基于上轉換發光技術的聯合定量檢測uNGAL和uCr的裝置及其制備方法

基于上轉換發光技術的聯合定量檢測uNGAL和uCr的裝置及其制備方法
【專利摘要】一種基于上轉換發光技術(UPT)的聯合定量檢測疾病標志物尿中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(uNGAL)和尿液稀釋影響糾正因子尿肌酐(uCr)的免疫層析裝置及其制備方法，屬于免疫檢測技術領域。由樣品稀釋液凍干粉、NGAL和Cr標準品凍干粉、免疫層析試紙條組成；免疫層析試紙條由襯板、樣品墊或UCP結合墊、分析膜及吸收墊組成；分析膜上設有平行的兩個檢測線T1、T2和一個質控線C，兩個檢測線T1、T2分別包被抗NGAL抗體和抗Cr抗體，質控線包被抗UCP標記抗體來源動物免疫球蛋白的抗體，所述試紙條可使用UCP讀數儀定量uNGAL和uCr。本發明可聯合定量不同分子形式uNGAL和uCr，具有快速、簡便等優點。uNGAL經uCr糾正后可提高NGAL早期診斷腎損傷等疾病的能力，因此具有極大的科研和臨床應用價值。
【專利說明】
基于上轉換發光技術的聯合定量檢測uNGAL和uCr的裝置及其 制備方法
技術領域
[0001] 本發明屬于免疫學檢測技術領域，具體涉及基于上轉換發光技術(UPT)的聯合定 量檢測疾病生物標志物尿中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白（UNGAL)和尿液稀釋影響糾正因 子尿肌酐(uCr)的免疫層析裝置及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)又稱人中性粒細胞脂質運載蛋白（human neutrophil lipocalin，HNL)是 90年代初在中性粒細胞第二顆粒中發現的一種糖蛋白，屬脂質運載蛋白（Iipocalin)超家 族成員，和其他脂質運載蛋白具有相似空間結構（J. Biol. Chem. 1993,268:10425-10432; Scand · J · Cl in · Lab · Invest · 1994，54:365-376) C3NGAL以單體、同二聚體及與MMP9形成異二 聚體等多種分子形式存在，不同分子形式NGAL與不同的病理過程具有差異相關性。其中單 體NGAL與腎小管急性損傷有相對較高的相關性，而同二聚體NGAL能有效反映尿道感染和細 菌感染情況。除中性粒細胞能分泌NGAL外，在生理條件下NGAL在人多種組織有表達但表達 水平低；在病理條件下如炎癥、感染、腫瘤、缺血等，NGAL可在多種組織中上調表達 (Histochem.J.1999,31:433-441；Mol.Med.Rep.2012,6:716-722)〇
[0003] 近20多年來，NGAL作為急性細菌感染、腫瘤、腎功能損傷等疾病的標志物受到人們 的關注。特別是NGAL作為腎功能損傷的早期診斷生物標志物越來越受到人們重視。目前有 血清、血漿及尿NGAL用于腎功能損傷的早期診斷的報道。與臨床現在采用的血清肌酐（sCr) 相比，NGAL在早期診斷腎功能損傷時表現出優異性能。已報道NGAL在早期診斷因缺血 (J.Endourol. 2013,27:1510-1515)、抗腫瘤藥物順鉑(Am. J.Nephrol .2004,24:307-315)、 膿毒癥(BiomecLRes · Int · 2015，2009，186:48-51;中國實用醫藥2015，24:46-47)、心臟外科 手術(Lancet 2005,365:1231-1238;Clin.Chim.Acta.2009,403:121-125)等引起的急性腎 功能損傷(AKI)時，比sCr提前1到2天預判患者是否將發生AKI，這為臨床介入治療AKI爭取 到了寶貴時間。
[0004] 與血清和血漿NGAL相比，尿NGAL(uNGAL)用作診斷AKI的生物標志物尤其吸引人們 的注意力，主要原因有以下三點:第一，動物模型和體外細胞培養研究結果表明急性腎損傷 時腎小管上皮細胞上調表達NGAL而尿液又直接與病變部位接觸，因此uNGAL能直接迅速反 映腎損傷情況;第二，尿液取樣方式為非侵襲性，容易得到患者的配合，是最容易獲得的體 液樣本;第三，目前尿液檢查是判斷腎臟疾病的一種最常見的必須的檢查項目。另一方面， 雖然uNGAL作為腎功能生物標志物有其自身獨特的優點，但是尿液中NGAL的濃度受患者飲 水、靜脈點滴注射藥物等因素導致的尿液稀釋影響，從而不能十分有效的反映真實的尿 NGAL濃度的動態變化情況，因此需要對因尿液稀釋而導致的影響進行糾正。目前在臨床上， uCr水平用于糾正尿液稀釋對尿中檢測物濃度帶來的影響由來已久。肌酐(Cr)是肌肉里磷 酸肌酐的代謝產物，機體通常以恒定的速率產生;此外，肌酐是小分子物質，可自由通過腎 小球濾過且在腎小管內很少或不被重吸收。因此，機體每日產生的肌酐幾乎全部隨尿排出， uCr的日排出量很穩定，基本不受食物蛋白質含量和尿量的影響。所以可以通過測定uCr水 平來糾正尿液因稀釋對uNGAL濃度動態變化的影響。
[0005] 目前實驗室研究和臨床應用雖然有單獨分別測試NGAL和uCr的方法，但至今沒有 在同一樣本同時聯合檢測這兩種標志物的方法和裝置的報道。而將來NGAL有可能成為AKI 臨床即時就地檢驗(Point of Care Testing，P0CT)項目。因此，設計和開發uNGAL和uCr聯 合定量方法和裝備具有巨大的實驗室科學研究和將來臨床應用需求。
[0006] NGAL定量方法有RIA(國際專利W0/1995/029404A1 和中國ZL 200980155194等）、 ELISA(歐洲專利EP 2225268和中國專利ZL200980155194等）、Western-blotting、膠乳免疫 比濁法（中國專利ZL 201410431 182 )、化學發光免疫分析法（中國專利申請號 201510184818)等。以上各種NGAL定量方法有各自優點和用途，但也存在一些缺點。對NGAL 檢測需求來講，最顯著的缺點是檢測周期長，很難滿足用于POCT檢測項目要求。免疫層析技 術是一種快速診斷方法，常用于POCT項目。近年來發展的NGAL免疫層析技術（中國專利 21^201220323587、21^01420423962、21^201220392399、21^01220323586和21^201220497401) 可以縮短檢測時間。以上公開的NGAL免疫層析技術雖然具有操作方便和檢測快速等優點， 但各種報告分子自身固有的缺點限制了相關產品的性能。如熒光免疫層析因熒光染料易發 生淬滅而導致產品穩定性差；熒光乳膠顆粒因其采用的熒光染料系物理摻雜而成，容易發 生泄漏，另外該類材料易發生非特異性吸附從而導致信噪比低問題;免疫膠體金技術采用 物理吸附的方法使標記物和報告分子結合，因物理吸附力弱標記物容易從報告分子金納米 顆粒表面脫落而影響檢測性能。近年來，以稀土金屬元素摻雜于晶體的晶格中而構成的上 轉換發光材料(up-converting phosphor，UCP)為報告分子的免疫層析上轉換發光技術 (up-converting phosphor technology，UPT)是目前臨床POCT檢測領域的一個研究開發重 點和熱點。UCP由主基質（host matrix)、吸收子(absorber)和發射子（emitter)三部分組 成，具有上轉發光現象即在紅外光激發下發射可見光。UCP產生的信號可以由UCP讀數儀讀 取。由于該種材料為人工合成且在自然界和體內并沒有類似物質存在，因此無背景干擾問 題;此外，UCP還具有穩定性好、無悴滅、環境友好和生物相容性好等優異性能，該材料作為 示蹤劑已應用于多種POCT檢測系統中。中國專利(ZL201220497401)公開了一種NGAL檢測的 上轉發光快速定量裝置，該技術部分克服了目前NGAL檢測技術的不足，但是該技術并沒有 考慮因尿液稀釋而影響NGAL定量從而影響NGAL診斷腎功能損傷能力這一事實;此外該公開 的技術并沒有考慮不同分子形式NGAL在診斷疾病時臨床表現的差異。因此ZL201220497401 只是一種測定NGAL濃度的方法，并不能確定其測定的uNGAL是否真實反映 uNGAL動態變化情 況和不能區分測定不同分子形式的NGAL，從而限制了 uNGAL作為腎功能損傷標志物的能力 進而限制了該方法未來的臨床應用。
[0007] uCr定量方法主要有基于肌酐脫亞胺酶和肌酐酶的酶法、基于肌酐與苦味酸鹽作 用生成黃紅色的苦味酸肌酐復合物的化學測定法(JafTe法)和基于肌酐在弱酸性環境中帶 正電荷可通過陽離子交換層析柱分離的高效液相層析法等。酶法雖然具有特異性強靈敏度 高等優點，但酶的活性受很多因素影響從而影響該方法的穩定，而且成本比其他方法高。化 學測定法成本低廉，操作簡便，是目前國內外測定肌酐最常用的方法之一。由于維生素 C、一 些抗生素如青霉素、丙酮、乙酰乙酸、及高濃度葡萄糖等物質也能與堿性苦味酸反應生成紅 色產物，因此該方法的特異性不高。高效液相層析法測定uCr的精密度高、特異性好，但該法 對儀器設備要求高且操作復雜不適于大批量臨床標本分析。目前肌酐的酶法和化學法能滿 足臨床單獨對肌酐的測定，另外肌酐是小分子化合物，制備抗體比較困難;因此目前人們缺 乏開發基于抗原抗體反應的肌酐的免疫學測定方法和相應裝備的動力。隨著抗體制備技術 進步和發展，將小分子半抗原Cr與載體物質如血清白蛋白、卵清蛋白、匙孔藍蛋白、羧甲基 纖維素及多聚賴氨酸等載體分子偶聯構成完成抗原免疫動物獲得相應抗Cr抗體已成現實。 由于免疫學檢測技術具有特異性強、種類多等優點，建立和開發Cr免疫檢測技術和裝備是 未來該領域研究和開發的一個熱點。但至今仍沒有與本發明相關的技術方案公開。

【發明內容】

[0008]為了克服因尿液稀釋導致的對uNGAL濃度動態變化的影響以及特異性檢測不同分 子形式uNGAL的困難，本發明設計并開發出基于上轉換發光技術的聯合定量檢測uNGAL和 uCr的裝置及其制備方法，其中uCr用于糾正尿液稀釋對uNGAL濃度的影響。本發明可在同一 樣本同步聯合測定uNGAL和uCr的濃度，此外還可以定量不同分子形式uNGAL，具有樣品前處 理簡單、樣品用量少、檢測過程方便和快速、靈敏度和特異性高等優點。在腎功能損傷及其 他疾病如急性細菌感染等早期診斷實驗室研究和臨床檢驗領域有極大應用潛力。
[0009 ]為了實現上述目標，本發明采取如下技術方案：
[0010] 基于上轉換發光技術的聯合定量檢測uNGAL和uCr裝置，由樣品稀釋液凍干粉、 NGAL和Cr標準品凍干粉、免疫層析試紙條組成，其中免疫層析試紙條由襯板、樣品墊或UCP 結合墊、含兩條檢測線和一條質控線的分析膜和吸收墊組成。所述襯板用于支撐樣品墊或 UCP結合墊、分析膜和吸收墊的組裝，所述UCP結合墊用于結合UCP標記抗NGAL體和UCP標記 Cr，所述分析膜用于檢測線和質控線的設置從而實現NGAL和Cr的定量及免疫層析試紙條的 質控，所述吸收墊用于收集分析后的樣品溶液。1)所述樣品稀釋液凍干粉
[0011] 制備方法如下：將20mL、pH = 7.2~7.5,含 150~250mmol/L NaCl、0.25~0.5% (vol/vol )Tween_20、0.5% ~2%(wt/vol )BSA 或 2.5% ~5%(wt/vol)脫脂奶粉的 50 ~ lOOmmol/L HEPES緩沖液經機械或磁力攪拌充分后，采用0 · 22μπι或0 · 45μπι濾器進行過濾除 菌和除去不溶性雜質，經凍干后室溫保存。
[0012] 樣品稀釋液凍干粉使用前加入20mL去離子水充分溶解后獲得樣品稀釋液。
[0013 ] 2)所述NGAL和Cr標準品凍干粉共4套
[0014] a)標準品A:是用于單體uNGAL和uCr測定的標準品，每管含60ng單體NGAL和6μL?〇1 Cr;制備方法是將60ng單體NGAL和6μηιο1 Cr溶于300yL、pH = 7 · 4且含5~10%海藻糖(界1:/ V01)的I3BS溶液中得到的含200ng/mL單體NGAL和20mmo I/L Cr的溶液，過濾除菌后采用常規 方法凍干后室溫保存。
[0015] b)標準品B:用于同二聚體uNGAL和uCr測定的標準品，每管含60ng同二聚體NGAL和 6ymol Cr;制備方法是將60ng同二聚體NGAL和6μπιο1 Cr溶于300yL、pH=7.4且含5~10%海 藻糖(wt/vol)的I3BS溶液得到的含200ng/mL同二聚體NGAL和20mmol/L Cr的溶液，過濾除菌 后采用常規方法凍干后室溫保存。
[0016] c)標準品C:用于異二聚uNGAL和uCr測定的標準品，每管含60ng異二聚體NGAL和6μ molCr;制備方法是將60ng異二聚體NGAL和6μπιο1 Cr溶于300yL、pH = 7.4且含5~10%海藻 糖(wt/vol)的I3BS溶液得到的含200ng/mL異二聚體NGAL和20mmol/L Cr的溶液，過濾除菌后 采用常規方法凍干后室溫保存。
[0017] d)標準品D:用于三種分子形式uNGAL和uCr測定的標準品，每管含60ng NGAL(其中 單體NGAL、同二聚體NGAL及異二聚體NGAL各占40 %、40 %和20 % )和6μπιο1 Cr;制備方法是 將24ng單體NGAL、24ng同二聚體NGAL、12ng異二聚體NGAL和6ymol Cr溶于300yL、pH=7.4且 含5~10 %海藻糖(wt/vol)的I3BS溶液得到的含200ng/mL NGAL(其中單體NGAL、同二聚體 NGAL及異二聚體NGAL各占40%、40%和20%)和20mmoI/L Cr的溶液，過濾除菌后采用常規 方法凍干后室溫保存。
[0018] 以上標準品使用前加入去離子水300yL混勻制備成標準品工作液。根據實驗室研 究和臨床研究的不同目的選擇使用以上4套標準品中的一套或多套。使用時將以上標準品 工作液用樣品稀釋液進行2倍稀釋法進行稀釋，用于標準曲線的制定。
[0019] NGAL和Cr標準品采用本領域常規技術制備和/或通過商業途徑獲得。單體NGAL標 準品利用原核表達載體和真核表達載體在相應宿主細胞表達純化獲得或為商品化的NGAL (Biochem.Biophys .Res.Commun · 1994，202:1468-1475;Abcam的ab 188461)。同二聚體NGAL 和異二聚體NGAL從人血液中分離獲得，具體是將血液血沉棕黃層自然沉降去除紅細胞后獲 得粒細胞，粒細胞經氮氣空化破碎獲得粒細胞顆粒，然后酸裂解顆粒后進行分離純化 (Scand .J. Clin .Lab .Invest · 1994,54:365-376) <Xr(CAS 號 60-27-5)為商品化產品（如 Sigma公司的C4255或其他公司類似商品），純度應大于等于98 %。
[0020] 3)所述免疫層析試紙條的報告分子為UCP，UCP粒徑為200~600nm，UCP分別標記在 抗NGAL或標記在Cr上。
[0021] UCP標記抗NGAL包括UCP標記抗單體NGAL抗體、UCP標記抗同二聚體NGAL抗體、UCP 標記抗MMP-9抗體或UCP標記抗上述三種分子形式NGAL抗體。
[0022] 上述UCP標記抗NGAL或標記Cr通過共價鍵偶聯實現，偶聯方法為常規的已公開的 技術。UCP與抗體分子通過本領域常規的偶聯方式形成UCP標記抗體(Anal .Biochem. 2001， 293:307-318; J · Clin .Micro · 2008，46:171-187) WCP與Cr分子通過本領域常規的偶聯方式 形成UCP標記Cr分子，如先將UCP進行3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(APTMS)修飾然后采用雙功 能連接分子戊二醛做交聯劑實現Cr與UCP共價結合。
[0023] 將 UCP 標記抗 NGAL 抗體和 UCP 標記 Cr 溶于含有 0.05%(vol/vol)Triton-100、0.1% (wt/vol )NaN3、pH = 8.0的50mmol/L甘氨酸緩沖液中，UCP標記抗NGAL的濃度為lmg/mL，UCP 標記Cr的濃度為10mol/L。
[0024] 4)所述免疫層析試紙條分A和B兩類，每類數量根據實際需求可設定不同規格。
[0025] a)A類免疫層析試紙條：由襯板、樣品墊、分析膜及吸收墊組成，進一步可以由塑料 外殼封裝。A類免疫層析試紙條額外配備UCP標記抗NGAL抗體溶液和UCP標記Cr溶液組成的 混合溶液(每100個A類免疫層析試紙條配備IOyL的UCP標記抗NGAL抗體溶液和UCP標記Cr溶 液組成的混合溶液），使用前將上述混合溶液用樣品稀釋液稀釋200~500倍。
[0026] A類免疫層析試紙條的使用方法如下:首先將標準品工作液用樣品稀釋液進行2倍 梯度稀釋法進行稀釋，獲得標準品濃度梯度溶液;接著將尿液樣品用樣品稀釋液稀釋10~ 100倍;取25~I OOyL上述標準品濃度梯度溶液或尿液樣品稀釋液復孔加入相應的96孔板的 孔中或類似結構的容器當中；然后在上述96孔板中再各加入25~IOOyL經稀釋的UCP標記抗 NGAL抗體溶液和UCP標記Cr溶液組成的混合溶液，混勻制成懸液;接著將A類免疫層析試紙 條的樣品墊端垂直浸入上述懸液中，等待5~30min后取出水平放置5~20min后進行UCP信 號米集。
[0027] b)B類免疫層析試紙條：由襯板、UCP結合墊、分析膜及吸收墊組成，進一步可以由 塑料外殼封裝。UCP結合墊中含有UCP標記抗NGAL抗體和UCP標記Cr，具體制備方法是按 0.5mL/cm 2的用量將UCP標記抗NGAL抗體溶液和UCP標記Cr溶液組成的混合溶液均勻滴加在 UCP結合墊上，30 °C~35 °C干燥后制得。
[0028] B類免疫層析試紙條的使用方法如下：將免疫試紙條水平放置后，加20~IOOyL的 標準品濃度梯度溶液或尿液樣品稀釋液至UCP結合墊上，等待10~30min后進行UCP信號采 集。
[0029]以上A、B兩類免疫層析試紙條的樣品墊或UCP結合墊、分析膜、吸收墊及襯板的寬 度一致，均為4~5.5mm，樣品墊和UCP結合墊的長度為5~10mm，分析膜的長度為25~40mm， 吸收墊的長度為20~30mm，襯板的長度等于前后搭接組裝后樣品墊或UCP結合墊、分析膜及 吸收墊的長度總和;其中樣品墊和UCP結合墊的材料為玻璃纖維素膜或具有類似性質的膜 材料，分析膜的材料為硝酸纖維素膜或具有類似性質的膜材料，吸收墊的材料為吸水濾紙 或具有類似功能的材料，襯板的材料為具有自粘貼性質聚氯乙烯膠板或具有類似功能的材 料。
[0030] UCP免疫層析試紙條的組裝方式采用本領常規技術方法實現。
[0031] UCP為通過本領域常規技術在實驗室合成的或商品化的平均粒徑為200~ 600nmol/L的經二氧化娃包被和表面功能化修飾的由稀土金屬元素所構成的晶體材料(如 NaYF4：Er,Yb)〇
[0032] 5)所述分析膜上設有平行的兩個檢測線(Tl和T2)和一個質控線(C)，所述兩個檢 測線T1和T2分別包被抗NGAL抗體和抗Cr抗體，且兩者可以相互對調。UCP結合墊中含有的 UCP標記的抗NGAL抗體與分析膜包被的抗NGAL抗體識別NGAL不同表位，所述的抗NGAL抗體 針對的抗原為人源NGAL，所述人源NGAL為單體、同二聚體、異二聚體或三者的混合物，所述 UCP標記Cr和尿液樣品的uCr能競爭性與分析膜包被的抗Cr抗體結合，所述質控線包被抗 UCP標記抗體來源動物免疫球蛋白的抗體。所述試紙條可用UCP讀數儀進行數據采集。
[0033] 進一步地，檢測線Tl離樣品墊或UCP結合墊末端5~10mm、Tl、T2及C之間的間隔為5 ~IOmm;其中Tl包被抗NGAL抗體，而T2包被抗Cr抗體或者Tl包被抗Cr抗體而T2包被抗NGAL 抗體，質控線C包被抗UCP標記抗體來源動物免疫球蛋白的抗體;包被方法是利用手工方法 或專用的點樣儀在分析膜上（從UCP結合墊往吸收墊方向）依次均勻噴涂抗NGAL抗體溶液、 抗Cr抗體溶液及抗UCP標記抗體來源動物免疫球蛋白的抗體;抗體溶液是將抗體溶于抗體 緩沖液后得到，抗體濃度為lmg/mL，抗體緩沖液為含1 % (voI/vo 1)甲醇、pH = 8.0的IOOmM Tris-HCL溶液液;最終噴涂量為0.025~0.05mL/mm，相當于每毫米Tl、T2或C線噴涂25ng~ 50ng抗體;室溫晾干后可長期室溫保存(至少12個月內產品性能沒有顯著改變）。
[0034]抗NGAL抗體、抗Cr抗體以及質控線抗體利用本領域常規技術制備或通過商業渠道 購買獲得。抗NGAL抗體為商品化的抗體或以NGAL為抗原通過常規抗體制備技術制備的抗 NGAL抗體（Current protocols in molecular biology. New York: John Wiley, 2008 11.10.1-11.10.10 41^3111公司的3匕23477、3匕70287、313188551等）；以上方法制備或購買的 抗體經單體、同二聚體或異二聚體NGAL抗原篩選獲得針對特定分子形式NGAL的抗體。抗Cr 抗體的獲得途徑:將Cr半抗原經與載體如血清白蛋白、卵清蛋白、匙孔藍蛋白、羧甲基纖維 素及多聚賴氨酸等載體分子通過常規技術偶聯構成完成抗原免疫動物獲得相應抗Cr抗體 或經商業渠道購買(如Creative Diagnostics公司或其他公司均有該類產品出售），抗Cr抗 體可與游離的Cr和UCP標記的Cr結合。質控線包被的抗體根據UCP標記抗體類型決定，可為 兔抗鼠 IgG抗體或羊抗鼠 IgG抗體或其他動物來源的抗鼠 IgG抗體或抗兔IgG抗體等，由商業 渠道購買獲得(如abeam公司相應抗體產品）。
[0035]由于采取了以上技術方案，使本發明具有顯著有益效果。
[0036]目前沒有聯合檢測uNGAL和uCr技術，與最接近的現有技術(ZL201220497401)相 比，本發明具有以下兩方面創造性:第一，基于因尿液稀釋影響單獨測定uNGAL不能有效反 映該生物標志物的動態變換情況而測定uNGAL的動態變化是預判腎功能損傷的最重要途徑 這一基本理論和事實，本發明創造性的引進并在同一樣本實現同時聯合測定uNGAL和尿液 稀釋的糾正因子uCr，而ZL201220497401只是公布了一種基于UPT的NGAL測定方法并沒有涉 及uCr;第二，本發明可以用來測定全部分子形式uNGAL也可以用來測定單體或同二聚體或 異二聚體uNGAL，ZL201220497401所測定的NGAL的分子形式并不明確，而不同NGAL的分子形 式與其作為不同病理的診斷生物標志物的臨床表現具有顯著相關性 (Clin.J.Am.Soc.Nephrol.2010,12:2229-2235)〇
[0037] 此外，本發明還在以下三方面具有創造性:第一，將雙抗體夾心免疫檢測技術和單 抗體競爭免疫檢測技術應用于同一測試體系，從而實現對大分子蛋白質(NGAL)和小分子化 合物(Cr)的聯合定量。第二，采用免疫學方法測定Cr濃度，豐富了目前Cr濃度的測定方法。 第三，采用UCP免疫層析技術可使NGAL和Cr的濃度測定在短時間內完成(本發明裝置可以在 30~70min鐘內完成測試，而常規的ELISA需要3~5h)，從而使NGAL可用于臨床POCT項目檢 測 。
[0038] 綜上，本發明不存在對現有技術進行改進的動機且要求保護的技術方案并非顯而 易見的，并且要求保護的技術方案能夠產生顯著的有益的效果，因此是一具有新穎性和創 造性的發明創造。
【附圖說明】
[0039] 圖1為本發明基于上轉換發光技術的聯合定量檢測uNGAL和uCr裝置中A類免疫層 析試紙條的剖面示意圖。其中1樣品墊、2為分析膜、3為吸收墊、4為襯板、5和6為檢測線Tl和 T2(其中Tl包被抗NGAL抗體而T2包被抗Cr抗體，或者Tl包被抗Cr抗體而T2包被抗NGAL抗 體）、7為質控線C(包被抗UCP標記抗體來源動物免疫球蛋白的抗體，根據UCP標記抗體的種 類決定）。
[0040] 圖2為本發明基于上轉換發光技術的聯合定量檢測NGAL和尿肌酐裝置中B類免疫 層析試紙條的剖面示意圖。其中21為UCP結合墊(包被UCP標記的抗體和UCP標記的Cr，UCP標 記抗體可為UCP標記抗NGAL抗體或UCP標記在抗MMP9抗體，UCP標記抗NGAL抗體可為UCP標記 的抗單體NGAL抗體、UCP標記的抗同二聚體NGAL抗體或UCP標記的抗上述三種分子形式NGAL 的抗體）、2為分析膜、3為吸收墊、4為襯板、5和6為檢測線Tl和T2 (其中T1包被抗NGAL抗體， 而T2包被抗Cr抗體或者Tl包被抗Cr抗體而T2包被抗NGAL抗體）、7為質控線C(包被抗UCP標 記抗體來源動物免疫球蛋白的抗體，根據UCP標記抗體的種類決定）。
[0041] 圖3為本發明基于上轉換發光技術的聯合定量檢測uNGAL和uCr裝置中A類免疫層 析試紙條配套的試紙條放置架示意圖。放置架為一空心、底面缺失的長方體，長和寬尺寸略 大于標準96孔板的尺寸(如長為130mm、寬為87mm)，高度為40mm~50mm;材質為塑料或紙類； 其中31為放置架頂面其上有與96孔板對應的長方形孔(長方形孔的尺寸以略大于A類免疫 層析試紙條的寬度和厚度為準），32為放置架側面，33為放置架前面，34為放置架頂面的試 紙條放置孔。
[0042] 圖4為實施例3基于上轉換發光技術聯合定量檢測總uNGAL和uCr裝置的制備及使 用方法的標準曲線。圖4左圖是根據表1uNGAL峰面積AUCl和AUC2的平均值與總NGAL標準品 濃度繪制的標準曲線，用于尿液樣品中總uNGAL的計算；圖4右圖是根據表2uCr峰面積AUCl 和AUC2的平均值與Cr標準品濃度繪制的標準曲線，用于尿液樣品中uCr的計算。
[0043] 圖5為實施例4基于上轉換發光技術的聯合定量檢測uNGAL和uCr裝置聯合檢測單 體uNGAL和uCr濃度的標準曲線。圖5左圖是根據表2uNGAL峰面積AUCl和AUC2的平均值與單 體NGAL標準品濃度繪制的標準曲線，用于尿液樣品中單體uNGAL的計算；圖5右圖是根據表 2uCr峰面積AUCl和AUC2的平均值與Cr標準品濃度繪制的標準曲線，用于尿液樣品中uCr的 計算。
[0044] 圖6為實施例5基于上轉換發光技術的聯合定量檢測uNGAL和uCr裝置聯合檢測異 二聚體uNGAL和uCr濃度的標準曲線圖。圖6左圖是根據表3uNGAL峰面積AUCl和AUC2的平均 值與異二聚體NGAL標準品濃度繪制的標準曲線，用于尿液樣品中異二聚體uNGAL的計算；圖 6右圖是根據表4uCr峰面積AUCl和AUC2的平均值與Cr標準品濃度繪制的標準曲線，用于尿 液樣品中uCr的計算。
【具體實施方式】
[0045] 下面將用實施例進一步說明本發明。本發明實施例是用于本發明的進一步解釋而 不是對本發明的限定。根據本發明的實質進行的具體改進都屬于本發明要求保護的范圍。
[0046] 實施例1:基于上轉換發光技術聯合定量檢測總uNGAL和uCr裝置組成
[0047] 1)樣品稀釋液凍干粉1份(試劑I)
[0048] 2)標準品D溶液凍干粉1管(試劑Π )
[0049] 3) UCP標記抗三種分子形式NGAL抗體和UCP標記Cr溶液1管(試劑ΙΠ )
[0050] 4)A類免疫層析試紙條96根
[0051] 5)A類免疫層析試紙條配套試紙條放置架1個
[0052] 6) 96孔板1塊，96孔板封板膜一張
[0053] 實施例2:基于上轉換發光技術聯合定量檢測總NGAL和尿肌酐裝置組成
[0054] 1)樣品稀釋液凍干粉1份(試劑I)
[0055] 2)標準品D溶液凍干粉1管(試劑Π )
[0056] 3)B類免疫層析試紙條100根
[0057]實施例3:-種基于上轉換發光技術聯合定量檢測總uNGAL和uCr裝置的制備及使 用方法
[0058] 1)裝置的制備
[0059] a)樣品稀釋液凍干粉(試劑I)配制
[0060] 樣品稀釋液 20mL，由 lOOmmol/L HEPES，pH 7.2,200mmol/L NaCl，0.25%(vol/ vol )Tween_20，0.5% (wt/vol)的BSA組成;經磁力攪拌充分后，采用0.45μηι濾器進行過濾除 菌和除去不溶性雜質后凍干;室溫保存。
[0061 ] b)標準品D溶液凍干粉(試劑Π )配制
[0062] 由300yL含200ng/mL NGAL(單體、同二聚體及異二聚體NGAL各占40%、40%和 20% )、20mmol/L Cr及 10%海藻糖(wt/vol)的ρΗ=7·4的 10mmol/L PBS溶液經磁力攪拌充 分后，采用〇.22μπι濾器進行過濾除菌和除去不溶性雜質后凍干;室溫保存。
[0063] c) UCP標記抗三種分子形式NGAL抗體和UCP標記Cr溶液1管(試劑ΙΠ )配制
[0064] UCP標記抗三種分子形式NGAL抗體和UCP標記Cr溶液10yL，溶液組成為50mM甘氨 酸、0.05 % Tri ton-100、0· I^NaN3、lmg/mL UCP標記的兔抗三種分子形式NGAL抗體 (Proteintech公司的22264-1-AP)和lOmol/mL UCP標記Cr的水溶液;4°C保存。
[0065] d)A類免疫層析試紙條96根制備
[0066] A類免疫層析試紙條由襯板、樣品墊、分析膜及吸收墊組成;樣品墊材料為玻璃纖 維素膜，分析膜材料為硝酸纖維素膜，吸收墊材料為吸水濾紙，襯板的材料為具有自粘貼性 質聚氯乙稀膠板。襯板、樣品墊、分析膜及吸收墊的寬度均為4.5mm，長度分別為56mm、10mm、 30mm和20mm。分析膜上Tl、T2及C線分別噴涂含IOOng抗體的羊抗NGAL抗體溶液(Abeam公司 的abl 66677 )、羊抗Cr抗體(Abeam公司的ab30719)溶液及羊抗兔IgG抗體(Abeam公司的 ab97091)溶液。樣品墊末端搭載在分析膜上，兩者重合部位長度為2mm，分析膜后端搭載在 吸收墊下，兩者重合部位長度為2mm;樣品墊、分析膜及吸收墊依次組裝在襯板上，室溫保 存。
[0067] 上述所用羊抗NGAL抗體溶液、羊抗Cr抗體溶液及羊抗兔IgG抗體溶液按下述方法 制備:將抗NGAL抗體、抗Cr抗體或抗鼠 IgG抗體分別溶解在pH8.0的lOOmmol/L Tris-HCl、質 量分數為1 %的甲醇溶液中，抗體的溶度為lmg/mL。
[0068] 2)裝置使用步驟
[0069] a)制備試劑I工作液:加20mL去離子水至試劑I容器中，渦旋震蕩混勻備用。
[0070] b)取8個 1.5mL 離心管，標上號（如 50、51、52、53、54、55、56和57)。
[0071] c)在以上SO~S7離心管中各加入步驟a)制備的試劑I工作液150yL。
[0072] d)加300yL去離子水至試劑Π 容器中獲得試劑Π 溶液，混勻后全部取出加入SO管； 然后從SO取出150yL加入Sl管;混勻后從Sl管取出150yL加入S2管;混勻后從S2管取出150yL 加入S3管;混勻后從S3管取出150yL加入S4管;混勻后從S4管取出150yL加入S5管;混勻后從 S5管取出150yL加入S6管;混勻S6管。
[0073 ] e)制備稀釋后的樣品溶液:臨床尿液經離心（1000 Orpm、Imin)后利用試劑I工作液 作10~100倍數稀釋，離心與否應根據實際尿樣質量決定。
[0074] f)制備UCP標記抗體工作液
[0075] 往試劑m容器中加入4990yL試劑I工作液，水浴超聲（20kHz，320W，每次超聲15s， 停15s，一共3次;或類似超聲強度）。
[0076] g)向96孔板的每孔加入50yL S0-S7溶液或50yL稀釋后的樣品溶液;然后再往每孔 中加入50yL UCP標記抗體工作液。
[0077] h)蓋上封板膜后固定在96孔板搖床上，800rpm、37 °C下孵育30min。
[0078] i)去掉封板膜，將96孔板放置在免疫層析試紙條放置架下。
[0079] j)在每孔中依次插入A類免疫層析試紙條，等待20min。
[0080] k)取出A類免疫層析試紙條在UCP讀數儀上進行數據采集 [0081 ] 1)繪制參考標準曲線
[0082] 表1為本實施例NGAL和Cr標準品溶液(SO~S6)及空白對照溶液(S7)不同濃度對應 的峰面積(AUC)。其中AUCl和AUC2是指一個濃度梯度標準品溶液或空白對照溶液的兩個復 孔(平行孔)的AUC讀數。
[0083] 表1:不同濃度標準品NGAL和Cr對應的UCP峰面積(AUC)讀數
[0085]圖4左圖是根據表1的uNGAL峰面積AUCl和AUC2的平均值與NGAL標準品濃度繪制的 標準曲線；圖4右圖是根據表1的uCr峰面積AUCl和AUC2的平均值與Cr標準品濃度繪制的標 準曲線。
[0086]實施例4:基于上轉換發光技術聯合定量檢測單體uNGAL和uCr裝置的制備及使用 方法
[0087] 1)裝置的制備
[0088] a)樣品稀釋液凍干粉(試劑I)配制
[0089] 樣品稀釋液 20mL，由 lOOmmol/L HEPES，pH 7.2,200mmol/L NaCl，0.25%(vol/ vol )Tween_20，0.5% (wt/vol)的BSA組成;經磁力攪拌充分后，采用0.45μηι濾器進行過濾除 菌和除去不溶性雜質后凍干;室溫保存。
[0090] b)標準品A溶液凍干粉(試劑Π )配制
[0091 ]由300yL含200ng/mL單體NGAL和20mmol/L Cr 20mmol/L及 10%海藻糖(wt/vol)的 pH=7.4的lOmmol/L的PBS溶液經磁力攪拌充分后，采用0.22μπι濾器進行過濾除菌和除去不 溶性雜質后凍干;室溫保存。
[0092] c) UCP標記抗單體NGAL抗體和UCP標記Cr溶液1管(試劑ΙΠ )配制
[0093] UCP標記抗單體NGAL抗體和UCP標記Cr溶液IOyL，該溶液組成為50mM甘氨酸、 0.05%1'1'；11:〇11-100、0.1%他^、111^/1111^1]0?標記的鼠抗單體呢厶1^單克隆抗體（13;[(^01'1:0 diagnostocsA/S公司的BW 009號產品）和lOmol/mL UCP標記的Cr的水溶液;4°C保存。
[0094] d)A類免疫層析試紙條96根制備
[0095] A類免疫層析試紙條由襯板、樣品墊、分析膜及吸收墊組成;樣品墊材料為玻璃纖 維素膜，分析膜材料為硝酸纖維素膜，吸收墊材料為吸水濾紙，襯板的材料為具有自粘貼性 質聚氯乙烯膠板或具有類似功能的材料。襯板、樣品墊、分析膜及吸收墊的寬度均為4.5_， 長度分別為56mm、10mm、30mm和20mm。每條分析膜上ΤΙ、T2及C線分別噴涂含IOOng抗體的羊 抗NGAL抗體溶液(Abeam公司的ab 166677 )、羊抗Cr抗體(Abeam公司的ab30719)溶液及羊抗 鼠 IgG抗體(Abeam公司的ab6710)溶液。樣品墊末端搭載在分析膜上，兩者重合部位長度為 2mm，分析膜后端搭載在吸收墊下，兩者重合部位長度為2mm;樣品墊、分析膜及吸收墊依次 組裝在襯板上，室溫保存。
[0096] 上述所用羊抗NGAL抗體溶液、羊抗Cr抗體溶液及兔抗鼠IgG抗體溶液按下述方法 制備：將羊抗NGAL抗體、羊抗Cr抗體或兔抗鼠IgG抗體分別溶解在pH = 8.0的IOOmmo 1/L Tris-HCl、質量分數為1 %的甲醇溶液中，抗體的濃度為lmg/mL。
[0097] 2)裝置使用步驟
[0098] a)制備試劑I工作液:加20mL去離子水至試劑I容器中，渦旋震蕩混勻備用。
[0099] b)取8個 1.5mL 離心管，標上號（如 S0、S1、S2、S3、S4、S5、S6&S7)。
[0100] c)在以上SO~S7離心管中各加入步驟a)制備的試劑I工作液150yL。
[0101] d)加300yL去離子水至試劑Π 容器中獲得試劑Π 溶液，混勻后全部取出加入SO管； 然后從SO取出150yL加入Sl管;混勻后從Sl管取出150yL加入S2管;混勻后從S2管取出150yL 加入S3管;混勻后從S3管取出150yL加入S4管;混勻后從S4管取出150yL加入S5管;混勻后從 S5管取出150yL加入S6管;混勻S6管。
[0102 ] e)制備稀釋后的樣品溶液:臨床尿液經離心（1000 Orpm、Imin)后利用試劑I工作液 作10~100倍數稀釋，離心與否應根據實際尿樣質量決定。
[0103] f)制備UCP標記抗體工作液
[0104] 往試劑m容器中加入4990yL試劑I工作液，水浴超聲（20kHz，320W，每次超聲15s， 停15s，一共3次;或類似超聲強度）。
[0105] g)向96孔板的每孔加入50yL S0-S7溶液或50yL稀釋后的樣品溶液;然后再往每孔 中加入50yL UCP標記抗體工作液。
[0? 06] h)蓋上封板膜后固定在96孔板搖床上，800rpm、37 °C下孵育30min。
[0107] i)去掉封板膜，將96孔板放置在免疫層析試紙條放置架下。
[0108] j)在每孔中依次插入A類免疫層析試紙條，等待20min。
[0109] k)取出A類免疫層析試紙條在UCP讀數儀上進行數據采集。
[0110] 1)繪制參考標準曲線。
[0111] 表2為本實施例NGAL和Cr標準品溶液(SO~S6)及空白對照溶液(S7)不同濃度對應 的峰面積(AUC)。其中AUCl和AUC2是指一個濃度梯度標準品溶液或空白對照溶液的兩個復 孔(平行孔)的AUC讀數。
[0112] 表2:不同濃度標準品單體NGAL和Cr對應的UCP峰面積(AUC)讀數
[0114] 圖5左圖是根據表2的uNGAL峰面積AUCl和AUC2的平均值與單體NGAL標準品濃度繪 制的標準曲線；圖5右圖是根據表2的uCr峰面積AUCl和AUC2的平均值與Cr標準品濃度繪制 的標準曲線。
[0115] 實施例5:基于上轉換發光技術聯合定量檢測異二聚體uNGAL和uCr劑盒的制備及 使用方法
[0116] 1)裝置的制備
[0117] a)樣品稀釋液凍干粉(試劑I)配制
[0118] 樣品稀釋液 20mL，由 lOOmmol/L HEPES，pH 7.2,200mmol/L NaCl，0.25%(vol/ vol )Tween_20，0.5% (wt/vol)的BSA組成;經磁力攪拌充分后，采用0.45μηι濾器進行過濾除 菌和除去不溶性雜質后凍干;室溫保存。
[0119] b)標準品C溶液凍干粉(試劑Π )配制
[0120]由 300yL含200ng/mL異二聚體NGAL和20mmol/L Cr、20mmol/L及 10 %海藻糖（wt/ vol)的pH=7.4的lOmmol/L的PBS溶液經磁力攪拌充分后，采用0.22μηι濾器進行過濾除菌和 除去不溶性雜質后凍干;室溫保存。
[0121] e)B類免疫層析試紙條96根(該實施例所用試紙條有塑料外殼)制備
[0122] B類免疫層析試紙條襯板、UCP結合墊、分析膜及吸收墊組成;UCP結合墊材料為玻 璃纖維素膜，分析膜材料為硝酸纖維素膜，吸收墊材料為吸水濾紙，襯板的材料為具有自粘 貼性質聚氯乙烯膠板或具有類似功能的材料。襯板、UCP結合墊、分析膜及吸收墊的寬度均 為4mm，長度分別為56mm、10mm、10mm、30mm和20mm。結合墊含有UCP標記的兔抗MMP9抗體 (Abeam公司的ab38898)和UCP標記的Cr;具體制備方法是按0.5mL/cm 2的量將濃度為lmg/mL 的UCP標記的兔抗MMP-9抗體溶液和I Omo I /L的UCP標記的Cr溶液均勻加在UCP墊上，35 °C干 燥后制得。每條分析膜上Tl、T2及C線分別噴涂含IOOng抗體的羊抗NGAL抗體(Abeam公司的 ab 166677)溶液、羊抗Cr抗體(Abeam公司的ab30719)的溶液及羊抗兔IgG抗體(Abeam公司的 ab97091)溶液。UCP結合墊搭載在分析膜上，兩者重合部位長度為2mm;分析膜后端搭載在吸 收墊下，兩者重合部位長度為2_。樣品墊、分析膜及吸收墊依次組裝在襯板上。室溫保存。
[0123] 上述所用羊抗NGAL抗體溶液、羊抗Cr抗體溶液及羊抗兔IgG抗體溶液按下述方法 制備：將羊抗NGAL抗體、羊抗Cr抗體或羊抗鼠 IgG抗體分別溶解在pH = 8.0的IOOmmo 1/L Tris-HCl、質量分數為1 %的甲醇溶液中，抗體的溶度為lmg/mL。
[0124] 2)裝置使用步驟
[0125] a)制備試劑I工作液:加20mL去離子水至試劑I容器中，渦旋震蕩混勻備用。
[0126] b)取8個 1.5mL 離心管，標上號（如 S0、S1、S2、S3、S4、S5、S6&S7)。
[0127] c)在以上SO~S7離心管中各加入步驟a)制備的試劑I工作液150yL。
[0128] d)加 300yL去離子水至試劑Π容器中獲得試劑Π溶液，混勻后全部取出加入SO管； 然后從SO取出150yL加入Sl管;混勻后從Sl管取出150yL加入S2管;混勻后從S2管取出150yL 加入S3管;混勻后從S3管取出150yL加入S4管;混勻后從S4管取出150yL加入S5管;混勻后從 S5管取出150yL加入S6管;混勻S6管。
[0129 ] e)制備稀釋后的樣品溶液:臨床尿液經離心（1000 Orpm、Imin)后利用試劑I工作液 作10~100倍數稀釋，離心與否應根據實際尿樣質量決定。
[0130] f)將B類免疫試紙條水平放置在桌面上，在UCP結合墊上加入IOOyL S0-S7溶液或 經稀釋后的樣品溶液，等待20min;
[0131] g)在UCP讀數儀上進行數據采集；
[0132] h)繪制參考標準曲線。
[0133] 表2為本實施例NGAL和Cr標準品溶液(SO~S6)及空白對照溶液(S7)不同濃度對應 的峰面積(AUC)。其中AUCl和AUC2是指一個濃度梯度標準品溶液或空白對照溶液的兩個復 孔(平行孔)的AUC讀數。
[0134] 表3:不同濃度標準品異二聚體NGAL和Cr對應的UCP峰面積(AUC)讀數
[0136]圖6左圖是根據表3的uNGAL峰面積AUCl和AUC2的平均值與異二聚體NGAL標準品濃 度繪制的標準曲線；圖6右圖是根據表3的uCr峰面積AUCl和AUC2的平均值與Cr標準品濃度 繪制的標準曲線。
【主權項】
1. 一種基于上轉換發光技術的聯合定量檢測UNGAL和uCr裝置，其特征在于：由樣品稀 釋液凍干粉、NGAL和Cr標準品凍干粉、免疫層析試紙條組成； (1)樣品稀釋液凍干粉是將20mL、pH = 7 · 2~7 · 5，含150~250mmol/L NaCl、0 · 25~ 0.5%(￥〇1八〇1)1?^611-20、0.5%~2%(￥1:八〇1)133厶或2.5%~5%(￥1:八〇1)脫脂奶粉的50 ~100mmol/L HEPES緩沖液經機械或磁力攪拌充分后，采用0.22μπι或0.45μπι濾器進行過濾 除菌和除去不溶性雜質，經凍干后得到； (2 )NGAL和Cr標準品凍干粉共4套，其中， 標準品A:是用于單體uNGAL和uCr測定的標準品，每管含60ng單體NGAL和6μηιο 1 Cr; 標準品B:用于同二聚體uNGAL和uCr測定的標準品，每管含60ng同二聚體NGAL和6μηιο1 Cr； 標準品C:用于異二聚uNGAL和uCr測定的標準品，每管含60ng異二聚體NGAL和6ymolCr; 標準品D:用于三種分子形式uNGAL和uCr測定的標準品，每管含60ng NGAL和6μηιο1 Cr， 其中單體NGAL、同二聚體NGAL及異二聚體NGAL各占40 %、40 %和20 % ; (3) 所述免疫層析試紙條分A和B兩類，A類免疫層析試紙條由襯板、樣品墊、分析膜及吸 收墊組成;B類免疫層析試紙條由襯板、UCP結合墊、分析膜及吸收墊組成;UCP結合墊中含有 UCP標記抗NGAL抗體和UCP標記Cr; (4) 分析膜上設有平行的兩個檢測線T1、T2和一個質控線C，兩個檢測線T1、T2分別包被 抗NGAL抗體和抗Cr抗體，且兩者可以相互對調；質控線包被抗UCP標記抗體來源動物免疫球 蛋白的抗體； 所述襯板用于支撐樣品墊或UCP結合墊、分析膜和吸收墊的組裝，所述UCP結合墊用于 結合UCP標記抗NGAL體和UCP標記Cr，所述分析膜用于檢測線和質控線的設置從而實現NGAL 和Cr的定量及免疫層析試紙條的質控，所述吸收墊用于收集分析后的樣品溶液。2. 如權利要求1所述的一種基于上轉換發光技術的聯合定量檢測uNGAL和uCr裝置，其 特征在于:A、B兩類免疫層析試紙條的樣品墊或UCP結合墊、分析膜、吸收墊及襯板的寬度一 致，均為4~5.5mm，樣品墊和UCP結合墊的長度為5~10mm，分析膜的長度為25~40mm，吸收 墊的長度為20~30mm，襯板的長度等于前后搭接組裝后樣品墊或UCP結合墊、分析膜及吸收 墊的長度總和。3. 如權利要求1所述的一種基于上轉換發光技術的聯合定量檢測uNGAL和uCr裝置，其 特征在于:其中樣品墊和UCP結合墊的材料為玻璃纖維素膜或具有類似性質的膜材料，分析 膜的材料為硝酸纖維素膜或具有類似性質的膜材料，吸收墊的材料為吸水濾紙或具有類似 功能的材料，襯板的材料為具有自粘貼性質聚氯乙烯膠板或具有類似功能的材料。4. 如權利要求1所述的一種基于上轉換發光技術的聯合定量檢測uNGAL和uCr裝置，其 特征在于:A類免疫層析試紙條的使用是將標準品工作液用樣品稀釋液進行2倍梯度稀釋法 進行稀釋，獲得標準品濃度梯度溶液;將尿液樣品用樣品稀釋液稀釋10~100倍;取25~100 yL上述標準品濃度梯度溶液或尿液樣品稀釋液分別復孔加入相應的96孔板的孔中或類似 結構的容器當中，然后在上述96孔板中再各加入25~100yL經稀釋的UCP標記抗NGAL抗體溶 液和UCP標記Cr溶液組成的混合溶液，混勻制成懸液;接著將A類免疫層析試紙條的樣品墊 端垂直浸入上述懸液中，等待5~30min后取出水平放置5~20min后進行UCP信號采集。5. 如權利要求1所述的一種基于上轉換發光技術的聯合定量檢測uNGAL和uCr裝置，其 特征在于:B類免疫層析試紙條的使用是將標準品工作液用樣品稀釋液進行2倍梯度稀釋法 進行稀釋，獲得標準品濃度梯度溶液;接著將尿液樣品用樣品稀釋液稀釋10~100倍;接著 將B類免疫層析試紙條水平放置后，加20~100yL的標準品濃度梯度溶液或尿液樣品稀釋液 至UCP結合墊上，等待10~30min后進行UCP信號采集。6. 如權利要求1所述的一種基于上轉換發光技術的聯合定量檢測uNGAL和uCr裝置，其 特征在于:UCP是平均粒徑為200~600nmol/L的經二氧化硅包被和表面功能化修飾的由稀 土金屬元素所構成的晶體材料。7. 如權利要求1所述的一種基于上轉換發光技術的聯合定量檢測uNGAL和uCr裝置，其 特征在于:UCP標記抗NGAL抗體包括UCP標記抗單體NGAL抗體、UCP標記抗同二聚體NGAL抗 體、UCP標記抗MMP-9抗體或UCP標記抗上述三種分子形式NGAL抗體。8. 權利要求1所述的一種基于上轉換發光技術的聯合定量檢測uNGAL和uCr裝置的制備 方法，其步驟如下： 1) 所述樣品稀釋液凍干粉的制備，是將2〇1111^!1 = 7.2~7.5，含150~25〇111111〇1/1恥(：1、 0.25~0.5%(￥〇1八〇1)1?^611-20、0.5%~2%(￥1:八〇1)133厶或2.5%~5%(￥1:八〇1)脫脂奶 粉的50~100mmol/L HEPES緩沖液經機械或磁力攪拌充分后，采用0.22μπι或0.45μπι濾器進 行過濾除菌和除去不溶性雜質，經凍干后室溫保存;樣品稀釋液凍干粉使用前加入20mL去 離子水充分溶解后獲得樣品稀釋液； 2) 所述NGAL和Cr標準品凍干粉的制備，標準品A是將60ng單體NGAL和6μπιο 1 Cr溶于300 41^、？!1 = 7.4且含5~10%海藻糖（￥七八〇1)的？83溶液中得到的含200叫/11^單體呢41^和 20mmol/L Cr的溶液，過濾除菌后采用常規方法凍干后室溫保存;標準品B是將60ng同二聚 體NGAL和6μπιο1 Cr溶于30(^1^、？!1 = 7.4且含5~10%海藻糖(￥七八〇1)的？83溶液得到的含 200ng/mL同二聚體NGAL和20mmol/L Cr的溶液，過濾除菌后采用常規方法凍干后室溫保存； 標準品C是將60ng異二聚體NGAL和6μπιο1 Cr溶于30(^1^!1 = 7.4且含5~10%海藻糖(￥七/ vol)的PBS溶液得到的含200ng/mL異二聚體NGAL和20mmol/L Cr的溶液，過濾除菌后采用常 規方法凍干后室溫保存；標準品D是將24ng單體NGAL、24ng同二聚體NGAL、12ng異二聚體 NGAL和6μπιο1 Cr溶于30(^1^、？!1 = 7.4且含5~10%海藻糖（￥以￥〇1)的？83溶液得到的含 200ng/mL NGAL和20mmol/L Cr的溶液，過濾除菌后采用常規方法凍干后室溫保存；以上標 準品凍干粉使用前加入去離子水300yL混勻制備成標準品工作液； 3. UCP標記抗NGAL抗體抗體和UCP標記Cr，具體制備方法是按0.5mL/cm2的用量將UCP標 記抗NGAL抗體溶液和UCP標記Cr溶液組成的混合溶液均勻滴加在UCP結合墊上，30°C~35°C 干燥后制得； 4. T1、T2及C的包被方法是利用手工方法或專用的點樣儀在分析膜上依次均勻噴涂抗 NGAL抗體溶液、抗Cr抗體溶液及抗UCP標記抗體來源動物免疫球蛋白的抗體;抗體溶液是將 抗體溶于抗體緩沖液后得到，抗體濃度為lmg/mL，抗體緩沖液為含1 % (vo 1/vo 1)甲醇、pH= 8.0的lOOmM Tris-HCL溶液液;最終噴涂量為0.025~0.05mL/mm，相當于每毫米T1、了2或(：線 噴涂25ng~50ng抗體； 5) 襯板、樣品墊或UCP結合墊、分析膜及吸收墊相互搭接后粘于襯板上。
【文檔編號】G01N33/577GK105842464SQ201610404263
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年6月12日
【發明人】蔡林君, 陳雷, 楊津, 趙冰, 姜春來, 孔維
【申請人】吉林大學