一種氨芐西林分子印跡傳感器的制備方法及應用

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一種氨芐西林分子印跡傳感器的制備方法及應用
【專利摘要】本發明實施例公開了一種氨芐西林分子印跡傳感器的制備方法及應用，其中氨芐西林分子印跡傳感器的制備方法包括：(1)對惰性電極預處理；(2)將共聚合單體吡咯、魯米諾及模板分子氨芐西林溶于pH值為4～7的緩沖溶液中，得到聚合液，其中，共聚合單體吡咯與魯米諾的物質的量的比為(1～8)：1；吡咯與氨芐西林的物質的量的比為1：(1～6)；(3)將預處理后的惰性電極置于聚合液中采用循環伏安法進行電聚合，在所述惰性電極表面得到結合有氨芐西林的吡咯?魯米諾共聚物膜；(4)用洗脫劑去除共聚物膜所結合的氨芐西林，得到氨芐西林分子印跡傳感器。所制備的氨芐西林分子印跡傳感器具有檢測靈敏度高、發光效率高等特點。
【專利說明】
一種氨芐西林分子印跡傳感器的制備方法及應用
技術領域
[0001] 本發明涉及抗生素檢測領域，特別涉及一種氨芐西林分子印跡傳感器的制備方法及應用。
【背景技術】
[0002] 分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymer，簡稱MIP)是利用分子印跡技術制備的具有與模板分子在空間結構和結合位點上完全匹配的高分子聚合物。MIP的制備是通過以下方法實現的：首先模板分子與功能單體在反應混合溶液中通過化學鍵或氫鍵結合形成配合物;然后進行共聚形成聚合物，使功能單體上的功能基團在空間排列和空間定向上固定下來;再用物理或化學方法洗去模板分子，得到具有一定大小和形狀的空穴及確定空間排列的功能基團的分子印跡聚合物。常用的制備方法有恒電位法、恒電流法及循環伏安法等。
[0003] 近年來，利用具有特異選擇性、環境耐受性強、結構可控以及樣品處理簡單的分子印跡聚合物作為識別元件構建分子印跡傳感器實現目標分析物的分析測定成為一種非常有發展前景的檢測方法。電化學發光(ECL)將電化學技術的電位可控性與化學發光分析的高靈敏度相結合，具有檢測靈敏度高、線性范圍寬、光電信號同時采集、儀器構造及操作簡單、便于檢測等優點。利用選擇性良好的MIP與檢測靈敏度高的ECL檢測方法結合構建分子印跡電化學發光傳感器，可利用模板分子重結合前后引起的ECL信號變化對模板分子進行定量測定。根據模板分子識別后引起的電化學發光信號變化的不同趨勢，又可將分子印跡電化學發光傳感器分為Turn-on型（即信號增強型)及Turn-off型（即信號減弱型）Jurn-on 型分子印跡電化學發光傳感器具有更高的檢測靈敏度，但是現已報道的分子印跡電化學發光傳感器多為Turn-off型。此外，根據ECL試劑的狀態又可將ECL傳感器分為液相ECL及固相 ECL傳感器，液相ECL傳感器即直接利用ECL試劑的水溶液進行測定，具有背景干擾難以消除及試劑消耗量大等缺點。固相ECL將ECL試劑固定在電極表面，具有發光效率高，背景干擾小，可重復使用等特點。
[0004] 現階段，將高靈敏度的ECL檢測方法與特異性強的MIP結合構建分子印跡電化學發光傳感器的報道很少，構建的分子印跡電化學發光傳感器多利用液相ECL進行測定，且多為 Turn-off型。至今為止，僅有一篇文獻報道利用納米材料將ECL試劑三聯吡啶釕固定在電極表面，并以可以增強三聯吡啶釕ECL響應的異煙肼作為模板分子構建了 Turn-on型固相分子印跡電化學發光傳感器。但是三聯吡啶釕的固定過程及MIP的聚合過程分兩步進行，使傳感器的構建過程更加繁瑣耗時。
[0005] 氨芐西林(AM)又名氨芐青霉素，是一種抗感染能力較強的β內酰胺類抗生素，具有廣譜抗菌作用。AM常用于敏感細菌所致的呼吸道感染、皮膚感染、肺炎、傷寒、支氣管炎和腸胃炎等疾病的治療，在畜牧業生產中有廣泛的應用，導致了其在動物源食品中的殘留。人們長期使用AM或食用含AM殘留的肉、蛋、奶制品會造成AM在體內累積，引起人體內微生物的耐藥性及過敏反應等問題，對人體健康產生了安全隱患。
[0006] 目前國內外常用的檢測AM的方法主要有高效液相色譜法、熒光法和紫外吸收分光光度法等。但高效液相色譜法存在著儀器操作耗時、樣品處理繁瑣等缺點，熒光法具有選擇性不高的缺點，紫外吸收分光光度法的檢測靈敏度及選擇性均不夠高。因此進一步發展簡便、靈敏、快速的AM檢測方法具有非常重要的意義。

【發明內容】

[0007] 本發明實施例公開了一種氨芐西林分子印跡傳感器的制備方法及應用，用于制備出能夠簡便、靈敏、快速的檢測氨芐西林的氨芐西林分子印跡傳感器。技術方案如下：
[0008] 本發明首先提供了一種氨芐西林分子印跡傳感器的制備方法，包括：
[0009] (1)對惰性電極預處理；
[0010] (2)將共聚合單體啦咯、魯米諾及模板分子氨芐西林溶于pH值為4~7的緩沖溶液中，得到聚合液，其中，共聚合單體吡咯與魯米諾的物質的量的比為（1~8): 1;吡咯與氨芐西林的物質的量的比為1: (1~6);
[0011] (3)將預處理后的惰性電極置于聚合液中采用循環伏安法進行電聚合，在所述惰性電極表面得到結合有氨芐西林的吡咯-魯米諾共聚物膜；
[0012] (4)用洗脫劑去除共聚物膜所結合的氨芐西林，得到氨芐西林分子印跡傳感器。
[0013] 在本發明的【具體實施方式】中，所述惰性電極選自于金電極、鉑電極、玻碳電極或石墨電極，優選為金電極。
[0014] 在本發明的【具體實施方式】中，所述緩沖溶液為磷酸緩沖溶液，pH值為6。
[0015] 在本發明的【具體實施方式】中，所述采用循環伏安法進行電聚合的聚合條件包括：掃描電位為〇~IV;掃速為30~80mV 中的任一值，循環掃描圈數為3~10圈中的任一值。
[0016] 在本發明的【具體實施方式】中，所述洗脫劑為9:l(v/v)的甲醇-乙酸溶液、0.01M的 NaOH溶液或0.01M的HC1溶液。
[0017] 在本發明的【具體實施方式】中，吡咯在緩沖溶液中的濃度為(10~30)mM。
[0018] 本發明還提供了由前述的方法制備的氨芐西林分子印跡傳感器。
[0019] 本發明進一步還提供了上述的氨芐西林分子印跡傳感器在檢測氨芐西林分子中的應用。
[0020] 在本發明的【具體實施方式】中，所述檢測氨芐西林分子的步驟包括：
[0021] (a)配制不同已知濃度的氨芐西林標準品溶液及不含氨芐西林的空白樣品溶液；
[0022] (b)將氨芐西林分子印跡傳感器分別在所配制的氨芐西林標準品溶液中及空白樣品溶液中浸泡指定時間后，分別置于檢測底液中測定結合了不同濃度氨芐西林的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL強度；
[0023] (c)計算&~Cn濃度氨芐西林標準品溶液對應的氨芐西林分子印跡傳感器的ECUS 度差值AECLi-AECU，其中，AECLFECLi-ECLQ，！ < i <n，ECL〇為空白樣品溶液對應的氨節西林分子印跡傳感器的ECL強度；
[0024] (d)以氨芐西林濃度為橫坐標或縱坐標，以強度差值Δ ECU為縱坐標或橫坐標建立標準曲線，得到氨芐西林濃度與強度差值AECU的線性方程；
[0025] (e)以未知濃度的氨芐西林溶液代替氨芐西林標準品溶液，執行步驟(b)及(c);確定未知濃度的氨芐西林溶液所對應的ECL強度差值;根據步驟(d)中的線性方程即可得到未知濃度的氨芐西林溶液中的氨芐西林濃度。
[0026] 在本發明的【具體實施方式】中，步驟(b)中的檢測底液中含有電活性物質1，1'_二茂鐵雙羧酸。
[0027] 通過上述技術方案可知，本發明以吡咯、魯米諾為共聚單體，在惰性電極的表面聚合得到對氨芐西林具有特異選擇性及化學發光特性的吡咯-魯米諾共聚物膜，從而獲得氨節西林分子印跡傳感器;該傳感器屬于Turn-on型傳感器，具有檢測靈敏度高的特點；同時由于將ECL試劑魯米諾固定于共聚物膜中形成固相ECL傳感器，因而該傳感器又具有發光效率高，背景干擾小，可重復使用等特點。
[0028] 采用本發明提供的氨芐西林分子印跡傳感器，可以實現簡便、靈敏、快速的檢測氨芐西林，可以廣泛應用于各領域，尤其適用于食品中氨芐西林的檢測。
【附圖說明】
[0029] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
[0030] 圖1為本發明實施例1步驟(3)中電聚合的循環伏安曲線，圖中由上至下的曲線1到 5分別為聚合第一圈至第五圈的曲線；
[0031] 圖2為4種物質的紅外光譜圖，其中a為AM的紅外光譜圖，b為PPY的紅外光譜圖，c為 PL的紅外光譜圖，d為AM-MIP的紅外光譜圖；
[0032] 圖3為裸金電極、覆蓋有AM-MIP膜的金電極、脫除AM的氨芐西林分子印跡傳感器及重新結合有50μΜ AM后的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL曲線，其中曲線a為裸金電極的ECL 曲線，曲線b為覆蓋有AM-MIP膜的金電極的ECL曲線，曲線c為脫除AM的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL曲線，曲線d為重新結合有50μΜ AM后的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL曲線； [0033]圖4A為實施例5中為結合有不同濃度AM的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL曲線，圖中由下至上的曲線a-h分別為結合有AM的濃度為0 (即空白樣品溶液）、0.07、0.5、0.7、3、10、 20及50μΜ的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL曲線；
[0034]圖4Β為實施例5建立的氨節西林分子印跡傳感器的檢測標準曲線；
[0035]圖5為洗脫了氨芐西林或結合0.7μΜ氨芐西林的氨芐西林分子印跡傳感器分別在不包含Fc(C00H)2或包含2mM Fc(C00H)2的pH 8.0磷酸緩沖液中的ECL曲線，其中，曲線a為洗脫了氨芐西林的氨芐西林分子印跡傳感器在不包含Fc(C00H)2的pH 8.0磷酸緩沖液中的 ECL曲線；曲線b為洗脫了氨芐西林的氨芐西林分子印跡傳感器在包含2mM Fc(⑶0H)2的pH 8.0磷酸緩沖液中的ECL曲線；曲線c為結合0.7μΜ氨芐西林的氨芐西林分子印跡傳感器在不包含Fc(C00H) 2的pH 8.0磷酸緩沖液中的ECL曲線；曲線d為結合0.7μΜ氨芐西林的氨芐西林分子印跡傳感器在包含2mM Fc(C00H)2的pH 8.0磷酸緩沖液中的ECL曲線；
[0036]圖6為實施例7中結合有不同濃度AM的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL曲線，圖中由下至上的曲線a-f分別為結合有AM的濃度為0(即空白樣品溶液）、0.7、9、20、500&700nM 的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL曲線。
【具體實施方式】
[0037]本發明首先提供了一種氨芐西林分子印跡傳感器的制備方法，包括：
[0038] (1)對惰性電極預處理；
[0039] (2)將共聚合單體吡咯、魯米諾及模板分子氨芐西林溶于pH值為4~7的緩沖溶液中，得到聚合液，其中，共聚合單體吡咯與魯米諾的物質的量的比為（1~8): 1;吡咯與氨芐西林的物質的量的比為1: (1~6);
[0040] (3)將預處理后的惰性電極置于聚合液中采用循環伏安法進行電聚合，在所述惰性電極表面得到結合有氨芐西林的吡咯-魯米諾共聚物膜；
[0041] (4)用洗脫劑去除共聚物膜所結合的氨芐西林，得到氨芐西林分子印跡傳感器。 [0042]在現有技術中，一般在制備分子印跡傳感器時均需要先對惰性電極進行預處理，以便得到更光滑潔凈的電極表面。
[0043] 在本發明的【具體實施方式】中，步驟(1)可以采用如下方案實現:先將惰性電極用不同粒度的拋光粉進行拋光處理，然后再用乙醇和蒸餾水進行清洗。優選地，可以先后采用 1.0、0.5、0.05μπι的氧化鋁粉對惰性電極進行拋光處理，然后分別用乙醇和蒸餾水超聲振蕩 5分鐘，最后用蒸餾水沖洗后干燥。
[0044] 在本發明的【具體實施方式】中，惰性電極選自于金電極、鉑電極、玻碳電極或石墨電極中的一種，優選為金電極。
[0045] 在步驟（2)中，用于聚合的單體魯米諾，也稱為3-氨基苯二甲酰肼，英文名稱為 luminolo
[0046] 在本發明的【具體實施方式】中，步驟(2)中的緩沖溶液為0.1M磷酸緩沖液(pH 6.0)。
[0047] 在本發明的【具體實施方式】中，共聚合單體吡咯與魯米諾的物質的量的比為（2~ 6): 1;吡咯與氨芐西林的物質的量的比為1: (2~4)，吡咯在緩沖溶液中的濃度為（10~30) mM〇
[0048] 在步驟(2)獲得聚合液后，即可進行步驟(3)，本發明采用循環伏安法進行電聚合；在現有技術中，循環伏安法是一種常用的電聚合方法，其操作方法、及所用的聚合裝置，例如所構建的三電極體系(例如以Ag/AgCl電極作為參比電極，以鉑電極作為對電極，以本發明所用的惰性電極作為工作電極）、及用于聚合的電解池、電化學工作站等均為現有技術，本發明在此不進行限定，電聚合的聚合條件可以包括:掃描電位為〇~IV，掃速為30~80mV f 1中的任一值，循環掃描圈數為3~1 〇圈中的任一值。
[0049] 在本發明的【具體實施方式】中，步驟(4)具體可以采用下述方案實施：
[0050] 將步驟(3)中聚合后的惰性電極置于預先配制的洗脫劑中，攪拌10-30分鐘后，便可以將模板分子氨芐西林從步驟(3)中獲得的吡咯-魯米諾共聚物膜中脫除，然后用水沖洗后，室溫晾干即可。其中，所用的洗脫劑可以為9: l(v/v)的甲醇-乙酸溶液（即甲醇、乙酸體積比為9:1)、0.01M的NaOH溶液或0.01M的HC1溶液。
[0051] 在經過步驟(4)將模板分子洗脫后，即可得到對氨芐西林具有特異選擇性并具有化學發光特性的氨芐西林分子印跡傳感器。
[0052] 應用本發明所制備的氨芐西林分子印跡傳感器，可以簡便、靈敏、快速的檢測氨芐西林分子。
[0053]在本發明的【具體實施方式】中，檢測氨芐西林分子的步驟包括：
[0054] (a)配制不同已知濃度的氨芐西林標準品溶液及不含氨芐西林的空白樣品溶液;配制溶液的方法均可以采用本領域常用的方法，本發明在此不進行限定。
[0055] (b)將氨芐西林分子印跡傳感器分別在所配制的氨芐西林標準品溶液中及空白樣品溶液中浸泡指定時間后，分別測定結合了不同濃度氨芐西林的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL強度；
[0056] 在本發明的【具體實施方式】中，步驟(b)中的浸泡時間可以在10-30分鐘內；
[0057] 在本發明的【具體實施方式】中，步驟(b)測定結合了不同濃度氨芐西林的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL強度，可以采用如下方案實施：
[0058]將浸泡過氨芐西林標準品溶液及空白樣品溶液的氨芐西林分子印跡傳感器作為工作電極，分別與參比電極、對電極組成三電極體系，將三電極體系置于檢測底液中，采用電化學工作站及電化學發光檢測儀檢測不同濃度氨芐西林標準品溶液及空白樣品溶液對應的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL強度，所獲得檢測結果通過安裝有電化學分析儀工作軟件的計算機輸出；需要說明的是，在【具體實施方式】中，每檢測完一個濃度的氨芐西林溶液后，需要對氨芐西林分子印跡傳感器中所結合的氨芐西林進行脫除處理，可以采用制備方法中的步驟(4)的方案來實現，本發明在此不在進行贅述。在脫除了氨芐西林后，再將氨芐西林分子印跡傳感器浸泡于其它濃度的標準品溶液中，然后再進行檢測。
[0059] (c)計算&~Cn濃度氨芐西林標準品溶液對應的氨芐西林分子印跡傳感器的ECUS 度差值AECLi-AECU，其中，AECLFECLi-ECLQ，！ < i <n，ECL〇為空白樣品溶液對應的氨節西林分子印跡傳感器的ECL強度；
[0060] (d)以氨芐西林濃度為橫坐標或縱坐標，以強度差值Δ ECU為縱坐標或橫坐標建立檢測標準曲線，得到氨芐西林濃度與強度差值AECU的線性方程；
[0061] (e)以未知濃度的氨芐西林溶液代替步驟(a)中的氨芐西林標準品溶液，執行步驟 (b)及(c);確定未知濃度的氨芐西林溶液所對應的ECL強度差值;根據步驟(d)中的線性方程即可得到未知濃度的氨芐西林溶液中的氨芐西林濃度。
[0062] 另外，發明人經研究發現，在檢測氨芐西林的過程中，在檢測底液中加入電活性物質1，Γ-二茂鐵雙羧酸，可以顯著增強本發明提供的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL強度。在本發明的一種【具體實施方式】中，1，Γ -二茂鐵雙羧酸在檢測底液中的濃度為1~4mM。
[0063] 在本發明，所說的1，Γ-二茂鐵雙羧酸，其結構式如下：
[0065] 在本發明中，所提及的濃度單位Μ表示mol/L;
[0066] 在本發明中，所說的"氨節西林分子印跡傳感器"及"脫除了氨節西林的氨節西林分子印跡傳感器"具有相同的含義，均是指沒有結合氨芐西林的分子印跡傳感器。
[0067] 下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
[0068] 在下述各實施例及全文中，AM代表氨芐西林;PY代表吡咯；luminol代表魯米諾。 [0069]儀器和材料
[0070] 電化學工作站CHI 660A CH Instruments，上海辰華儀器公司；
[0071] 傅里葉變換紅外光譜儀IRAff inity-Ι型，日本島津公司；
[0072]電化學發光檢測儀MPI-E型，西安瑞邁分析儀器有限責任公司；
[0073]所需試劑皆市售可得。
[0074] 實施例1
[0075]制備氨芐西林分子印跡傳感器
[0076] 步驟（1)先后采用1.0,0.5和0.05以!11的氧化鋁粉對金電極進行拋光處理，將處理后的金電極分別用乙醇和蒸餾水超聲振蕩5分鐘，最后用蒸餾水沖洗后干燥；
[0077]步驟（2)將吡咯、魯米諾及氨芐西林溶于0.1M磷酸緩沖液(pH 6.0)中，得到含有 20mM吡略，5mM魯米諾及60mM氨芐西林的聚合液；
[0078]步驟(3)以Ag/AgCl電極作為參比電極，鉑電極作為對電極，金電極作為工作電極，使用CHI 660A型電化學工作站（CH Instruments，上海辰華儀器公司）進行循環伏安法掃描，電壓范圍為0~IV，掃速為50mV ?Γ1，掃描圈數為5圈，在金電極表面獲得了結合有氨芐西林的吡咯-魯米諾共聚物膜，簡稱為ΑΜ-ΜΙΡ膜，并在室溫下干燥處理，電聚合過程中的循環伏安曲線圖如圖1所示；
[0079] 從圖1中可以看出，電聚合第一圈時，在0.55及0.9V左右分別得到魯米諾單體及吡咯單體的氧化峰。隨著聚合圈數逐漸增加，魯米諾單體及吡咯單體的氧化峰電流逐漸降低。結果說明：結合有模板分子的ΑΜ-ΜΙΡ膜已成功聚合在金電極表面，并且阻礙了luminol單體及PY單體進一步到達電極表面發生氧化還原反應。
[0080] 為進一步證明步驟(3)聚合得到了 ΑΜ-ΜΙΡ膜，利用傅里葉變換紅外光譜法對AM，聚吡咯（簡稱PPY)，聚luminol (簡稱PL，通過電化學聚合方法在含有5mM luminol的0 · 1M pH 6.0磷酸緩沖液中進行CV掃描5圈制備而成，掃描電位0~IV，掃速50mV ?Γ1)及ΑΜ-ΜΙΡ膜進行了表征，如圖2所示。在ΑΜ-ΜΙΡ薄膜的紅外譜圖中可以發現AM在1773cm- 1處的羧基伸縮振動峰(V-CQQH)及1384~1398(^1附近的甲基C-H彎曲振動雙峰(〇 c-η)，說明在電聚合過程中模板分子AM已被成功結合在ΑΜ-ΜΙΡ薄膜中。在ΑΜ-ΜΙΡ薄膜的紅外譜圖中可以發現PPY在1529CHT 1 處的C-N不對稱環拉伸振動(vasC-N)特征峰，說明電聚合過程中，ΑΜ-ΜΙΡ薄膜中形成了聚吡咯結構。此外，無法用FTIR證實在ΜΙΡ薄膜中成功合成PL。但后續的ECL(電化學發光)實驗可進一步證實PL也成功聚合到ΜΙΡ薄膜中。
[0081] 步驟（4)，將步驟（3)中聚合后的金電極置于20mL預先配制的甲醇-乙酸溶液（甲醇、乙酸體積比為9:1)中，磁力攪拌20分鐘后，將AM脫除，然后用水沖洗后，室溫晾干即可。 [0082] 實施例2
[0083]制備氨芐西林分子印跡傳感器
[0084] 實施例2與實施例1相比，步驟（1)和(4)完全相同；步驟(2)、步驟(3)與實施例1的區別在于：
[0085]步驟(2)，將吡咯、魯米諾及模板分子氨芐西林溶于0.1M磷酸緩沖液(pH 6.0)中，得到含有30mM吡咯，4mM魯米諾及30mM氨芐西林的聚合液；
[0086] 步驟(3)，電壓范圍為0~IV，掃速為80mV S4,掃描圈數為3圈。
[0087] 實施例3
[0088]制備氨芐西林分子印跡傳感器
[0089] 實施例3與實施例1相比，步驟（1)和(4)完全相同；步驟(2)、步驟(3)與實施例1的區別在于：
[0090] 步驟(2)，將吡咯、魯米諾及模板分子氨芐西林溶于0.1M磷酸緩沖液(pH 6.0)中，得到含有10mM吡咯，10mM魯米諾及80mM氨芐西林的聚合液；
[0091] 步驟(3)，電壓范圍為0~IV，掃速為30mV s4,掃描圈數為10圈。
[0092] 實施例4
[0093] 檢測實施例1制備的氨芐西林分子印跡傳感器對AM的特異性識別作用
[0094] 將實施例1制備過程中，步驟（1)中電聚合前的金電極(簡稱為裸金電極）、步驟(3) 中制得的覆蓋有AM-MIP膜的金電極、步驟(4)中脫除AM的氨芐西林分子印跡傳感器以及重新結合有50μΜ AM后的氨節西林分子印跡傳感器分別作為工作電極，并以Ag/AgCl為參比電極，Pt為對電極，組成三電極體系，進行ECL檢測，以pH 8.0的磷酸緩沖液作為檢測底液，所獲得檢測結果通過安裝有電化學分析儀工作軟件的計算機輸出，結果如圖3所示；
[0095] 從圖3中可以看出，與裸金電極相比（圖3中曲線a)，在金電極表面電聚合AM-MIP膜后，電極的ECL強度明顯增強（圖3中曲線b)。這是因為吡咯-魯米諾共聚物膜中的聚吡咯結構促進了膜中聚魯米諾結構的電子傳遞。同時，電聚合得到AM-MIP膜后，膜中的模板分子AM 可以與檢測底液中的溶解氧作用產生超氧陰離子自由基。超氧陰離子自由基與膜中的聚魯米諾結構的氧化中間態反應生成大量激發態中間體，從而增強了 ECL強度。當模板分子AM被洗脫掉后，脫除AM的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL強度明顯降低（圖3中曲線c)。重新結合有50μΜ AM后的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL強度又明顯增強（圖3中曲線d)。這些實驗結果不僅表明步驟(4)中脫除AM的氨芐西林分子印跡傳感器對模板分子AM具有識別作用，而且AM-MIP膜中所結合的AM能夠增強聚魯米諾結構的ECL強度，因此本發明提供的氨芐西林分子印跡傳感器為Turn-on型固相分子印跡電化學傳感器，并可以利用重結合AM后的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL強度增強值對被測溶液中的AM含量進行定量測定。
[0096] 實施例5
[0097] 應用實施例1制備的氨芐西林分子印跡傳感器檢測未知濃度的氨芐西林溶液中的氨芐西林含量，步驟如下：
[0098] (a)以蒸餾水為溶劑分別配制氨芐西林濃度為0.07、0.5、0.7、3、10、20、50μΜ的氨芐西林標準品溶液;并配制不含氨芐西林的空白樣品溶液；
[0099] (b)將經過洗脫氨芐西林的氨芐西林分子印跡傳感器分別在所配制的氨芐西林標準品溶液中及空白樣品溶液中浸泡15分鐘，然后置于檢測底液(pH 8.0的磷酸緩沖溶液）中進行ECL測定;獲得結合了各濃度氨芐西林的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL曲線，如圖4A 所示；圖4A中各曲線的最高點為重結合各濃度氨芐西林的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL 強度，重結合0、0.07、0.5、0.7、3、10、20、50μM的氨芐西林的ECL強度分別為106(即空白樣品溶液對應的ECL強度為106)、131、146、159、201、269、360、651;其中，以浸泡過氨芐西林標準品溶液或空白樣品溶液的氨芐西林分子印跡傳感器作為工作電極，以Ag/AgCl為參比電極， Pt為對電極，組成三電極體系；
[0100] (C)根據公式 AECLi = ECLi-ECL〇，l < i <n,計算0.07、0.5、0.7、3、10、20、5(^]\1的氨芐西林標準品溶液的ECL強度差值Δ ECL，分別為25、40、53、95、163、254、545;
[0101] (d)以所獲得的各濃度標準品溶液的ECL強度差值Δ ECL為縱坐標，以氨芐西林標準品溶液濃度為橫坐標建立氨芐西林分子印跡傳感器的檢測線性方程；A ECL = 46.23+ 10.1以以]\〇& = 0.995)(該方程對應的標準曲線如圖48所示），線性范圍為0.07~5(^]\1，檢測靈敏度為336.67μΜ-Vm- 2，最低檢測限(L0D)為18nM。
[0102] (e)配制某一未知濃度氨芐西林溶液，將實施例1制得的氯霉素分子印跡電化學發光傳感器浸泡在此氨芐西林溶液，浸泡時間為15分鐘。執行步驟(b)及(c)，得到未知濃度氨芐西林對應的強度差值126,根據步驟(d)中的線性方程即可得到得出氨芐西林溶液的物質的量濃度為7.9μΜ。
[0103] 實施例6
[0104] 確定1，Γ-二茂鐵雙羧酸對氨芐西林檢測的放大作用
[0105] 將洗脫了氨芐西林的氨芐西林分子印跡傳感器分別在不包含Fc(C00H)2的pH 8.0 磷酸緩沖液中以及在包含2mM Fc (C00H)2的pH 8.0磷酸緩沖液中進行ECL檢測，將重新結合有0.7μΜ氨芐西林的氨芐西林分子印跡傳感器分別在不包含Fc(C00H) 2的pH 8.0磷酸緩沖液中以及在包含2mM Fc(C00H)2的pH 8.0磷酸緩沖液中進行ECL檢測;檢測結果如圖5所示；
[0106] 從圖5中可以看出，在檢測底液(pH 8.0磷酸緩沖液）中加入2mM Fc(⑶0H)2后，洗脫后的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL強度增強了近3倍，這是因為Fc(C00H) 2的電化學氧化產物可以催化聚魯米諾結構在金電極表面的電化學氧化過程，從而增加聚魯米諾結構氧化中間體的含量，有效增強其ECL響應。Fc(C00H) 2對聚魯米諾結構的ECL信號放大作用可用于提高該傳感器對AM的檢測靈敏度。例如，將重結合0.7μΜ AM后的氨芐西林分子印跡傳感器置于含有2mM Fc(⑶0H)2的pH 8.0磷酸緩沖液中進行ECL測定（圖3中曲線d)，得到的ECL 強度是沒有加Fc(C00H)2的ECL強度（圖3中曲線c)測定結果的近3倍。由此可知，利用Fc (C00H) 2對聚魯米諾結構的電催化作用可以成倍放大AM重結合前后氨芐西林分子印跡傳感器的ECL強度變化，有望提高傳感器的檢測靈敏度。
[0107] 實施例7
[0108] 確定檢測底液中含有Fc (C00H) 2作為電活性探針的檢測標準曲線
[0109] 采用與實施5相同的步驟確定氨芐西林分子印跡傳感器的檢測標準曲線，與實施5 的區別在于，本實施例配制的氨芐西林標準品溶液濃度分別為0.7、9、20、500及700nM;并且檢測底液為包含2mM Fc(⑶0H)2的pH 8.0磷酸緩沖液;所獲得的結合了不同濃度氨芐西林的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL強度曲線圖6所示；以氨芐西林標準品溶液濃度為橫坐標建立氨芐西林分子印跡傳感器的的檢測線性方程；Δ ECL = 30.93+0.31C(nM) (r = 0.996)，線性范圍為0.7~700nM，檢測靈敏度為10.33mM-Vm-2，L0D為0.58nM。可見，在Fc(C00H) 2的電催化放大作用下，該傳感器的檢測靈敏度放大為無Fc(C00H)2時(實施例5)的31倍，L0D比無 Fc (C00H) 2時(實施例5)的L0D低了兩個數量級。
[0110] 以上對本發明所提供的種氨芐西林分子印跡傳感器的制備方法及應用進行了詳細介紹。本文中應用了具體實施例對本發明的原理及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發明的方法及其中心思想。應當指出，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發明權利要求的保護。
【主權項】
1. 一種氨芐西林分子印跡傳感器的制備方法，其特征在于，包括： (1) 對惰性電極預處理； (2) 將共聚合單體吡咯、魯米諾及模板分子氨芐西林溶于pH值為4~7的緩沖溶液中，得到聚合液，其中，共聚合單體吡咯與魯米諾的物質的量的比為（1~8): 1;吡咯與氨芐西林的物質的量的比為1:(1~6); (3) 將預處理后的惰性電極置于聚合液中采用循環伏安法進行電聚合，在所述惰性電極表面得到結合有氨芐西林的吡咯-魯米諾共聚物膜； (4) 用洗脫劑去除共聚物膜所結合的氨芐西林，得到氨芐西林分子印跡傳感器。2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述惰性電極選自于金電極、鉑電極、玻碳電極或石墨電極，優選為金電極。3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述緩沖溶液為磷酸緩沖溶液，pH值為6。4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用循環伏安法進行電聚合的聚合條件包括:掃描電位為〇~IV;掃速為30~80mV 中的任一值，循環掃描圈數為3~10圈中的任一值。5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脫劑為9: l(v/v)的甲醇-乙酸溶液、 0.01M的NaOH溶液或0.01M的HC1溶液。6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，吡咯在緩沖溶液中的濃度為（10~30 )mM。7. 由權利要求1~6中任一項所述的方法制備的氨節西林分子印跡傳感器。8. 權利要求7所述的氨節西林分子印跡傳感器在檢測氨節西林分子中的應用。9. 如權利要求8所述的應用，其特征在于，所述檢測氨芐西林分子的步驟包括： (a) 配制不同已知濃度(^~(^的氨芐西林標準品溶液及不含氨芐西林的空白樣品溶液； (b) 將氨芐西林分子印跡傳感器分別在所配制的氨芐西林標準品溶液中及空白樣品溶液中浸泡指定時間后，分別置于檢測底液中測定結合了不同濃度氨芐西林的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL強度； (c) 計算&~(：η濃度氨芐西林標準品溶液對應的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL強度差值AECLi-AECU，其中，AECLFECLi-ECLhl < i <n，ECL〇為空白樣品溶液對應的氨芐西林分子印跡傳感器的ECL強度； (d) 以氨芐西林濃度^~匕為橫坐標或縱坐標，以強度差值Δ ECLi為縱坐標或橫坐標建立標準曲線，得到氨芐西林濃度與強度差值AECU的線性方程； (e) 以未知濃度的氨芐西林溶液代替氨芐西林標準品溶液，執行步驟(b)及(c);確定未知濃度的氨芐西林溶液所對應的ECL強度差值;根據步驟(d)中的線性方程即可得到未知濃度的氨芐西林溶液中的氨芐西林濃度。10. 如權利要求9所述的應用，其特征在于，步驟(b)中的檢測底液中含有電活性物質1， Γ-二茂鐵雙羧酸。
【文檔編號】G01N33/15GK105866211SQ201610371665
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月30日
【發明人】劉紅云, 廉文靜
【申請人】北京師范大學, 北京師大科技園科技發展有限責任公司

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