
[0273] 五、樣本處理液
[0274] 用超純水溶解乙二胺四乙酸二鈉，配制成0.12mol/L EDTA溶液，pH 2.0-ρΗΙΟ.Ο。
[0275] 六、濃縮洗液（20X0.01M PBS)
[0276] 濃縮洗液:按重量份數計氯化鈉160.0份，氯化鉀4.0份，十二水合磷酸氫二鈉31.6 份，磷酸二氫鉀2.8份，吐溫-200.2份，ProCl in3002份，超純水1000份，混合均勻。
[0277] 七、樣本稀釋液
[0278] 含10 %脫脂乳粉的CBS稀釋液。
[0279] 八、底物溶液
[0280] 四甲基聯苯胺（3，3，，5，5'-Tetramethylbenzidine，TMB)。
[0281] 九、終止液
[0282] 2mol/L硫酸溶液，將濃硫酸與超純水按1:8比例稀釋，配制成終止液。
[0283] 實施例12曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0284] 樣本處理液的配制方法為：用超純水溶解蛋白酶K，配制成0.05mol/L蛋白酶K溶 液，其余步驟同實施例11。
[0285] 實施例13曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0286] 樣本處理液的配制方法為：用超純水溶解蛋白酶K，配制成0. lmol/L蛋白酶K溶液， 其余步驟同實施例11。
[0287] 實施例14曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0288] 樣本處理液的配制方法為：用超純水溶解蛋白酶K，配制成0.2mol/L蛋白酶K溶液， 其余步驟同實施例11。
[0289] 實施例15曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0290] 樣本處理液的配制方法為：用超純水溶解DMS0,配制成5%DMS0溶液，其余步驟同 實施例11。
[0291] 實施例16曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0292] 樣本處理液的配制方法為：用超純水溶解DMS0，配制成15 %DMS0溶液，其余步驟同 實施例11。
[0293] 實施例17曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0294] 樣本處理液的配制方法為：用超純水溶解DMS0，配制成30 %DMS0溶液，其余步驟同 實施例11。
[0295] 實施例18曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0296] -、制備GM抗原包被的酶標板
[0297] 1.配制GM抗原包被液：
[0298] 采用0· lm〇l/L Tris-HCl緩沖液將GM抗原稀釋至 10yg/mL，其ρΗ6·0-pH9·0。
[0299] 2 ·配制封閉液：
[0300]將5%的新生牛血清加入生理鹽水中，配制成封閉液。
[0301] 3.包被酶標板：
[0302] 1)將配制的GM抗原包被液加入酶標板孔中，每孔分別加入100yL包被液；
[0303] 2)上述酶標板置于12-18 Γ環境下包被8h;
[0304] 3)將配制的封閉液加入酶標板孔中，每孔分別加入100yL封閉液，置于12-18Γ溫 箱，4h;
[0305] 4)從溫箱取出酶標板后棄去封閉液，20-25 °C恒溫4h。
[0306]二、配制標準品（定量標準曲線的建立）
[0307] 標準品的制備是將GM抗原用0. lmol/L PBS稀釋液配制而成，GM抗原的濃度分別是 5ng/mL，2·5ng/mL，1ng/mL，0·5ng/mL，0·25ng/mL 〇
[0308] 三、配制標記酶的抗GM抗原多克隆抗體溶液
[0309]將辣根過氧化物酶標記的抗GM抗原多克隆抗體用HRP酶偶聯物穩定劑以1: 20000 的比例稀釋而成。
[0310] 四、樣本處理液
[0311] 用超純水溶解乙二胺四乙酸二鈉，配制成O.lmol/L EDTA溶液，pH 2.0-PH10.0。 [0312]五、濃縮洗液（20X0.01M PBS)
[0313] 濃縮洗液:按重量份數計氯化鈉160.0份，氯化鉀4.0份，十二水合磷酸氫二鈉31.6 份，磷酸二氫鉀2.8份，吐溫-200.2份，ProCl in3002份，超純水1000份，混合均勻。
[0314] 六、樣本稀釋液
[0315]含10%脫脂乳粉的CBS稀釋液。
[0316]七、底物溶液
[0317]四甲基聯苯胺（3，3'，5，5'-Tetramethylbenzidine，TMB)。
[0318] 八、終止液
[0319] 2mol/L硫酸溶液，將濃硫酸與超純水按1:8比例稀釋，配制成終止液。
[0320]實施例19曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒檢測步驟
[0321] 一、樣本的處理
[0322] 1)將待檢樣本與樣本處理液以1:1的體積比混合后沸水浴lmin。
[0323] 2)將水浴后的混合液1，000g離心lmin。
[0324] 3)離心后上清液用于檢測。
[0325] 二、檢測步驟
[0326] 1)取出已預包被抗原的96孔酶標板；
[0327] 2)配制工作洗滌液:濃縮洗液稀釋20 X (1份濃縮洗液(20X0.01M roS)加19份的 無菌去離子水或超純水）；
[0328] 3)樣本混合:分別設標準曲線組、待測樣品組，其中
[0329] 標準曲線組:各標準曲線點（GM抗原標準品a-e濃度分別為5，2.5，1，0.5,0.25ng/ mL)
[0330] 待測樣本組:處理后的待測樣本
[0331] 將兩組樣本分別與兔源抗GM抗原多克隆抗體等體積混合，轉移至酶標板孔中，每 孔加入60yL，在37°C下孵育60min;
[0332] 4)洗滌:甩掉反應液，每孔每次加入不少于300yL的洗滌液，靜置40s后拍干，重復 上述洗滌操作，共洗滌3次；
[0333] 5)加入酶標二抗：洗滌結束后，每孔加入酶標羊抗兔二抗60yL，在37°C下孵育 20min；
[0334] 6)洗滌：同步驟4);
[0335] 7)顯色:洗滌結束后，每孔加入底物溶液60yL，在37 °C孵育15min，避光；
[0336] 8)終止:每孔內加入50yL終止液，混勻后，在0D450nm處讀數；
[0337] 9)結果判斷：在計算機中分別輸入標準液和待測樣品的吸光度測定值，根據計算 軟件繪制的半對數標準曲線和方程，即可自動計算出各待測樣品中GM抗原的濃度值。
[0338] 實施例20曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒檢測步驟
[0339] 一、樣本的處理
[0340] 1)將待檢樣本與樣本處理液以3:1的體積比混合后沸水浴5min。
[0341] 2)將水浴后的混合液5,000g離心5min。
[0342] 3)離心后上清液用于檢測。
[0343] 二、檢測步驟
[0344] 1)取出已預包被抗原的96孔酶標板；
[0345] 2)配制工作洗滌液:濃縮洗液稀釋20 X (1份濃縮洗液（20X0.01M roS)加19份的 無菌去離子水或超純水）；
[0346] 3)樣本混合:分別設標準曲線組、待測樣品組，其中
[0347] 標準曲線組:各標準曲線點（GM抗原標準品a-e濃度分別為5，2.5，1，0.5,0.25ng/ mL)
[0348] 待測樣本組:處理后的待測樣本
[0349] 將兩組樣本分別與兔源抗GM抗原多克隆抗體等體積混合，轉移至酶標板孔中，每 孔加入80yL，在37°C下孵育90min;
[0350] 4)洗滌:甩掉反應液，每孔每次加入不少于300yL的洗滌液，靜置40s后拍干，重復 上述洗滌操作，共洗滌3次；
[0351] 5)加入酶標二抗：洗滌結束后，每孔加入酶標羊抗兔二抗80yL，在37°C下孵育 40min；
[0352] 6)洗滌：同步驟4);
[0353] 7)顯色:洗滌結束后，每孔加入底物溶液80yL，在37 °C孵育15min，避光；
[0354] 8)終止:每孔內加入50yL終止液，混勻后，在0D450nm處讀數；
[0355] 9)結果判斷：在計算機中分別輸入標準液和待測樣品的吸光度測定值，根據計算 軟件繪制的半對數標準曲線和方程，即可自動計算出各待測樣品中GM抗原的濃度值。
[0356] 實施例21曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒檢測步驟
[0357] 一、樣本的處理
[0358] 1)將待檢樣本與樣本處理液以5:1的體積比混合后沸水浴lOmin。
[0359] 2)將水浴后的混合液10，OOOg離心1 Omin。
[0360] 3)離心后上清液用于檢測。
[0361] 二、檢測步驟
[0362] 1)取出已預包被抗原的96孔酶標板；
[0363] 2)配制工作洗滌液:濃縮洗液稀釋20 X (1份濃縮洗液（20X0.01M roS)加19份的 無菌去離子水或超純水）；
[0364] 3)樣本混合:分別設標準曲線組、待測樣品組，其中
[0365] 標準曲線組:各標準曲線點（GM抗原標準品a-e濃度分別為5，2.5，1，0.5,0.25ng/ mL)
[0366] 待測樣本組:處理后的待測樣本
[0367] 將兩組樣本分別與兔源抗GM抗原多克隆抗體等體積混合，轉移至酶標板孔中，每 孔加入100yL，在37°C下孵育120min;
[0368] 4)洗滌:甩掉反應液，每孔每次加入不少于300yL的洗滌液，靜置40s后拍干，重復 上述洗滌操作，共洗滌3次；
[0369] 5)加入酶標二抗：洗滌結束后，每孔加入酶標羊抗兔二抗100yL，在37°C下孵育 60min；
[0370] 6)洗滌：同步驟4);
[0371] 7)顯色:洗滌結束后，每孔加入底物溶液100yL，在37 °C孵育15min，避光；
[0372] 8)終止:每孔內加入50yL終止液，混勻后，在0D450nm處讀數；
[0373] 9)結果判斷：在計算機中分別輸入標準液和待測樣品的吸光度測定值，根據計算 軟件繪制的半對數標準曲線和方程，即可自動計算出各待測樣品中GM抗原的濃度值。
[0374] 實施例22曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒檢測步驟
[0375] 一、樣本的處理
[0376] 1)將待檢樣本與樣本處理液以3:1的體積比混合后沸水浴5min。
[0377] 2)將水浴后的混合液5,000g離心5min。
[0378] 3)離心后上清液用于檢測。
[0379] 二、檢測步驟
[0380] 1)取出已預包被抗原的96孔酶標板；
[0381] 2)配制工作洗滌液:濃縮洗液稀釋20 X (1份濃縮洗液(20X0.01M roS)加19份的 無菌去離子水或超純水）；
[0382] 3)樣本混合:分別設標準曲線組、待測樣品組，其中
[0383] 標準曲線組:各標準曲線點（GM抗原標準品a-e濃度分別為5，2.5，1，0.5,0.25ng/ mL)
[0384] 待測樣本組:處理后的待測樣本
[0385] 將兩組樣本分別與標記酶的抗GM抗原多克隆抗體等體積混合，轉移至酶標板孔 中，每孔加入80yL，在37°C下孵育90min;
[0386] 4)洗滌:甩掉反應液，每孔每次加入不少于300yL的洗滌液，靜置40s后拍干，重復 上述洗滌操作，共洗滌3次；
[0387] 5)顯色:洗滌結束后，每孔加入底物溶液80yL，在37 °C孵育15min，避光；
[0388] 6)終止:每孔內加入50yL終止液，混勻后，在0D450nm處讀數；
[0389] 7)結果判斷：在計算機中分別輸入標準液和待測樣品的吸光度測定值，根據計算 軟件繪制的半對數標準曲線和方程，即可自動計算出各待測樣品中GM抗原的濃度值。
[0390]實施例23曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒檢測步驟
[0391] 一、樣本的處理
[0392] 1)將待檢樣本與樣本處理液以3:1的體積比混合后沸水浴5min。
[0393] 2)將水浴后的混合液5，000g離心5min。
[0394] 3)離心后上清液用于檢測。
[0395] 二、檢測步驟
[0396] 1)取出已預包被抗原的96孔酶標板；
[0397] 2)配制工作洗滌液:濃縮洗液稀釋20 X (1份濃縮洗液(20X0.01M roS)加19份的 無菌去離子水或超純水）；
[0398] 3)樣本混合:分別設標準曲線組、待測樣品組，其中
[0399] 標準曲線組:各標準曲線點（GM抗原標準品a-e濃度分別為5，2.5，1，0.5,0.25ng/ mL)
[0400] 待測樣本組:處理后的待測樣本
[0401] 將兩組樣本分別與兔源抗GM抗原多克隆抗體等體積混合，在37°C下孵育90min;
[0402] 4)樣本轉移:將步驟3)的混合液轉移至酶標板孔中，每孔加入80yL，在37°C下孵育 40min；
[0403] 5)洗滌:甩掉反應液，每孔每次加入不少于300yL的洗滌液，靜置40s后拍干，重復 上述洗滌操作，共洗滌3次；
[0404] 6)加入酶標二抗：洗滌結束后，每孔加入酶標羊抗兔抗體80yL，在37°C下孵育 30min；
[0405] 7)洗滌：同步驟5);
[0406] 8)顯色:洗滌結束后，每孔加入底物溶液80yL，在37 °C孵育15min，避光；
[0407] 9)終止:每孔內加入50yL終止液，混勻后，在0D450nm處讀數；
[0408] 10)結果判斷:在計算機中分別輸入標準液和待測樣品的吸光度測定值，根據計算 軟件繪制的半對數標準曲線和方程，即可自動計算出各待測樣品中GM抗原的濃度值。
[0409] 實施例24曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的臨床應用
[0410] 取實施例9的試劑盒，按照實施例20的檢測步驟進行試劑盒的臨床應用檢測。
[0411] 1.繪制標準曲線
[0412] 取實施例9的試劑盒，按實施例20的檢測步驟，得到各標準曲線點（5，2.5，1，0.5和 0.25ng/mL)的測量值如表4所示，利用表4數據，以樣品中GM抗原的濃度的對數值為橫軸(X 軸），以450nm處測得的吸光度值為縱軸(y軸），作標準曲線如圖5所示，得到標準曲線方程 為:y = -0.156 In (x )+0.9279,線性相關度R2 = 0.9976,標準曲線方程擬合良好。
[0413] 表4檢測標準曲線
[0415] 2. GM抗原免疫檢測試劑盒參考值的確定
[0416] 臨床確診為曲霉菌感染陽性樣本30例，正常人樣本200例，將樣本處理后，取實施 例9的試劑盒按照實施例20的檢測步驟測定0D450值，根據標準曲線(表4,圖5)計算GM抗原 濃度值，如表5所不。
[0417] 表5 GM抗原免疫檢測試劑盒參考值的確定ELISA臨床檢測結果
[0418]
[0419] 注表示與正常人比較Ρ〈0·01;
[0420] 根據標準曲線的結果計算檢測GM抗原的濃度，通過檢測200例正常人樣本，取95% 置信區間的抗原的濃度值為Cut-off下限：?(平均值）+2s(標準偏差）= 0.45+2*0.10 = 0.65,通過檢測30例陽性病人，取95 %置信區間的抗原的濃度值為Cut-off上限：? (平均 值）一 2s (標準偏差）=1.55 - 2*0.35 = 0.85，抗原的濃度值在0.65即/1^-0.85即/1^之間為 疑似病人。即得到GM抗原免疫檢測試劑盒的判斷標準參考值如表6所示。
[0421] 表6 GM抗原免疫檢測試劑盒判斷標準參考值
[0422]
[0423] 如果樣本的檢測結果落在可疑區間，則需要進行第二次檢測。
[0424] 實施例25試劑盒的方法學考察
[0425] 取實施例9的試劑盒按照實施例20的檢測步驟進行試劑盒方法學考察(敏感性實 驗、特異性實驗、回收率實驗、重復性實驗、穩定性實驗）。
[0426] 1.敏感性實驗
[0427] 收集臨床確診樣本20例進行檢驗。
[0428] 診斷敏感性=陽性樣本檢出例數/陽性樣本總例數X 100%，實驗結果見表7,由結 果可知，本實驗的敏感性在85%以上。
[0429] 表7敏感性檢測實驗結果
[0431] 2.特異性實驗
[0432] 檢測20例健康人樣本。
[0433] 特異性=陰性樣本檢出例數/陰性樣本總例數X 100%，實驗結果見表8,由結果可 知，本實驗的特異性在90%以上。
[0434] 表8特異性檢測實驗結果

[0436] 3 ·回收率實驗
[0437] 選擇正常人血液添加曲霉半乳甘露聚糖抗原2yg/L、lyg/L后檢測，計算真實值與 期望值的比值，得到回收率，見表9。回收率介于80-120%之間認為合格。由實驗結果說明本 實驗的回收率介于80%-120%之間，回收率良好。
[0438] 表9回收率結果實驗
[0441] 4.重復性實驗
[0442] 1)批間精密度
[0443] 合格標準:將同一標本每天一次測試，連續11個工作日，計算其均值M、標準差SD與 變異系數CV，變異系數CVS 25%為合格，結果見表10。結論:本產品批間精密度(即變異系數 CV)為10%，小于25%，符合標準，證明本產品批間精密度良好。
[0444] 表10批間精密度結果實驗
[0447] 2)批內精密度
[0448] 合格標準:將同一標本在同一批次實驗中平行測定10組數據。計算其均值M、標準 差SD與變異系數CV，變異系數CV < 15%為合格，見表11。本產品批內精密度（即變異系數CV) 為8%，小于15%，符合標準，驗證合格。
[0449] 表11批內精密度結果實驗

[0451 ] 5.穩定性實驗
[0452] 將組裝好的試劑盒在37 °C環境中放置，每天做標準曲線檢測已知濃度的抗原溶 液，連續檢測5天，檢測值變化率（即變異系數CV)小于20%，結果參見表12,證明試劑盒穩 定。其結果顯示5天的變異系數CV < 20%，說明本發明穩定性良好。
[0453] 表12穩定性試驗結果
[0454]
[0455] 實施例26不同GM抗原包被液對試劑盒檢測重復性的影響
[0456] 分別取實施例3-8制備的試劑盒，按照實施例20的檢測步驟對同一待測樣本進行 批間精密度檢測，將同一標本每天一次測試，連續10個工作日，考察不同GM抗原包被液對試 劑盒檢測的影響，檢測結果參見下表13。
[0457] 表13
[0459]
[0460] 由表13中數據可知，各試劑盒對樣本的檢測結果的CV值均小于7%，表明各試劑盒 對樣品的檢測結果的離散程度較小，重復性較好，均可用于GM抗原的免疫檢測;且實施例4 制備的試劑盒的檢測樣本濃度的變異系數CV值最小，表明實施例4中包被液較優。
[0461 ]實施例27不同封閉液對試劑盒檢測重復性的影響
[0462] 分別取實施例9-10制備的試劑盒，按照實施例20的檢測步驟對同一待測樣本進行 批間精密度檢測，將同一標本每天一次測試，連續10個工作日，考察不同封閉液對試劑盒檢 測重復性的影響，檢測結果參見下表14。
[0463] 表14

[0466] 由表14中數據可知，各試劑盒對樣本的檢測結果的CV值均小于7%，表明各試劑盒 對樣品的檢測結果的離散程度較小，重復性較好，均可用于GM抗原的免疫檢測;且實施例9 制備的試劑盒的檢測樣本濃度的變異系數CV值最小，表明實施例4中封閉液較優。
[0467] 實施例28不同樣本處理液對試劑盒檢測重復性和回收率的影響
[0468] 分別取實施例11-17制備的試劑盒，按照實施例20的檢測步驟對同一待測樣本(濃 度已知，為1.43ng/mL)進行批間精密度和回收率檢測，將同一標本每天一次測試，連續10個 工作日，考察不同樣本處理液對試劑盒檢測重復性和回收率的影響，檢測結果參見下表15。
[0469] 表15
[0471]
[0472] 由表15中數據可知，各試劑盒對樣本的檢測結果的CV值均小于7%，表明各試劑盒 對樣品的檢測結果的離散程度較小，重復性較好，均可用于GM抗原的免疫檢測;且實施例11 制備的試劑盒的檢測樣本濃度的變異系數CV值最小，且回收率接近100%，表明實施例11中 處理液較優。
[0473] 上述參照【具體實施方式】對該一種曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒及其 制備方法與應用進行的詳細描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出 若干個實施例，因此在不脫離本發明總體構思下的變化和修改，應屬本發明的保護范圍之 內。
【主權項】
1. 一種曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒，所述試劑盒包括GM抗原包被的固相 載體、抗GM抗原多克隆抗體和GM抗原標準品，所述GM抗原標準品包括至少三種已知濃度的 GM抗原溶液，所述GM抗原標準品的濃度在0-50ng/mL范圍內。2. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述GM抗原由下述方法得到： 將曲霉菌采用固體培養基培養至培養基長滿綠色孢子;過濾除去菌絲，滅活菌體及孢 子;離心后，收集孢子并洗滌;孢子經破碎后過濾除去孢子碎片;將濾液經醇沉、洗滌后，得 到GM抗原粗提物;將GM抗原粗提物經脫色、超濾后得到所述GM抗原； 所述抗GM抗原多克隆抗體，可與GM抗原特異性結合，用SDS-PAGE顯示為均一抗體產物， 用GM抗原包被，間接法ELISA檢測顯示其效價不低于1:1 X 105,所述抗GM抗原多克隆抗體由 下述方法得到： 用GM抗原作為免疫原免疫動物，對得到的血清進行分離純化，得到所述抗GM抗原多克 隆抗體;其中，免疫采用皮下注射、足墊注射、脾內注射、靜脈注射或腹腔注射，免疫劑量為 0.01 -0. lmg，所述動物為大鼠、小鼠、豚鼠、兔、雞、羊、馬、豬或驢，所述純化方法為飽和硫酸 銨鹽析沉淀法和親和層析法。3. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述固相載體為酶標板、微孔板、試管或微 孔濾膜，優選的，所述固相載體為酶標板。4. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述抗GM抗原多克隆抗體為標記酶的抗GM 抗原多克隆抗體;或者， 所述抗GM抗原多克隆抗體為未標記酶的抗GM抗原多克隆抗體，所述試劑盒還包括酶標 二抗，所述酶標二抗可與抗GM抗原多克隆抗體相結合。5. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述GM抗原標準品包括GM抗原標準品a，GM 抗原標準品b，GM抗原標準品c，GM抗原標準品d，GM抗原標準品e，其中，所述GM抗原標準品a 的濃度為5ng/mL、GM抗原標準品b的濃度為2.5ng/mL、GM抗原標準品c的濃度為Ing/mL、GM抗 原標準品d的濃度為0.5ng/mL、GM抗原標準品e的濃度為0.2 5ng/mL。6. 如權利要求1-5任一項所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括樣本處理液、 濃縮洗液、樣本稀釋液、底物溶液和終止液，所述的樣本處理液、濃縮洗液，樣本稀釋液、底 物溶液和終止液的組分及配比如下： 樣本處理液：選自以下蛋白變性溶液：〇 . 05-0.2mg/mL蛋白酶1(;?!121!110 0.03-0 · 18mol/LEDTA 溶液；5-30 %DMSO 溶液； 濃縮洗液:按重量份數計為:氯化鈉160.0份，氯化鉀4.0份，十二水合磷酸氫二鈉31.6 份，磷酸二氫鉀2.8份，吐溫-200.2份，ProCl in3002份，超純水1000份； 樣本稀釋液:含10 %脫脂乳粉的CBS稀釋液； 底物溶液:TMB; 終止液:2mol/L的硫酸溶液。7. -種曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備方法，具體步驟如下： 1)制備GM抗原包被的固相載體 配制GM抗原包被液:采用緩沖溶液將GM抗原稀釋至lOOng/mL-lOyg/mL;所述緩沖溶液 選自：Tris-HCl緩沖液，PBS緩沖液，CBS緩沖液或生理鹽水； 配制封閉液:將2%-8%的新生牛血清加入緩沖溶液中，配制成封閉液;所述緩沖溶液 選自：Tris-HCl緩沖液，PBS緩沖液，CBS緩沖液或生理鹽水； 包被固相載體:將配制的GM抗原包被液加入固相載體中；將固相載體置于12-18 °C恒溫 包被;將配制的封閉液加入固相載體中，置于12-18Γ恒溫;棄去固相載體中的封閉液，置于 20-25 °C f旦溫，即得； 2) 配制標準品 用roS緩沖液配制至少三種已知濃度的GM抗原溶液，使GM抗原標準品的濃度在0-50ng/ mL范圍內； 3) 制備抗GM抗原多克隆抗體 將抗GM抗原多克隆抗體用酶偶聯物穩定劑以1:20000-1:40000的比例稀釋而成。8. 如權利要求7所述的制備方法，其特征在于:所述的制備方法具體步驟如下： 1) 制備GM抗原包被的酶標板 配制GM抗原包被液:采用緩沖溶液將GM抗原稀釋至lOOng/mL-lOyg/mL;所述緩沖溶液 選自：0 · lmo 1/LTris-HCl緩沖液，其ρΗ6 · 0-pH9 · 0; 0 · lmol/LPBS緩沖液，其ρΗ6 · 0-pH9 · 0 ; 0 · 05-0 · 2mol/L CBS緩沖液，其pH6 · 0-pH9 · 0;或生理鹽水； 配制封閉液:將2%-8%的新生牛血清加入緩沖溶液中，配制成封閉液;所述緩沖溶液 選自：0 · lmol/LTris-HCl緩沖液，其ρΗ6 · 0-pH9 · 0; 0 · lmol/L PBS緩沖液，其ρΗ6 · 0-pH9 · 0; 0 · 05-0 · 2mol/L CBS緩沖液，其pH6 · 0-pH9 · 0;或生理鹽水； 包被酶標板:將配制的GM抗原包被液加入酶標板孔中，每孔分別加入50-150yL包被液； 酶標板置于12-18Γ環境下包被6-8h;將配制的封閉液加入酶標板孔中，每孔分別加入50-150μΙ^?閉液，置于12-18Γ恒溫箱，2-4h;從恒溫箱取出酶標板后棄去封閉液，20-25Γ恒溫 2 -4h，即得； 2) 配制標準品 將GM抗原用0. lmol/L PBS緩沖液配制，使GM抗原的濃度分別是5ng/mL，2.5ng/mL，lng/ mL，0·5ng/mL，0·25ng/mL; 3) 配制標記酶的抗GM抗原多克隆抗體溶液 采用過碘酸鹽氧化法或戊二醛交聯法將酶標記在抗GM抗原多克隆抗體上，將標記酶的 抗GM抗原多克隆抗體用酶偶聯物穩定劑以1:20000-1:40000的比例稀釋而成； 4) 配制樣本處理液、濃縮洗液、樣本稀釋液、底物溶液和終止液 所述的樣本處理液、濃縮洗液，樣本稀釋液、底物溶液和終止液的組分及配比如下： 樣本處理液：選自以下蛋白變性溶液：〇 . 05-0.2mg/mL蛋白酶1(;?!121!110 0.03-0· 18mol/L EDTA溶液;5-30%DMS0溶液； 濃縮洗液:按重量份數計氯化鈉160.0份，氯化鉀4.0份，十二水合磷酸氫二鈉31.6份， 磷酸二氫鉀2.8份，吐溫-20 0.2份，ProCl in300 2份，超純水1000份，混合均勻； 樣本稀釋液:含10 %脫脂乳粉的CBS稀釋液； 底物溶液:TMB; 終止液:2mol/L的硫酸溶液。9. 如權利要求7所述的制備方法，其特征在于:所述的制備方法具體步驟如下： 1)制備GM抗原包被的酶標板 配制GM抗原包被液:采用緩沖溶液將GM抗原稀釋至lOOng/mL-lOyg/mL;所述緩沖溶液 選自：Ο · lmol/LTriS-HC1 緩沖液，其pH6 · 0-pH9 · Ο; Ο · lmol/L PBS緩沖液，其pH6 · 0-pH9 · Ο; 0 · 05-0 · 2mol/L CBS緩沖液，其pH6 · 0-pH9 · 0;或生理鹽水； 配制封閉液:將2%-8%的新生牛血清加入緩沖溶液中，配制成封閉液;所述緩沖溶液 選自：0 · lmol/LTris-HCl緩沖液，其ρΗ6 · 0-pH9 · 0; 0 · lmol/L PBS緩沖液，其ρΗ6 · 0-pH9 · 0; 0 · 05-0 · 2mol/L CBS緩沖液，其pH6 · 0-pH9 · 0;或生理鹽水； 包被酶標板:將配制的GM抗原包被液加入酶標板孔中，每孔分別加入50-150yL包被液； 酶標板置于12-18Γ環境下包被6-8h;將配制的封閉液加入酶標板孔中，每孔分別加入50-150μΙ^?閉液，置于12-18Γ恒溫箱，2-4h;從溫箱取出酶標板后棄去封閉液，20-25Γ恒溫2-4h，即得； 2) 配制標準品 將GM抗原用0. lmol/L PBS緩沖液配制，使GM抗原的濃度分別是5ng/mL，2.5ng/mL，lng/ mL，0·5ng/mL，0·25ng/mL; 3) 配制抗GM抗原多克隆抗體溶液 將抗GM抗原多克隆抗體用酶偶聯物穩定劑以1:20000-1:40000的比例稀釋而成； 4) 配制酶標二抗溶液 將酶標二抗用酶偶聯物穩定劑以1:5000-1:20000的比例稀釋而成； 5) 配制樣本處理液、濃縮洗液、樣本稀釋液、底物溶液和終止液 所述的樣本處理液、濃縮洗液，樣本稀釋液、底物溶液和終止液的組分及配比如下： 樣本處理液：選自以下蛋白變性溶液，〇 . 05-0.2mg/mL蛋白酶1(;?!121!110 0.03-0· 18mol/L EDTA溶液;5-30%DMS0溶液； 濃縮洗液:按重量份數計氯化鈉160.0份，氯化鉀4.0份，十二水合磷酸氫二鈉31.6份， 磷酸二氫鉀2.8份，吐溫-20 0.2份，ProCl in300 2份，超純水1000份，混合均勻； 樣本稀釋液:含10 %脫脂乳粉的CBS稀釋液； 底物溶液:TMB; 終止液:2mol/L的硫酸溶液。10.如權利要求1-6任一項所述的試劑盒或如權利要求7-9任一項所述制備方法得到的 試劑盒在檢測曲霉菌半乳甘露聚糖抗原中的應用，所述應用采用競爭ELISA法。
【文檔編號】G01N33/569GK105866407SQ201610261024
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月22日
【發明人】劉春龍, 彭潔, 張舟, 李寧, 粟艷, 周澤奇
【申請人】丹娜（天津）生物科技有限公司