一種化學發光免疫分析儀試劑盒的制備
【專利摘要】本發明公開了一種化學發光免疫分析儀試劑盒的制備，所述重氮化原料的質量組成，所述形成CLEN?BSA和HRP?CLEN后進行偶聯物的鑒定，可以確定并提高合成產物的偶聯比，所述中試劑盒組裝后按規定方法抽樣檢測，可以確保生產的試劑盒的有消息，該化學發光免疫分析儀試劑盒，以CLEN為目標檢測物標記HRP并配以魯米諾作為發光底物，減少了基質效應的影響同時極大的提高了線性檢測范圍及靈敏度，市場潛力巨大，前景廣闊。
【專利說明】
一種化學發光免疫分析儀試劑盒的制備
技術領域
[0001] 本發明屬于化學發光免疫研發和應用領域，更具體地說，本發明涉及一種化學發 光免疫分析儀試劑盒的制備。
【背景技術】
[0002] 化學發光免疫分析技術是將具有高靈敏度的化學發光測定技術與高特異性的免 疫反應相結合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測分析 技術。是繼放免分析、酶免分析、熒光免疫分析和時間分辨熒光免疫分析之后發展起來的一 項最新免疫測定技術。作為新型疾病檢測診斷方法，化學發光診斷試劑是多種相互關聯的 診斷試劑的集合，通過化學發光免疫試劑對血清進行快速檢測，在幾秒鐘內即能得到準確 的檢測結果。與目前常用的放射性免疫分析法和酶聯免疫分析法相比，其靈敏度高，檢測時 間短，測量線性范圍寬，穩定性、安全性好，試劑中不含放射性和致畸物質，對人體無害。該 試劑盒可廣泛應用于傳染性疾病、肥胖及相關疾病、內分泌系統、遺傳病、腫瘤的早期診斷， 同時亦可應用于環保監測、刑事偵查、海關檢查、動植物檢驗檢疫等眾多領域。
【發明內容】
[0003] 本發明所要解決的問題是提供一種化學發光免疫分析儀試劑盒的制備。
[0004] 為了實現上述目的，本發明采取的技術方案為：
[0005] -種化學發光免疫分析儀試劑盒的制備，包括如下步驟：
[0006] (1)鹽酸克倫特羅(CLEN)的重氮化
[0007] 取鹽酸克倫特羅，加入lmol · I^HCL和蒸餾水于反應器中，同時將pH調節至0.4-0.6,然后，往其中連續緩慢加入0.2mol · L-Ma N02,并攪拌50-70min;
[0008] (2)鹽酸克倫特羅(CLEN)與牛血清白蛋白（BSA)的偶聯
[0009] 將牛血清白蛋白溶于磷酸鹽緩沖液中，邊攪拌邊將重氮化的鹽酸克倫特羅緩慢加 入其中，形成反應體系，加入過程中用lmol^I^Na 0H調節p Η值，滴加完成后，將反應體系 置于4°C下，調節轉速進行反應，形成反應液，反應結束后反應液于4°C下，O.Olmol Η =7的磷酸鹽緩沖液中透析2-4d，轉入容器中靜止3-5h后離心，形成CLEN-BSA;
[0010] (3)鹽酸克倫特羅(CLEN)與辣根過氧化物酶(HRP)的偶聯
[0011] 將辣根過氧化物酶溶于磷酸鹽緩沖液中，邊攪拌邊將重氮化的鹽酸克倫特羅緩慢 加入其中，形成反應體系，加入過程中用lmol ?I/Ma 0H調節p Η值，滴加完成后，將反應體 系置于4°C下，調節轉速進行反應，形成反應液，反應結束后反應液于4°C下，O.Olmol · I/1? Η=7的磷酸鹽緩沖液中透析2-4d，轉入容器中靜止3-5h后離心，形成HRP-CLEN;
[0012] (4)多克隆抗體制備
[0013] 將CLEN-BSA與弗氏佐劑混合后，以皮下多位點注射方式免疫雌性新西蘭兔，接著 取全血并分離血清，用正辛酸-飽和硫酸銨法提取抗體，然后將抗體加甘油于-20°C保存備 用；
[0014] (5)CLEN標準溶液的制備
[0015] 確定抗體和HRP-CLEN的最佳稀釋度，配制40.000ng/m L CLEN標準溶液；
[0016] (6)試劑盒組裝
[0017] 將CLEN標準溶液(40yg/m L)、HRP-CLEN、底物液、終止液、濃縮洗滌液和多克隆抗 體加入到抗體包被的發光板條中，即得到成品。
[0018] 優選的，所述重氮化原料的質量組成包括鹽酸克倫特羅50-70份、HCL10-30份、蒸 餾水5-15份和恥從)2〇.6-〇.8份。
[0019] 優選的，所述步驟(2)和(3)中形成CLEN-BSA和HRP-CLEN后進行偶聯物的鑒定。
[0020] 優選的，所述偶聯物的鑒定的方法為配置CLEN溶液(0.25mg · m Γ1)和載體蛋白 溶液(〇.5mg · m Γυ，分別對CL、載體蛋白和偶聯物溶液進行紫外掃描。
[0021] 優選的，所述步驟(6)中試劑盒組裝后按規定方法抽樣檢測，合格后出廠。
[0022]優選的，所述檢驗的對象為檢測線性、靈敏度和特異性。
[0023]有益效果:本發明提供了 一種化學發光免疫分析儀試劑盒的制備，所述重氮化原 料的質量組成，所述形成CLEN-BSA和HRP-CLEN后進行偶聯物的鑒定，可以確定并提高合成 產物的偶聯比，所述中試劑盒組裝后按規定方法抽樣檢測，可以確保生產的試劑盒的有消 息，該化學發光免疫分析儀試劑盒，以CLEN為目標檢測物標記HRP并配以魯米諾作為發光底 物，減少了基質效應的影響同時極大的提高了線性檢測范圍及靈敏度，市場潛力巨大，前景 廣闊。
【具體實施方式】 [0024] 實施例1:
[0025] -種化學發光免疫分析儀試劑盒的制備，包括如下步驟：
[0026] (1)鹽酸克倫特羅(CLEN)的重氮化
[0027] 取鹽酸克倫特羅，加入lmol · I^HCL和蒸餾水于反應器中，同時將pH調節至0.4,然 后，往其中連續緩慢加入〇.2mol · I^Na N02,并攪拌50min，所述重氮化原料的質量組成包 括鹽酸克倫特羅50份、HCL10份、蒸餾水5份和NaN020.6份；
[0028] (2)鹽酸克倫特羅(CLEN)與牛血清白蛋白（BSA)的偶聯
[0029] 將牛血清白蛋白溶于磷酸鹽緩沖液中，邊攪拌邊將重氮化的鹽酸克倫特羅緩慢加 入其中，形成反應體系，加入過程中用lmol^I^Na 0H調節p Η值，滴加完成后，將反應體系 置于4°C下，調節轉速進行反應，形成反應液，反應結束后反應液于4°C下，O.Olmol Η =7的磷酸鹽緩沖液中透析2d，轉入容器中靜止3h后離心，形成CLEN-BSA，形成CLEN-BSA后 進行偶聯物的鑒定，所述偶聯物的鑒定的方法為配置CLEN溶液(0.25mg · m Γ1)和載體蛋白 溶液(〇.5mg · m L-1〉，分別對CL、載體蛋白和CLEN-BSA溶液進行紫外掃描；
[0030] (3)鹽酸克倫特羅(CLEN)與辣根過氧化物酶(HRP)的偶聯
[0031 ]將辣根過氧化物酶溶于磷酸鹽緩沖液中，邊攪拌邊將重氮化的鹽酸克倫特羅緩慢 加入其中，形成反應體系，加入過程中用lmol ?I/Wa 0H調節p Η值，滴加完成后，將反應體 系置于4°C下，調節轉速進行反應，形成反應液，反應結束后反應液于4°C下，O.Olmol · I/1? H=7的磷酸鹽緩沖液中透析2d，轉入容器中靜止3h后離心，形成HRP-CLEN，形成HRP-CLEN后 進行偶聯物的鑒定，所述偶聯物的鑒定的方法為配置CLEN溶液(0.25mg · m Γ1)和載體蛋白 溶液(〇.5mg · m L-υ，分別對CL、載體蛋白和HRP-CLEN溶液進行紫外掃描；
[0032] (4)多克隆抗體制備
[0033]將CLEN-BSA與弗氏佐劑混合后，以皮下多位點注射方式免疫雌性新西蘭兔，接著 取全血并分離血清，用正辛酸-飽和硫酸銨法提取抗體，然后將抗體加甘油于-20°C保存備 用；
[0034] (5)CLEN標準溶液的制備
[0035] 確定抗體和HRP-CLEN的最佳稀釋度，配制40.000ng/m L CLEN標準溶液；
[0036] (6)試劑盒組裝
[0037] 將CLEN標準溶液(40yg/m L)、HRP-CLEN、底物液、終止液、濃縮洗滌液和多克隆抗 體加入到抗體包被的發光板條中，即得到成品，試劑盒組裝后按規定方法抽樣檢測，合格后 出廠，所述檢驗的對象為檢測線性、靈敏度和特異性。
[0038] 實施例2:
[0039] -種化學發光免疫分析儀試劑盒的制備，包括如下步驟：
[0040] (1)鹽酸克倫特羅(CLEN)的重氮化
[00411 取鹽酸克倫特羅，加入lmol · I^HCL和蒸餾水于反應器中，同時將pH調節至0.5,然 后，往其中連續緩慢加入0.2mol · I^Na N02,并攪拌60min，所述重氮化原料的質量組成包 括鹽酸克倫特羅60份、HCL20份、蒸餾水10份和Na N020.7份；
[0042] (2)鹽酸克倫特羅(CLEN)與牛血清白蛋白（BSA)的偶聯
[0043] 將牛血清白蛋白溶于磷酸鹽緩沖液中，邊攪拌邊將重氮化的鹽酸克倫特羅緩慢加 入其中，形成反應體系，加入過程中用lmol^I^Na 0H調節p Η值，滴加完成后，將反應體系 置于4°C下，調節轉速進行反應，形成反應液，反應結束后反應液于4°C下，O.Olmol Η =7的磷酸鹽緩沖液中透析3d，轉入容器中靜止4h后離心，形成CLEN-BSA，形成CLEN-BSA后 進行偶聯物的鑒定，所述偶聯物的鑒定的方法為配置CLEN溶液(0.25mg · m Γ1)和載體蛋白 溶液(〇.5mg · m L-分別對CL、載體蛋白和CLEN-BSA溶液進行紫外掃描；
[0044] (3)鹽酸克倫特羅(CLEN)與辣根過氧化物酶(HRP)的偶聯
[0045] 將辣根過氧化物酶溶于磷酸鹽緩沖液中，邊攪拌邊將重氮化的鹽酸克倫特羅緩慢 加入其中，形成反應體系，加入過程中用lmol ?I/Wa 0H調節p Η值，滴加完成后，將反應體 系置于4°C下，調節轉速進行反應，形成反應液，反應結束后反應液于4°C下，O.Olmol · I/1? H=7的磷酸鹽緩沖液中透析3d，轉入容器中靜止4h后離心，形成HRP-CLEN，形成HRP-CLEN后 進行偶聯物的鑒定，所述偶聯物的鑒定的方法為配置CLEN溶液(0.25mg · m Γ1)和載體蛋白 溶液(〇.5mg · m L-1〉，分別對CL、載體蛋白和HRP-CLEN溶液進行紫外掃描；
[0046] (4)多克隆抗體制備
[0047]將CLEN-BSA與弗氏佐劑混合后，以皮下多位點注射方式免疫雌性新西蘭兔，接著 取全血并分離血清，用正辛酸-飽和硫酸銨法提取抗體，然后將抗體加甘油于-20°C保存備 用；
[0048] (5)CLEN標準溶液的制備
[0049] 確定抗體和HRP-CLEN的最佳稀釋度，配制40.000ng/m L CLEN標準溶液；
[0050] (6)試劑盒組裝
[0051] 將CLEN標準溶液(40yg/m L)、HRP-CLEN、底物液、終止液、濃縮洗滌液和多克隆抗 體加入到抗體包被的發光板條中，即得到成品，試劑盒組裝后按規定方法抽樣檢測，合格后 出廠，所述檢驗的對象為檢測線性、靈敏度和特異性。
[0052] 實施例3:
[0053] 一種化學發光免疫分析儀試劑盒的制備，包括如下步驟：
[0054] (1)鹽酸克倫特羅(CLEN)的重氮化
[0055] 取鹽酸克倫特羅，加入lmol · I^HCL和蒸餾水于反應器中，同時將pH調節至0.6,然 后，往其中連續緩慢加入〇.2mol · I^Na N02,并攪拌70min，所述重氮化原料的質量組成包 括鹽酸克倫特羅70份、HCL30份、蒸餾水15份和Na N020.8份；
[0056] (2)鹽酸克倫特羅(CLEN)與牛血清白蛋白（BSA)的偶聯
[0057] 將牛血清白蛋白溶于磷酸鹽緩沖液中，邊攪拌邊將重氮化的鹽酸克倫特羅緩慢加 入其中，形成反應體系，加入過程中用lmol^I^Na 0H調節p Η值，滴加完成后，將反應體系 置于4°C下，調節轉速進行反應，形成反應液，反應結束后反應液于4°C下，O.Olmol Η =7的磷酸鹽緩沖液中透析4d，轉入容器中靜止5h后離心，形成CLEN-BSA，形成CLEN-BSA后 進行偶聯物的鑒定，所述偶聯物的鑒定的方法為配置CLEN溶液(0.25mg · m Γ1)和載體蛋白 溶液(〇.5mg · m L-υ，分別對CL、載體蛋白和CLEN-BSA溶液進行紫外掃描；
[0058] (3)鹽酸克倫特羅(CLEN)與辣根過氧化物酶(HRP)的偶聯
[0059] 將辣根過氧化物酶溶于磷酸鹽緩沖液中，邊攪拌邊將重氮化的鹽酸克倫特羅緩慢 加入其中，形成反應體系，加入過程中用lmol ?I/Wa 0H調節p Η值，滴加完成后，將反應體 系置于4°C下，調節轉速進行反應，形成反應液，反應結束后反應液于4°C下，O.Olmol · I/1? H=7的磷酸鹽緩沖液中透析4d，轉入容器中靜止5h后離心，形成HRP-CLEN，形成HRP-CLEN后 進行偶聯物的鑒定，所述偶聯物的鑒定的方法為配置CLEN溶液(0.25mg·!!! I/1)和載體蛋 白溶液(〇.5mg · m L-1〉，分別對CL、載體蛋白和HRP-CLEN溶液進行紫外掃描；
[0060] (4)多克隆抗體制備
[0061] 將CLEN-BSA與弗氏佐劑混合后，以皮下多位點注射方式免疫雌性新西蘭兔，接著 取全血并分離血清，用正辛酸-飽和硫酸銨法提取抗體，然后將抗體加甘油于-20°C保存備 用；
[0062] (5)CLEN標準溶液的制備
[0063] 確定抗體和HRP-CLEN的最佳稀釋度，配制40.000ng/m L CLEN標準溶液；
[0064] (6)試劑盒組裝
[0065] 將CLEN標準溶液(40yg/m L)、HRP-CLEN、底物液、終止液、濃縮洗滌液和多克隆抗 體加入到抗體包被的發光板條中，即得到成品，試劑盒組裝后按規定方法抽樣檢測，合格后 出廠，所述檢驗的對象為檢測線性、靈敏度和特異性。
[0066] 經過以上方法后，分別取出樣品，測量結果如下：
[0067]
[0068] 根據上述表格數據可以得出，當實施例2參數時制備后的化學發光免疫分析儀試 劑盒比現有技術制備后的化學發光免疫分析儀試劑盒的檢測限低，且靈敏度和精密度高， 此時更有利于化學發光免疫分析儀試劑盒的制備。
[0069] 本發明提供了一種化學發光免疫分析儀試劑盒的制備，所述重氮化原料的質量組 成，所述形成CLEN-BSA和HRP-CLEN后進行偶聯物的鑒定，可以確定并提高合成產物的偶聯 比，所述中試劑盒組裝后按規定方法抽樣檢測，可以確保生產的試劑盒的有消息，該化學 發光免疫分析儀試劑盒，以CLEN為目標檢測物標記HRP并配以魯米諾作為發光底物，減少了 基質效應的影響同時極大的提高了線性檢測范圍及靈敏度，市場潛力巨大，前景廣闊。
[0070] 以上所述僅為本發明的實施例，并非因此限制本發明的專利范圍，凡是利用本發 明說明書內容所作的等效結構或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關的技術領 域，均同理包括在本發明的專利保護范圍內。
【主權項】
1. 一種化學發光免疫分析儀試劑盒的制備，其特征在于，包括如下步驟： (1) 鹽酸克倫特羅(CLEN)的重氮化 取鹽酸克倫特羅，加入lmo 1 · I^HCL和蒸餾水于反應器中，同時將pH調節至0.4-0.6，然 后，往其中連續緩慢加入〇.2mol · L-Sa N02,并攪拌50-70min; (2) 鹽酸克倫特羅(CLEN)與牛血清白蛋白（BSA)的偶聯 將牛血清白蛋白溶于磷酸鹽緩沖液中，邊攪拌邊將重氮化的鹽酸克倫特羅緩慢加入其 中，形成反應體系，加入過程中用lmol ?I^Na 0H調節p Η值，滴加完成后，將反應體系置于4 °(：下，調節轉速進行反應，形成反應液，反應結束后反應液于4°C下，O.Olmol Η=7的 磷酸鹽緩沖液中透析2-4d，轉入容器中靜止3-5h后離心，形成CLEN-BSA; (3) 鹽酸克倫特羅(CLEN)與辣根過氧化物酶(HRP)的偶聯 將辣根過氧化物酶溶于磷酸鹽緩沖液中，邊攪拌邊將重氮化的鹽酸克倫特羅緩慢加入 其中，形成反應體系，加入過程中用lmol^I^Na 0H調節p Η值，滴加完成后，將反應體系置 于4°C下，調節轉速進行反應，形成反應液，反應結束后反應液于4°C下，O.Olmol · I/1? Η=7 的磷酸鹽緩沖液中透析2-4d，轉入容器中靜止3-5h后離心，形成HRP-CLEN; (4) 多克隆抗體制備 將CLEN-BSA與弗氏佐劑混合后，以皮下多位點注射方式免疫雌性新西蘭兔，接著取全 血并分離血清，用正辛酸-飽和硫酸銨法提取抗體，然后將抗體加甘油于-20°C保存備用； (5) CLEN標準溶液的制備 確定抗體和HRP-CLEN的最佳稀釋度，配制40.000ng/m L CLEN標準溶液； (6) 試劑盒組裝 將CLEN標準溶液(40yg/m L)、HRP-CLEN、底物液、終止液、濃縮洗滌液和多克隆抗體加 入到抗體包被的發光板條中，即得到成品。2. 按照權利要求1所述的一種化學發光免疫分析儀試劑盒的制備，其特征在于:所述步 驟（1)中，所述重氮化原料的質量組成包括鹽酸克倫特羅50-70份、HCL10-30份、蒸餾水5-15 份和Na Ν〇2〇·6-〇·8份。3. 按照權利要求1所述的一種化學發光免疫分析儀試劑盒的制備，其特征在于:所述步 驟(2)和(3)中形成CLEN-BSA和HRP-CLEN后進行偶聯物的鑒定。4. 按照權利要求3所述的一種化學發光免疫分析儀試劑盒的制備，其特征在于:所述偶 聯物的鑒定的方法為配置CLEN溶液(0.25mg · m L-4和載體蛋白溶液(0.5mg · m L-分別 對CL、載體蛋白和偶聯物溶液進行紫外掃描。5. 按照權利要求1所述的一種化學發光免疫分析儀試劑盒的制備，其特征在于:所述步 驟(6)中試劑盒組裝后按規定方法抽樣檢測，合格后出廠。6. 按照權利要求5所述的一種化學發光免疫分析儀試劑盒的制備，其特征在于:所述檢 驗的對象為檢測線性、靈敏度和特異性。
【文檔編號】G01N21/76GK105866106SQ201610443565
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月20日
【發明人】袁雪生, 張書勝
【申請人】袁氏(宿遷)生物技術有限公司