一種固相萃取-液質串聯檢測血脂康膠囊中的桔霉素的方法
【專利摘要】本發明提供了一種固相萃取?液質串聯檢測血脂康膠囊中的桔霉素的方法，旨在提供一種靈敏度高，定性定量準確的固相萃取?液質串聯檢測血脂康膠囊中的桔霉素的方法；該方法依次包括下述步驟：1)標準溶液的制備2)樣品前處理；3)樣品凈化；將上述樣品前處理液，以1ml/min流速通過C18固相萃取小柱，用5ml水淋洗，棄去，再用5ml甲醇洗脫收集洗脫液，洗脫液于40℃下氮吹至近干，精密加入1ml甲醇溶解，用0.22μm有機濾膜過濾，即得待測樣品上色譜柱檢測；屬于化學檢測技術領域。
【專利說明】
一種固相萃取-液質串聯檢測血脂康膠囊中的桔霉素的方法
技術領域
[0001] 本發明桔霉素的檢測方法，具體的說是一種固相萃取-液質串聯檢測血脂康膠囊 中的桔霉素的方法;屬于化學檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 桔霉素(citrinin)是1931年首次從青霉菌Penicillium citrinum中分離得到。其 分子式為C13H14O5，分子量為250.25。桔霉素有一定的腎毒性和肝毒性，能致畸、引發腫瘤及 誘發突變。而紅曲是中國傳統藥材，是用特有的紅曲霉菌在大米中培養發酵而成。因某些紅 曲霉菌株能產生具有抑制膽固醇生物合成的他汀類物質，因而中藥紅曲被開發為降血脂的 血脂康膠囊和保健食品。在1995年法國學者Blanc等首次發現了紅曲產品中含有桔霉素后， 國外已將桔霉素作為食品污染的嚴格控制指標。而在中國，中國藥典尚未將桔霉素作為含 紅曲中成藥的控制指標。
[0003] 對于血脂康膠囊一一血脂康膠囊有文獻記載用RP-HPLC法測定其桔霉素含量，而 在食品、保健食品中也有桔霉素的檢測方法:薄層層析法、熒光分光光度法、高效液相色譜 法等。
【發明內容】
[0004] 針對上述不足，本發明的目的是靈敏度高，定性定量準確的固相萃取-液質串聯檢 測血脂康膠囊中的桔霉素的方法。
[0005] 為解決上述技術問題，本發明提供的技術方案如下：
[0006] -種固相萃取-液質串聯檢測血脂康膠囊中的桔霉素的方法，依次包括下述步驟：
[0007] 1)標準溶液的制備
[0008] 標準儲備液:精密稱取標準物質10mg，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并至刻度，使 成濃度為lmg/ml;
[0009] 標準稀釋液:精密吸取標準溶液0.2ml，置100ml的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度， 使成濃度為2μg/mll;
[0010] 標準工作曲線：取標準稀釋液液適量加甲醇，分別配制成濃度為0.01、2、5、10、 20ng/ml標準工作液；
[0011] 2)樣品前處理
[0012] 膠囊劑取內容物〇. 5g，置10ml錐形瓶中，加3ml 1 %甲酸-甲醇溶液，在250W，45°C 超聲波提取30min，冷卻，過濾，濾液轉移至25ml容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻后過濾，待 用；
[0013] 3)樣品凈化
[0014] 分別以3ml甲醇和3ml水活化HLB固相萃取將上述樣品前處理液，以lml/min流速通 過C18固相萃取小柱，用5ml水淋洗，棄去，再用5ml甲醇洗脫收集洗脫液，洗脫液于40°C下氮 吹至近干，精密加入lml甲醇溶解，用0.22μπι有機濾膜過濾，即得待測樣品；
[0015] 將上述樣品前處理液，以lml/min流速通過C18固相萃取小柱，用5ml水淋洗，棄去， 再用5ml甲醇洗脫收集洗脫液，洗脫液于40°C下氮吹至近干，精密加入lml甲醇溶解，用0.22 μπι有機濾膜過濾，即得待測樣品；
[0016] 4)液相色譜與質譜條件
[0017] 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus柱2· 1 X50mm，1 ·8μηι;流動相Α為0· 1 % 甲 酸，流動相B為乙腈，采用梯度洗脫程序如下：0-4.01^114、70-10%，8、30-90%;4.0-5.5min，A、10%，B、90% ;5.5.-5.6min，A、70%，B、30% ;流速0.3ml/min;柱溫40°C;進樣量2 μL;電噴霧源ESI，正離子方式，選擇多反應監測MRM，載氣溫度：150°C，載氣流量：15L/min， 霧化器壓力40psi，鞘氣溫度350 °C，鞘氣流量：12L/min，毛細管電壓3500V，定性定量離子： 母離子m/z = 251.2，子離子m/z233.2和m/z205.2，碰撞能量分別為5V和20V，Frag均為380V。
[0018] 進一步的，上述的一種固相萃取-液質串聯檢測血脂康膠囊中的桔霉素的方法，所 述的色譜儀采用Agilentl290-6490三重四級桿液相質譜聯用儀。
[0019] 本文采用固相萃取-液相色譜-串聯質譜法檢測中成藥中的桔霉素，為中成藥檢測 桔霉素具凈化效率高、分辨率高、噪聲低、靈敏度高，定性定量準確、可靠等特點的參考方 法。
【附圖說明】
[0020]圖1是2μg/ml桔霉素標準溶液多反應監測圖。
[0021]圖2是空白樣品的多反應監測圖。
【具體實施方式】
[0022]下面結合【具體實施方式】，對本發明的權利要求做進一步的詳細說明，但不構成對 本發明的任何限制，任何在本發明權利要求保護范圍所做的有限次的修改，仍在本發明的 權利要求保護范圍之內。
[0023] 實施例1
[0024] 1 材料
[0025] 1.1儀器
[0026] Agilentl290-6490三重四級桿液相質譜聯用儀（美國Agilent)、HLB-SPE柱（60mg/ 3ml，上海安譜科學儀器有限公司）、Agilent ZORBAX Eclipse Plus(2.1X50mm，1.8ym;美 國Agi 1 ent)、XA20OTU電子天平(德國梅特勒托利多公司）、超聲波清洗器。
[0027] 1.2血脂康膠囊與試劑
[0028]血脂康膠囊3批，均來源于市場銷售樣品。
[0029] 桔霉素（批號：518-75-2-150403,標準品購于Pribolab，純度>98%)，甲醇和乙腈 均為色譜純，其它試劑均為分析純，實驗用水為經ELGA PURELAB ClassicUVF凈化系統過濾 的去離子水。
[0030] 本發明所涉及到的百分濃度，沒有特別說明的，液體均為體積濃度，溶質為固體的 指質量濃度。
[0031] 2方法與結果
[0032] 2.1標準溶液的制備
[0033] 2.1.1標準儲備液:精密稱取標準物質10mg，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并至刻 度，使成濃度為lmg/ml。
[0034] 2.1.2標準稀釋液:精密吸取標準溶液0.2ml，置100ml的容量瓶中，加甲醇稀釋至 刻度，使成濃度為2μg/ml，檢測結果見見圖1。
[0035] 2.1.3標準工作曲線：取標準稀釋液液適量加甲醇，分別配制成濃度為0.01、2、5、 10、20ng/ml標準工作液。
[0036] 2.2樣品前處理
[0037] 膠囊劑取內容物0.5g，置10ml錐形瓶中，加3ml 1 %甲酸-甲醇溶液，在250W，45 °C 超聲波提取30min，冷卻，過濾，濾液轉移至25ml容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻后過濾，待 用。
[0038] 2.3樣品凈化
[0039]將上述樣品前處理液，以約lml/min流速通過C18固相萃取小柱(使用前分別以3ml 甲醇和3ml水活化），用5ml水淋洗，棄去，再用5ml甲醇洗脫收集洗脫液，洗脫液于40°C下氮 吹至近干，精密加入lml甲醇溶解，用0.22μπι有機濾膜過濾，即得待測樣品。
[0040] 2.4液相色譜與質譜條件
[0041] 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus柱（2 · 1 X 50mm，1 · 8μηι);流動相Α為0 · 1 % 甲酸，流動相B為乙腈，采用梯度洗脫程序，見表1。流速0.3ml/min;柱溫40°C ;進樣量2μ1;電 噴霧源(ESI)，正離子方式，選擇多反應監測(MRM)，載氣溫度：150°C，載氣流量：15L/min，霧 化器壓力40psi，鞘氣溫度350°C，鞘氣流量：12L/min，毛細管電壓3500V，定性定量離子:母 離子m/z = 251.2(M+1)，子離子m/z233.2和m/z 205.2，碰撞能量分別為5V和20V，Frag均為 380V〇
[0042] 表1梯度洗脫程序
[0043] Tab 1Gradient elution program
[0045] 2.5實際樣品的測定
[0046] 在本試驗中，以定量離子峰面積代入標準系列的回歸方程計算，結果血脂康膠囊3 批，均未檢出桔霉素。
[0047] 2.4方法的準確度
[0048]在經測定不含有桔霉素的二種基質的空白樣品中進行加標回收率試驗，加標濃度 為0.01ng/ml。平行測定6次，得到的平均加標回收率液體制劑范圍為95%~105%，參見圖 2〇
[0049]本發明提供的技術方案用水(含0.1%甲酸)+乙腈= 70+30作流動相，流速0.3ml/ min，桔霉素的色譜峰對稱，采用串聯質譜檢測器進行檢測，由于串聯質譜具有在分離、高分 辨能力和靈敏度高的特性，配合多反應監測模式(MRM)及母離子和兩個相應的子離子進行 監測，達到了準確的定性和定量的目的，簡化了對流動相選擇的步驟，所以本方法選用了上 述流動相及其比例。
[0050] 為了解本方法采用C18固相萃取小柱對樣品中的桔霉素進行凈化后，在測定時對 質譜檢測的基質干擾情況，選擇一個未檢出桔霉素的樣品按方法進行萃取作基質液，并加 入標準系列，同時對外標標準系列進行質譜測定，根據保留時間對應的定量離子峰面積與 其濃度進行回歸分析，得基質液加標準系列的回歸方程為Y = 3 298.522531X+4 528.423 351，r = 0.999 4,與外標回歸方程Υ = 3 329.186799Χ+4 586.551 631(r = 0.999 4)進行比 較，兩者無實質性差異，表明C18固相萃取小柱對樣品基質有明顯凈化作用。
[0051] 本文建立了含紅曲血脂康膠囊的桔霉素液相色譜-串聯質譜測定，本方法在6min 內完成了對該物質的分析測定，在保證定性定量準確的情況下，實現了高靈敏的分析，并在 提取過程中減少了甲苯等有毒試劑的使用，具有高效、環保等特點，可為血脂康膠囊中的桔 霉素監測提供技術支撐。
【主權項】
1. 一種固相萃取-液質串聯檢測血脂康膠囊中的桔霉素的方法，其特征在于，依次包括 下述步驟： 1) 標準溶液的制備 標準儲備液:精密稱取標準物質l〇mg，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并至刻度，使成濃 度為lmg/ml; 標準稀釋液:精密吸取標準溶液〇.2ml，置100ml的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，使成 濃度為2μg/mll; 標準工作曲線：取標準稀釋液液適量加甲醇，分別配制成濃度為0.01、2、5、10、20ng/ml 標準工作液； 2) 樣品前處理 膠囊劑取內容物〇. 5g，置10ml錐形瓶中，加3ml 1 %甲酸-甲醇溶液，在250W，45°C超聲 波提取30min，冷卻，過濾，濾液轉移至25ml容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻后過濾，待用； 3) 樣品凈化 分別以3ml甲醇和3ml水活化HLB固相萃取將上述樣品前處理液，以lml/min流速通過 C18固相萃取小柱，用5ml水淋洗，棄去，再用5ml甲醇洗脫收集洗脫液，洗脫液于40°C下氮吹 至近干，精密加入lml甲醇溶解，用0.22μπι有機濾膜過濾，即得待測樣品； 4) 液相色譜與質譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse Plus柱2.1X50mm，1.8ym;流動相Α為0.1% 甲酸，流 動相B為乙腈，采用梯度洗脫程序如下：0-4.0min，A、70-10%，B、30-90% ;4.0-5.5min，A、 10%，8、90%;5.5.-5.611^114、70%，8、30%;流速0.31111/1^11 ;柱溫40°(：;進樣量2以1;電噴霧 源ESI，正離子方式，選擇多反應監測MRM，載氣溫度：150 °C，載氣流量：15L/min，霧化器壓力 40psi，鞘氣溫度350°C，鞘氣流量：12L/min，毛細管電壓3500V，定性定量離子:母離子m/z = 251.2，子離子m/z233.2和m/z205.2，碰撞能量分別為5V和20V，Frag均為380V。2. 根據權利要求1所述的一種固相萃取-液質串聯檢測血脂康膠囊中的桔霉素的方法， 其特征在于，所述的色譜儀采用Agilentl290-6490三重四級桿液相質譜聯用儀。
【文檔編號】G01N30/88GK105866307SQ201610234922
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月15日
【發明人】陳學松, 羅達龍, 王 華
【申請人】廣西壯族自治區梧州食品藥品檢驗所