子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒，由包括CD10、死亡受體和生長分化因子?15制成。本發明還公開子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒的制備方法。本試劑盒能更準確全面地檢測子宮肉瘤，能夠更好的判斷盆腔腫塊的良惡性，更好地對婦科良性子宮腫塊與子宮肉瘤進行鑒別診斷，其靈敏度及準確性均達到70％。
【專利說明】
子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒及其制備方法
技術領域
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[0001]本發明涉及診斷檢測用的試劑盒領域，具體為一種子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒及其制備方法。
【背景技術】
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[0002]子宮肉瘤是起源于子宮平滑肌、子宮內膜間質(或上皮)和非上皮混合成分的一類間葉源性生殖道惡性腫瘤，組織成分復雜，臨床表現與子宮肌瘤相似但缺乏特異性。由于無特異性臨床表現，術前診斷困難，最常見的體征是子宮增大，且多數增大明顯，短時期內子宮包塊增大較快，盆腹腔包塊，或有腹水、腹痛和腰痛;腫塊表面不平或呈結節樣。子宮增大癥狀術前常被誤診為“子宮肌瘤”，誤漏診率高達50%以上，許多患者因此接受了不恰當的手術治療，如腹腔鏡微創手術，導致醫源性腫瘤播散。子宮肉瘤發病率較低，在全部子宮惡性腫瘤2?5%左右，約占婦科惡性腫瘤的I %?3 %。
[0003]雖然子宮肉瘤在臨床較少見，但其侵蝕性強，惡性程度高，易復發，缺乏大樣本研究，易于局部浸潤和遠處轉移，其中以血行轉移、盆腹腔內播散轉移為主要途徑，肺轉移較為多見，給臨床治療帶來較大困難。即使是早期患者，預后亦極差，其病死率超過所有子宮惡性腫瘤的15%，總體5年生存率不到30%。子宮肉瘤病因至今尚不明確，臨床表現亦無特異性，很難在術前確診，其診斷金標準為術后組織病理學檢查(活檢)。病理診斷是一種抽樣檢查，對標本的質量有要求，標本的質量直接影響病理切片的質量;病理診斷需要依靠診斷醫師的經驗和專業知識，具有一定的主觀性;病理診斷檢測費用較高。目前尚無針對子宮肉瘤的特異性的腫瘤標記物。
[0004]子宮肌瘤是子宮內的良性腫瘤，30歲以上的女性中，有20%至30%會出現子宮肌瘤。雖然子宮肌瘤會導致痛經等癥狀，但沒有生命危險，所以一般采用保留子宮的激素療法。而子宮肉瘤卻是惡性腫瘤，如果擴散到其他組織，患者的5年生存率只有10%至20%，因此早期發現非常重要。
[0005]當前子宮肉瘤診斷金標準為術后組織病理學檢查(活檢)。病理診斷是一種抽樣檢查，對標本的質量有要求，標本的質量直接影響病理切片的質量;病理診斷需要依靠診斷醫師的經驗和專業知識，具有一定的主觀性;病理診斷檢測費用較高，并且可能會確診過晚。除了病理學診斷外，還有核磁共振成像(MRI)或正電子發射型計算機斷層顯像(PET)診斷技術。進行PET診斷時，利用的是子宮肉瘤細胞會吸收更多葡萄糖的性質，但子宮肌瘤有時也吸收很多葡萄糖，所以較難準確判斷。磁共振彌散加權成像(DWI)對腫瘤的部位和定性有幫助，但結果尚待證實。
[0006]近年來，一些研究機構也在通過免疫學方法或基因學方法開發相關的試劑盒。曾有報道稱日本福井大學的研究人員在2011年開發出一種配合正電子發射斷層成像(PET)的檢查藥劑，用于鑒別子宮內出現的腫瘤到底是良性的子宮肌瘤還是惡性的子宮肉瘤。福井大學的研究人員注意到，子宮肉瘤細胞中接受雌激素的受體會出現異常，導致細胞吸收雌激素的能力降低。研究小組著眼于這一點，通過處理雌激素制作出名為“FES”的藥劑。這種藥劑會集中到子宮肌瘤而不是子宮肉瘤上，然后利用PET成像，確認是子宮肌瘤還是子宮肉瘤。
[0007]由于子宮肉瘤癥狀和體征沒有特異性，沒有敏感的腫瘤標志物，影像學診斷特異性不高，術前往往難以做出子宮肉瘤的診斷，多數是術中甚至是術后病理才診斷。無論是超聲檢查還是正電子發射計算機斷層顯像(PET)掃描，在術前都難以分辨平滑肌腫瘤的良惡性，并且操作較為復雜，對人體有一定的傷害。磁共振彌散加權成像(DWI)對腫瘤的部位和定性有幫助，但結果尚待證實。術后組織病理學檢查是一種抽樣檢查，對標本的質量有要求，標本的質量直接影響病理切片的質量;病理診斷需要依靠診斷醫師的經驗和專業知識，具有一定的主觀性;病理診斷檢測費用較高，并且可能會確診過晚。
【發明內容】
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[0008]本發明的目的是針對以上述現有子宮肉瘤診斷上存在的不足，提供一種靈敏度高、準確率高、使用方便并且價格便宜的子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒。
[0009]本發明另一目的是提供一種子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒的制備方法。
[0010]為了實現本發明目的，本發明采取的技術方案是:子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒，由包括CD10(Cluster of Differentiat1n 10，CD10)、死亡受體6(Death receptor 6，DR6)和生長分化因子-15(growth differentiat1n factor-15，GDF_15)制成。
[0011]本發明子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒，包括捕獲抗體和檢測抗體，所述捕獲抗體為包括CD10(Cluster of Differentiat1n 10，CD10)、死亡受體6(Death receptor 6，DR6)和生長分化因子-15(growth differentiat1n factor-15，GDF_15)分別制得的單克隆抗體。
[0012]所述檢測抗體為包括CD10(Clusterof Differentiat1n 10，CD10)、死亡受體6(Death receptor 6，DR6)和生長分化因子_15(growth differentiat1n factor-15,GDF-15)分別制得的多克隆抗體。
[0013]所述捕獲抗體為將CDlO(Clusterof Differentiat1n 10，CD10)、死亡受體6(Death receptor 6，DR6)和生長分化因子_15(growth differentiat1n factor-15,GDF-15)克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到相應的抗原，將所述抗原免疫哺乳動物得到的相應單克隆抗體。
[0014]所述捕獲抗體的制備方法包括的步驟如下:
[0015](I)抗原的制備:把⑶10、死亡受體6和生長分化因子-15的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到抗原，此抗原也可作為標準品用；
[0016](2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應的單克隆抗體為捕獲抗體。
[0017]所述檢測抗體為將⑶10、死亡受體6和生長分化因子-15的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到相應的抗原，將所述抗原免疫哺乳動物得到的相應多克隆抗體。
[0018]所述檢測抗體的制備方法包括的步驟如下:
[0019](I)抗原的制備:把⑶10、死亡受體6和生長分化因子-15的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到抗原，此抗原也可作為標準品用；
[0020](2)檢測抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應的多克隆抗體為檢測抗體。
[0021]所述捕獲抗體預先包被于微量滴定板的孔內，可以簡化步驟，提高檢測效率;所述滴定板的孔的孔徑為0.5-5mm。
[0022]子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒的制備方法，其包括以下步驟:
[0023](I)抗原的制備:將⑶10、死亡受體6和生長分化因子-15的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作為標準品用；
[0024](2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；
[0025](3)檢測抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的多克隆抗體，所述多克隆抗體作為本試劑盒的檢測抗體；
[0026](4)捕獲抗體包被:
[0027]①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)將濃度為2yg/ml的捕獲抗體包被微量滴定板的孔;②.封蓋微量滴定板并在3 0C下孵育過夜;③.棄去包被液(碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋的捕獲抗體)，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入150μ1 PBST(磷酸鹽吐溫緩沖液)，在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于:TC環境中備用。
[0028](5)封閉和加樣:每孔添加150μ1封閉緩沖液(1.2%BSA/PBS)，封閉包被孔中剩余的蛋白質結合位點。
[0029]子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒的檢測方法，其包括以下步驟:
[0030](I)抗原的制備:將⑶10、死亡受體6和生長分化因子-15的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到所需的抗原；
[0031](2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；
[0032](3)檢測抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的多克隆抗體，所述多克隆抗體作為本試劑盒的檢測抗體；
[0033](4)捕獲抗體包被:
[0034]①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(ρΗ9.6)將濃度為2yg/ml的捕獲抗體包被微量滴定板的孔；
[0035]②.封蓋微量滴定板并在3°C下孵育過夜；
[0036]③.棄去包被液(碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋的捕獲抗體)，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入150μ1 PBST(磷酸鹽吐溫緩沖液)，在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于3°C環境中備用。
[0037](5)封閉
[0038]①.在微量滴定板的每個孔添加150μ1封閉緩沖液(1.2%BSA/PBS)，封閉包被孔中剩余的蛋白質結合位點；
[0039]②.封蓋微量滴定板并在37.5°C孵育I小時；
[0040] (6)加樣
[0041 ]①.將ΙΟΟμΙ的樣品添加到每個孔，在37.5°C孵育60分鐘;要得到準確的定量結果，通常做法是比較未知樣品與標準曲線的信號。每個酶標板都必須測定標準品(兩重測定或三重測定)和空白樣，以確保準確性；
[0042]②.棄去樣品，并洗滌微量滴定板三次，每次在微孔中加入150μ1PBST(磷酸鹽吐溫緩沖液)；
[0043]③.將ΙΟΟμΙ濃度為0.5yg/ml的檢測抗體添加到每個孔；
[0044]④.封蓋微量滴定板并在37.5°C孵育I小時；
[0045]⑤.用PBST洗滌微量滴定板四次；
[0046]⑥.添加ΙΟΟμΙ標記二抗；
[0047]⑦.封蓋微量滴定板并在37.5°C孵育I小時。
[0048]⑧.用PBST洗滌微量滴定板四次。
[0049](7)檢測
[0050]①.將TMB(3，3 ’，5，5 ’ -四甲基聯苯胺)溶液添加到每個孔，孵育15-30分鐘，添加等體積的終止液，然后在450nm處讀取光密度。
[0051 ]②.由系列稀釋液得到的數據繪制標準曲線，濃度標在X軸(對數標度)上，而吸光度標在Y軸(線性標度)上。通過內插法在此標準曲線上得出樣品濃度。
[0052]本發明從眾多的腫瘤標記物中，通過各種不同的排列組合，篩選出3個腫瘤標記物CD10、死亡受體6和生長分化因子-15組成子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒。其中，CDlO是一種中性肽鏈內切酶，分子量約為97kDa，由750個氨基酸組成，已經被發現廣泛地存在于中樞神經系統以及外周各種組織中，并具有眾多組織特異性功能，能誘導T細胞凋亡。死亡受體6(DR6)是TNF死亡受體家族的一員，在免疫系統和神經系統中發揮著重要功能，死亡受體6(DR6)可調節神經元細胞和神經軸索的退化死亡。研究顯示子宮肉瘤患者血清中DR6水平明顯超過健康人群。生長分化因子-15(GDF-15)是轉化生長因子β(transforming growthfactori3，TGF-13)超家族成員的一個遠支，生長分化因子-15(⑶F-15)是一種應激反應蛋白，生理情況下⑶F-15在前列腺和胎盤中高表達，在多數其他組織中微弱表達，大多數研究表明生長分化因子-15(GDF-15)在多種腫瘤中表達升高。由于血漿中提取這3個腫瘤標記物產量低、步驟繁瑣，所以我們將采用分子克隆的方法大量生產。
[0053]與現有技術相比，本發明的有益效果如下:
[0054](I)把CD10、DR6和GDF-15聯合作為子宮肉瘤的腫瘤標志物指標，用于子宮肉瘤的早中期聯合診斷，設計非常新穎;可以更準確全面地檢測子宮肉瘤，能夠更好的判斷盆腔腫塊的良惡性，更好地對婦科良性子宮腫塊與子宮肉瘤進行鑒別診斷，其靈敏度及準確性均達到70% ；
[0055](2)既可用于子宮肉瘤診斷和體檢篩查，又可用于子宮肉瘤治療效果及預后復發監控，填補了國內子宮肉瘤早中期篩查和診斷的空白；
[0056](3)生產成本低，檢測結果的穩定性，重復性及準確度高。
【附圖說明】
[0057]圖1是本發明子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒的流程圖；
[0058]圖2是本發明子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒的原理圖；
[0059]圖3是本發明子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒的檢測抗體最佳工作濃度的選擇對比圖；
[0060]圖4是本發明子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒在子宮肉瘤治療前后血中檢測到CDlO 的變化(η = 175 ;P〈0.05)對比圖；
[0061]圖5是本發明子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒在子宮肉瘤治療前后血中檢測到死亡受體6的變化(n = 175;P〈0.05)對比圖；
[0062]圖6是本發明子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒在子宮肉瘤治療前后血中檢測到GDF-15 的變化(η = 175;Ρ〈0.05)對比圖。
【具體實施方式】
[0063]以下結合附圖和具體實施例對本發明子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒進行詳細的描述說明。
[0064]子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒，包括捕獲抗體，捕獲抗體封閉緩沖液，標準品，標記抗體，洗滌液及顯色液等。所述標記抗體選用HRP標記二抗。所述捕獲抗體包括⑶10、死亡受體6和生長分化因子-15分別制得的單克隆抗體;通過對⑶10、死亡受體6和生長分化因子-15的共同快速檢測，可以有效的提高檢測準確率和靈敏度，有效的克服單憑某一腫瘤標志物檢測導致的不足，其靈敏度及準確性均達到70%以上。
[0065]所述捕獲抗體為⑶10、死亡受體6和生長分化因子-15克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到相應的抗原，將所述抗原免疫哺乳動物得到的相應單克隆抗體。
[0066]所述捕獲抗體的制備方法包括的步驟如下:
[0067](I)抗原的制備:通過分子克隆的方法把⑶10、死亡受體6和生長分化因子-15基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到抗原，此抗原也可作為標準品用;所述抗原的制備也可以使用現有常規方法制備，在此不再累贅。
[0068](2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應的單克隆抗體為捕獲抗體。所述哺乳動物是小鼠及兔子，優選小鼠。所述捕獲抗體的制備也可以使用現有常規方法制備，在此不再累贅。
[0069]所述檢測抗體包括⑶10、死亡受體6和生長分化因子-15分別制得的多克隆抗體。
[0070]所述捕檢測抗體為⑶10、死亡受體6和生長分化因子-15的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到相應的抗原，將所述抗原免疫哺乳動物得到的相應多克隆抗體。所述檢測抗體的制備方法包括的步驟如下:
[0071](I)抗原的制備:通過分子克隆的方法把⑶10、死亡受體6和生長分化因子-15基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到抗原，此抗原也可作為標準品用；
[0072](2)檢測抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應的多克隆抗體為檢測抗體。所述哺乳動物是小鼠及兔子，優選兔子。
[0073]其中，所述捕獲抗體可以預先包被于PVC材質的微量滴定板的孔內，可以簡化步驟，提高檢測效率。其中微量滴定板的孔的孔徑優選為l_5mm。
[0074]子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒的制備方法，其包括以下步驟:
[0075](I)抗原的制備:通過分子克隆的方法將⑶10、死亡受體6和生長分化因子-15基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作為標準品用；
[0076](2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；
[0077](3)檢測抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的多克隆抗體，所述多克隆抗體作為本試劑盒的檢測抗體；
[0078](4)捕獲抗體包被:
[0079]①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)將濃度為2yg/ml的捕獲抗體包被于微量滴定板的孔；
[0080]②.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在3°C下孵育過夜；
[0081]③.棄去包被液(碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋的捕獲抗體)，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入150μ1 PBST(磷酸鹽吐溫緩沖液)，在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于3°C環境中備用;所述洗滌液為PBS(磷酸鹽緩沖液)中加入一定量的Tween 20，所述Tween 20的質量百分比濃度為0.05%;
[0082](5)封閉
[0083]①.在微量滴定板的每孔添加150μ1封閉緩沖液(為含1.2%BSA(牛血清白蛋白)的PBS(磷酸鹽緩沖液))，用于封閉包被孔中剩余的蛋白質結合位點；
[0084]②.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在37.5°C孵育I小時。
[0085]子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒的檢測方法，其包括以下步驟:
[0086](I)抗原的制備:通過分子克隆的方法將⑶10、死亡受體6和生長分化因子-15克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作為標準品用；
[0087](2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；
[0088](3)檢測抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的多克隆抗體，所述多克隆抗體作為本試劑盒的檢測抗體；
[0089](4)捕獲抗體包被:
[0090]①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)將濃度為2yg/ml的捕獲抗體包被微量滴定板的孔；
[0091 ]②.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在3°C下孵育過夜；
[0092]③.棄去包被液(碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋的捕獲抗體)，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入150μ1 PBST(磷酸鹽吐溫緩沖液，可以是含0.05%吐溫-20的ΡΗ7.4的磷酸鹽緩沖液)，在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于3°C環境中備用;所述洗滌液為PBS(磷酸鹽緩沖液)中加入一定量的Tween 20，所述Tween 20的質量百分比濃度為0.05% ;
[0093](5)封閉
[0094]①.在微量滴定板的每個孔添加150μ1封閉緩沖液(1.2%BSA/PBS)，封閉包被孔中剩余的蛋白質結合位點；
[0095]②.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在37.5°C孵育I小時；
[0096](6)加樣
[0097]①.將ΙΟΟμΙ適當稀釋(稀釋20倍)的樣品添加到每個孔，在37.5°C下孵育60分鐘；要得到準確的定量結果，通常做法是比較未知樣品與標準曲線的信號。每個酶標板都必須測定標準品(兩重測定或三重測定)和空白樣，以確保準確性；
[0098]②.棄去樣品，并洗滌微量滴定板三次，每次在微孔中加入150μ1PBST(磷酸鹽吐溫緩沖液)；
[0099]③.將ΙΟΟμΙ濃度為lyg/ml的檢測抗體添加到每個孔；
[0100]④.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在37.5°C孵育I小時；
[0101]⑤.用PBST洗滌微量滴定板四次；
[0102]⑥.添加ΙΟΟμΙ標記二抗，其在使用前便已在I3BS中稀釋10000倍(1: 10000)。所述標記二抗可以為HRP標記羊抗兔。
[0103]⑦.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在37.5°C孵育I小時。
[0104]⑧.用PBST洗滌微量滴定板四次。
[0105](7)檢測
[0106]①.將TMB(3，3 ’，5，5 ’ -四甲基聯苯胺)溶液添加到每個孔，孵育15-30分鐘，添加等體積的終止液(2M H2SO4)，然后用酶聯免疫檢測儀在450nm處讀取光密度。
[0107]②.由系列稀釋液得到的數據繪制標準曲線，濃度標在X軸(對數標度)上，而吸光度標在Y軸(線性標度)上。通過內插法在此標準曲線上得出樣品濃度。
[0108]本發明子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒包括CD10、死亡受體6和生長分化因子-15三項指標中兩項同時升高作為診斷子宮肉瘤的標準，檢測原理如圖2所示;CD10、死亡受體6和生長分化因子-15三項指標中兩項同時下降作為子宮肉瘤治療效果評估的標準。可以用于臨床上通過檢測血中3個腫瘤標記物水平的高低對子宮肉瘤的治療效果進行動態評估。另外還可以用于臨床上對子宮肉瘤的復發轉移及預后判斷的應用。
[0109]試驗效果說明
[0110]雙抗體夾心ELISA最佳實驗條件的選擇
[0111]包被鼠抗人⑶10、死亡受體6和生長分化因子-15單抗最佳工作濃度的選擇:根據方陣法確定包被濃度為lug/mL時，單克隆抗體的OD值為1.05，所以其最佳包被濃度為Iug/mL。如圖3所示，CD10、死亡受體6和生長分化因子-15多抗最佳工作濃度的選擇:隨著單抗稀釋倍數的增加，待測子宮肉瘤病例血清和正常人血清OD值有遞減的趨勢，當抗體濃度為1:200時，陽性對照(陽性對照OD值減去空白對照OD值)與正常對照(正常對照OD值減去空白對照OD值)A450nm之比(簡稱P/N值)較高，故選擇兔抗人抗體最佳工作濃度為1:200。血清摸索的最佳工作濃度為1:25。封閉液摸索最佳工作溶度為1.2%BSA。
[0112]臨床血清標本檢測
[0113]共檢測了 500份血清標本，以醫院經病理確診為子宮肉瘤患者血清為陽性對照組(180例(其中早期子宮肉瘤85例，晚期子宮肉瘤95例))，非子宮肉瘤患者包括小葉增生、正常人群血清為陰性對照組(320例)，PBST為空白對照，通過上述雙抗夾心ELISA法進行定性及定量檢測臨床血清標本。如圖3所示，以P/N值>2為雙抗夾心ELISA陽性判定標準，以病理診斷為標準對臨床血清標本進行檢測，早期子宮肉瘤結果檢測靈敏性(SN)為65%，晚期子宮肉瘤檢測靈敏性(SN)為71%，準確率(SP)達到70%。
[0114]臨床對子宮肉瘤的治療效果進行動態評估
[0115]為確定本試劑盒能否用于對子宮肉瘤的治療效果進行動態評估，我們收集了175份子宮肉瘤患者治療前后的血清。175個患者的檢測結果參見4-6，結果顯示子宮肉瘤患者治療前后的血清中CD10、死亡受體6和生長分化因子-15的水平有顯著差異(P〈0.05)。有效治療后血清中CD10、死亡受體6和生長分化因子-15的水平會大大下降，提示本試劑盒能用于對子宮肉瘤的治療效果進行動態評估。
[0116]本發明采用酶聯免疫法，通過抗體篩選、純化以及配對等相關步驟，開發出具有3個診斷指標的子宮肉瘤早中期診斷試劑盒。該技術相對于目前的診斷技術來說，具有靈敏度高、準確率高、使用方便并且價格便宜的優勢。因子宮肉瘤罕見和組織病理學的多樣性，目前仍缺乏最佳治療方案和與不良預后相關的危險因素的共識。項目的成功實施，可以增加子宮肉瘤、卵巢小細胞癌、宮體和宮頸的透明細胞癌等少見腫瘤疾病的關注和研究，帶動這些少見腫瘤疾病體外診斷試劑的發展，形成從篩查一一診斷一一治療一一預后監測一條完整的產業鏈，助力生命科學研究，保障人類健康。
[0117]本發明可以簡單、快速、準確地對早中期子宮肉瘤患者進行診斷，做到早診斷、早治療，提高存活率。傳統的子宮肉瘤診斷方式比較繁瑣，費用較高，準確率不高，并且對人體有一定的傷害。本項目產品的臨床應用，一方面降低了診斷成本、為患者節約了大量的診斷治療費用，減少了對人體的傷害，并且準確率大大提高；另一方面，產品還可以用于患者預后診斷監控，定期監控患者身體健康，發現復發跡象及時治療，為患者健康保駕護航。
[0118]本發明屬于體外診斷試劑一一與腫瘤標志物檢測相關的試劑。采用全新的子宮肉瘤標志物用于子宮肉瘤早中期的診斷及篩查，相對于早期的腫瘤標志物檢測技術，具有靈敏度高、準確率高、操作方便的優勢，開創了無癥狀微灶腫瘤的新途徑，具有重大的社會意義。
[0119]體外診斷(In Vitro Diagnosis，IVD)是指將樣本(血液、體液、組織)從人體中取出后進行檢測而進行診斷，相對于體內診斷而言。這幾年體外診斷技術迅猛發展，從基因水平的基因測序、SNP篩查、點突變基因診斷，到蛋白水平的各種生物標志物檢測，到細胞水平的循環腫瘤細胞檢測(CTC)、薄層液基細胞學檢測(TCT)，再到組織水平上的PET/CT等。總的來說，體外診斷向更簡便，更快捷，非侵入性，多信息化的方向發展。
[0120]本發明用分子克隆的方法在大腸桿菌中實現四種蛋白的可溶性表達，純化出高質量的標準品蛋白。用純化得到的三種標準品蛋白免疫動物，制備相應的單克隆抗體;再通過大量的ELISA配對實驗篩選出敏感性高特異性強的抗體作為診斷抗體，并純化出高效的捕捉及檢測抗體備用。用制備的標準品及診斷抗體組裝ELISA試劑盒，摸索捕捉抗體的包被濃度及檢測抗體的稀釋倍數，制定出標準化的試劑盒操作規程;進行穩定性及破壞性測試包括實時穩定性、高溫加速破壞穩定性、運輸穩定性、上機穩定性。收集300份血清，其中正常人及子宮肉瘤病人血清各150份；以3種標記物為標準品進行ELISA檢測;對結果進行統計學分析，評估診斷試劑盒的敏感性和準確性。
[0121]以上詳細描述了本發明的較佳具體實施例，應當理解，本領域的普通技術無需創造性勞動就可以根據本發明的構思做出諸多修改和變化。因此，凡本技術領域中技術人員依本發明構思在現有技術基礎上通過邏輯分析、推理或者根據有限的實驗可以得到的技術方案，均應該在由本權利要求書所確定的保護范圍之中。
【主權項】
1.子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒，其特征在于，由包括CD10、死亡受體6和生長分化因子-15制成。2.根據權利要求1所述的子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒，其特征在于，包括捕獲抗體和檢測抗體，所述捕獲抗體為包括CD10、死亡受體6和生長分化因子-15分別制得的單克隆抗體。3.根據權利要求2所述的子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒，其特征在于，所述檢測抗體為包括⑶10、死亡受體6和生長分化因子-15分別制得的多克隆抗體。4.根據權利要求3所述的子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒，其特征在于，所述捕獲抗體為將CD10、死亡受體6和生長分化因子-15克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到相應的抗原，將所述抗原免疫哺乳動物得到的相應單克隆抗體。5.根據權利要求4所述的子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒，其特征在于，所述捕獲抗體的制備方法包括的步驟如下: (1)抗原的制備:把CD10、死亡受體6和生長分化因子-15的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到抗原，此抗原也可作為標準品用； (2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應的單克隆抗體為捕獲抗體。6.根據權利要求3任一所述的子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒，其特征在于，所述檢測抗體為將CD10、死亡受體6和生長分化因子-15的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到相應的抗原，將所述抗原免疫哺乳動物得到的相應多克隆抗體。7.根據權利要求6所述的子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒，其特征在于，所述檢測抗體的制備方法包括的步驟如下: (1)抗原的制備:把CD10、死亡受體6和生長分化因子-15的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到抗原，此抗原也可作為標準品用； (2)檢測抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應的多克隆抗體為檢測抗體。8.權利要求3所述的子宮肉瘤早中期快速診斷試劑盒的制備方法，其特征于，其包括以下步驟: (1)抗原的制備:將CD10、死亡受體6和生長分化因子-15基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化后得到所需的抗原； (2)捕獲抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體； (3)檢測抗體的制備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的多克隆抗體，所述多克隆抗體作為本試劑盒的檢測抗體； (4)捕獲抗體包被: ①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液將濃度為2yg/ml的捕獲抗體包被微量滴定板的孔； ②.封蓋微量滴定板并在3°C下孵育過夜； ③.棄去包被液，并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入150μ1PBST，除去洗滌液和剩余的液滴，晾干放于3°C環境中； (5)封閉:每孔添加150μ1封閉緩沖液，封閉包被孔中剩余的蛋白質結合位點。
【文檔編號】G01N33/68GK105842461SQ201610287446
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月30日
【發明人】余躍飛
【申請人】廣州恒泰生物科技有限公司