利用高效液相色譜分析他達拉非的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用高效液相色譜分析他達拉非含量的方法，所述高效液相色譜：采用辛烷基鍵合硅膠柱為色譜柱；采用重量百分比為0.1％的三氟乙酸水溶液作為流動相A；以及采用乙腈作為流動相B，其中，進樣流速為0.90～1.10ml/min。方法可以很好的分離他達拉非與其異構體，并且靈敏度高，專屬性強，從而可以提高他達拉非含量測定的可靠性。
【專利說明】
利用高效液相色譜分析他達拉非的方法
技術領域
[0001] 本發明屬于藥物分析技術領域，涉及他達拉非的分析方法，具體而言，本發明涉及 一種利用高效液相色譜分析他達拉非的方法。
【背景技術】
[0002] 他達拉非（結構式如式1所示）由禮來公司研制，是環磷酸鳥苷（CGMP)特異性 磷酸二酯酶5 (PDE5)的選擇性可逆抑制劑，臨床用于治療男性勃起功能障礙和肺動脈高血 壓。
[0003]
[0004] 現有技術雖然報道對他達拉非的分析，但是采用該方法他達拉非片與其異構體 (結構式如式2所示）分離度未達到要求。因此，對于他達拉非的分析方法有待進一步改 進。
【發明內容】
[0005] 本發明旨在至少在一定程度上解決上述技術問題之一或至少提供一種有用的商 業選擇。為此，本發明的一個目的在于提出一種利用高效液相色譜分析他達拉非的方法，該 方法可以顯著提高他達拉非與其異構體的分離效果，并且靈敏度高，專屬性強。
[0006] 在本發明的一個方面，本發明提出了一種利用高效液相色譜分析他達拉非的方 法，所述高效液相色譜：
[0007] 采用辛烷基鍵合硅膠柱為色譜柱；
[0008] 采用重量百分比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液作為流動相A ;以及
[0009] 米用乙臆作為流動相B，
[0010] 其中，進樣流速為0.90~I. 10ml/min。
[0011] 由此，根據本發明實施例的利用高效液相色譜分析他達拉非的方法可以很好的分 離他達拉非與其異構體，并且靈敏度高，專屬性強，從而可以提高他達拉非含量測定的可靠 性和準確性。
[0012] 另外，根據本發明上述實施例的利用高效液相色譜分析他達拉非的方法還可以具 有如下附加的技術特征：
[0013] 在本發明的一些實施例中，檢測波長為283~285nm。由此，可以顯著提高檢測靈 敏度。
[0014] 在本發明的一些實施例中，所述色譜柱的柱溫為35~42攝氏度。由此，可以顯著 提高他達拉非與其異構體的分離效果。
[0015] 在本發明的一些實施例中，所述色譜柱的柱溫為40攝氏度。由此，可以進一步提 高他達拉非與其異構體的分離效果。
[0016] 在本發明的一些實施例中，進樣流速為1.0 ml/min。由此，可以進一步提高他達拉 非與其異構體的分離效果。
[0017] 在本發明的一些實施例中，所述辛烷基鍵合硅膠柱為Venusil ASB Ti C8色譜柱 或ZORBAX SB-C8色譜柱。由此，可以進一步提高他達拉非與其異構體的分離效果。
[0018] 在本發明的一些實施例中，所述高效液相色譜采用4. 6X250mm，5 μπι的Venusil ASB Ti C8色譜柱，重量百分比為0.1 %的三氟乙酸水溶液為流動相Α，乙腈為流動相B進行 等度洗脫，其中，所述流動相A與所述流動相B的體積比為（50~65) : (50~35)，柱溫為 35~42攝氏度，檢測波長為283~285nm，流速為0. 90~I. 10ml/min，進樣體積為10 μ L。 由此，可以進一步提高他達拉非與其異構體的分離效果。
[0019] 在本發明的一些實施例中，所述高效液相色譜采用4. 6X250mm，5 μπι的Venusil ASB Ti C8色譜柱，重量百分比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液為流動相Α，乙腈為流動相B進 行等度洗脫，其中，所述流動相A與所述流動相B的體積比為55:45,柱溫為40攝氏度，檢 測波長為285nm，流速為1.0 ml/min，進樣體積為10 μ L，任選地，所述高效液相色譜采用 4. 6X250mm，5 μπι的Venusil ASB Ti C8色譜柱，重量百分比為0.1%的三氟乙酸水溶液為 流動相A，乙腈為流動相B進行等度洗脫，其中，流動相A與流動相B的體積比為50:50,柱 溫為35攝氏度，檢測波長為283nm，流速為0. 90ml/min，進樣體積為10 μ L，任選地，所述高 效液相色譜采用4.6X250mm，5 μπι的Venusil ASB Ti C8色譜柱，重量百分比為0.1%的三 氟乙酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B進行等度洗脫，其中，流動相A與流動相B的體積 比為58 :42，柱溫為38攝氏度，檢測波長為28511111，流速為1.051111/1^11，進樣體積為1(^1^， 任選地，所述高效液相色譜采用4.6X250mm，5 μπι的Venusil ASB Ti C8色譜柱，重量百分 比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B進行等度洗脫，其中，流動相A與 流動相B的體積比為60:40,柱溫為42攝氏度，檢測波長為284nm，流速為I. 10ml/min，進樣 體積為10 μ L。由此，可以進一步提高他達拉非與其異構體的分離效果。
[0020] 在本發明的一些實施例中，所述高效液相色譜采用4.6X250mm，5 μπι的ZORBAX SB-C8色譜柱，重量百分比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液為流動相Α，乙腈為流動相B進行等度 洗脫，其中，所述流動相A與所述流動相B的體積比為（50~65) : (50~35)，柱溫為35~ 42攝氏度，檢測波長為283~285nm，流速為0. 90~I. 10ml/min，進樣體積為10 μ L。由此， 可以進一步提高他達拉非與其異構體的分離效果。
[0021] 在本發明的一些實施例中，所述高效液相色譜采用4.6X250mm，5 μπι的ZORBAX SB-C8色譜柱，重量百分比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液為流動相Α，乙腈為流動相B進行等度 洗脫，其中，所述流動相A與所述流動相B的體積比為55:45，柱溫為40攝氏度，檢測波長為 284nm，流速為1.0 ml/min，進樣體積為10 μ L，任選地，所述高效液相色譜采用4. 6 X 250mm， 5 μ m的ZORBAX SB-C8色譜柱，重量百分比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液為流動相A，乙腈為 流動相B進行等度洗脫，其中，流動相A與流動相B的體積比為50:50,柱溫為35攝氏度， 檢測波長為285nm，流速為0. 90ml/min，進樣體積為10 μ L，任選地，所述高效液相色譜采 用4. 6 X 250mm，5 μ m的ZORBAX SB-C8色譜柱，重量百分比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液為流 動相A，乙腈為流動相B進行等度洗脫，其中，流動相A與流動相B的體積比為65:35,柱溫 為38攝氏度，檢測波長為285nm，流速為I. 05ml/min，進樣體積為10 μ L，任選地，所述高效 液相色譜采用4. 6 X 250mm，5 μ m的ZORBAX SB-C8色譜柱，重量百分比為0. 1 %的三氟乙酸 水溶液為流動相A，乙腈為流動相B進行等度洗脫，其中，流動相A與流動相B的體積比為 60:40,柱溫為42攝氏度，檢測波長為285nm，流速為I. 10ml/min，進樣體積為10 μ L。由此， 可以進一步提高他達拉非與其異構體的分離效果。
[0022] 本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過本發明的實踐了解到。
【附圖說明】
[0023] 本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變 得明顯和容易理解，其中：
[0024] 圖1是他達拉非的紫外掃描圖；
[0025] 圖2采用本發明實施例2所得他達拉非的HPLC圖譜示意圖；
[0026] 圖3是采用本發明一個實施例的利用高效液相色譜分析他達拉非的方法所得他 達拉非的HPLC圖譜示意圖；
[0027] 圖4是采用本發明一個實施例的利用高效液相色譜分析他達拉非的方法所得的 他達拉非與雜質混合溶液的HPLC圖譜示意圖；
[0028] 圖5是采用本發明一個實施例的利用高效液相色譜分析他達拉非的方法所得的 氧化破壞降解溶液的HPLC圖譜示意圖；
[0029] 圖6是采用本發明一個實施例的利用高效液相色譜分析他達拉非的方法所得的 酸降解溶液的HPLC圖譜示意圖；
[0030] 圖7是采用本發明一個實施例的利用高效液相色譜分析他達拉非的方法所得的 堿降解溶液的HPLC圖譜示意圖；
[0031] 圖8是采用本發明一個實施例的利用高效液相色譜分析他達拉非的方法所得他 達拉非的HPLC圖譜示意圖；
[0032] 圖9是采用本發明又一個實施例的利用高效液相色譜分析他達拉非的方法所得 他達拉非的HPLC圖譜示意圖。
【具體實施方式】
[0033] 下面通過參考本發明的實施例對本發明進行描述，需要說明的是，這些實施例僅 用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。除非特殊說明，在實施例中所進行的操作 均為按照《中華人民共和國藥典》以及本領域中公知的方法進行的。
[0034] 在本發明的一個方面，本發明提出了一種利用高效液相色譜分析他達拉非的方 法。根據本發明的實施例，該高效液相色譜分析可以采用辛烷基鍵合硅膠柱為色譜柱；采用 重量百分比為〇. 1 %的三氟乙酸水溶液作為流動相A ;以及采用乙腈作為流動相Β，其中，進 樣流速為〇· 90~I. 10ml/min。
[0035] 發明人驚奇的發現，該方法中通過采用0. 90~I. lOml/min的進樣流速可以有效 實現他達拉非與其異構體的有效分離，并且檢測結果具有顯著的精密度、穩定性和重復性， 同時較傳統的采用I. 5ml/min的進樣流速相比，采用本發明所述的他達拉非分析方法所得 他達拉非的圖譜基線平穩且峰形對稱，并且本發明所述方法可以很好的分離他達拉非與其 異構體，分離度達到測定要求。另外，采用本發明的進樣流速不僅可以降低進樣量，而且顯 著降低檢測時間，從而可以顯著提高檢測效率。
[0036] 根據本發明的實施例，利用高效液相色譜分析他達拉非的方法采用的檢測波長并 不受特別限制，本領域技術人員可以根據實際需要進行選擇，根據本發明的具體實施例，可 以采用的檢測波長為283~285nm。發明人通過大量實驗意外發現，該檢測波長下他達拉非 具有最大吸收，且峰型好。
[0037] 根據本發明的又一個實施例，色譜柱的柱溫并不受特別限制，本領域技術人員可 以根據實際需要進行選擇，根據本發明的具體實施例，色譜柱的柱溫可以為35~42攝氏 度。發明人發現，該溫度下他達拉非與其異構體的分離效果好，從而提高他達拉非檢測數據 的可靠性和準確性。根據本發明的具體示例，色譜柱的柱溫為40攝氏度。由此，可以進一 步提高他達拉非檢測數據的可靠性和準確性。
[0038] 根據本發明的再一個實施例，色譜柱中填料的粒徑并不受特別限制，本領域技術 人員可以根據實際需要進行選擇，根據本發明的一個實施例，色譜柱中填料的粒徑可以為 4~6微米。發明人發現，該條件下可以顯著提高他達拉非與其異構體的分離效果，從而進 一步提高他達拉非檢測數據的可靠性。根據本發明的具體實施例，色譜柱中填料的粒徑可 以為5微米。由此，可以進一步提高他達拉非檢測數據的可靠性。
[0039] 根據本發明的實施例，辛烷基鍵合硅膠柱的具體類型并不受特別限制，本領域 技術人員可以根據實際需要進行選擇，根據本發明的具體實施例，辛烷基鍵合硅膠柱為 Venusil ASB Ti C8色譜柱或ZORBAX SB-C8色譜柱。發明人發現，選擇Venusil ASB Ti C8 色譜柱或ZORBAX SB-C8色譜柱較其他色譜柱可以顯著提高他達拉非與其異構體的分離效 果，從而進一步提高他達拉非檢測數據的可靠性。
[0040] 根據本發明的再一個實施例，進樣流速可以為l.Oml/min。發明人發現，該流速 下可以顯著提高他達拉非與其異構體的分離效果，較傳統方法中采用I. 5ml/min的進樣流 速相比，采用本發明的流速，不僅能得到圖譜基線平穩且峰形對稱的他達拉非圖譜，而且可 以很好的分離他達拉非與其異構體，分離度達到測定要求，還可以降低進樣量，而且靈敏度 高，專屬性強，從而顯著提高他達拉非檢測數據的可靠性，進而顯著提高檢測效率。
[0041] 根據本發明的實施例，本發明的利用高效液相色譜分析他達拉非的方法具體可以 采用以下步驟：
[0042] (1)將乙腈與水按照體積比為1:1制成乙腈水溶液（以下簡稱乙腈水溶液），取他 達拉非原料藥適量，用乙腈水溶液振搖他達拉非使溶解，并用乙腈水溶液定量稀釋配制成 Iml含他達拉非0. 25mg的供試品溶液，即得到濃度為0. 25mg/ml的他達拉非溶液作為供試 品溶液，乙腈水溶液作為空白溶劑；
[0043] (2)色譜條件：采用高效液相色譜法，配備紫外檢測器；采用辛烷基鍵合硅膠柱作 為色譜柱，采用重量百分比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液作為流動相A，采用乙腈作為流動相 B，柱溫為35~42攝氏度，檢測波長為283~285nm，流速為0. 90~I. 10ml/min，進樣體積 為10 μ L，進行等度洗脫，其中，流動相A與流動相B的體積比為（50~65) : (50~35);
[0044] (3)取供試品溶液10 μ L，照上述色譜條件，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，理論板 數按他達拉非峰計算應不低于3000,按外標法以峰面積計算，得到樣品中他達拉非原料藥 及其制劑的含量。由此，能夠有效測定他達拉非原料藥及其制劑的含量，且準確度高、專屬 性強。
[0045] 根據本發明的實施例，高效液相色譜采用4. 6X250mm，5ym的Venusil ASB Ti C8 色譜柱，重量百分比為〇. 1 %的三氟乙酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B進行等度洗脫， 其中，流動相A與流動相B的體積比為（50~65) : (50~35)，柱溫為35~42攝氏度，檢測 波長為283~285nm，流速為0. 90~I. 10ml/min，進樣體積為10 yL。由此，可以有效實現 他達拉非與其異構體的有效分離，并且檢測結果具有顯著的精密度、穩定性和重復性，同時 較傳統的方法相比，采用本發明測定方法所得他達拉非的圖譜基線平穩且峰形對稱。
[0046] 根據本發明的另一個實施例，高效液相色譜采用4. 6X 250mm，5 μ m的Venusil ASB Ti C8色譜柱，重量百分比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B進行等度 洗脫，其中，流動相A與流動相B的體積比為55:45,柱溫為40攝氏度，檢測波長為285nm， 流速為I. 〇ml/min，進樣體積為10 μ L。由此，可以進一步提高他達拉非與其異構體的分離 效果。
[0047] 根據本發明的又一個實施例，高效液相色譜采用4. 6X250mm，5 μπι的Venusil ASB Ti C8色譜柱，重量百分比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液為流動相Α，乙腈為流動相B進行等度 洗脫，其中，流動相A與流動相B的體積比為50:50,柱溫為35攝氏度，檢測波長為283nm， 流速為〇. 90ml/min，進樣體積為10 μ L。由此，可以進一步提高他達拉非與其異構體的分離 效果。
[0048] 根據本發明的又一個實施例，高效液相色譜采用4. 6X250mm，5 μπι的Venusil ASB Ti C8色譜柱，重量百分比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液為流動相Α，乙腈為流動相B進行等度 洗脫，其中，流動相A與流動相B的體積比為58:42,柱溫為38攝氏度，檢測波長為285nm， 流速為I. 〇5ml/min，進樣體積為10 μ L。由此，可以進一步提高他達拉非與其異構體的分離 效果。
[0049] 根據本發明的又一個實施例，高效液相色譜采用4. 6X250mm，5 μπι的Venusil ASB Ti C8色譜柱，重量百分比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液為流動相Α，乙腈為流動相B進行等度 洗脫，其中，流動相A與流動相B的體積比為60:40,柱溫為42攝氏度，檢測波長為284nm， 流速為I. l〇ml/min，進樣體積為10 μ L。由此，可以進一步提高他達拉非與其異構體的分離 效果。
[0050] 根據本發明的又一個實施例，高效液相色譜采用4.6X250mm，5ym的ZORBAX SB-C8色譜柱，重量百分比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B進行等度 洗脫，其中，流動相A與流動相B的體積比為（50~65) : (50~35)，柱溫為35~42攝氏 度，檢測波長為283~285nm，流速為0. 90~I. 10ml/min，進樣體積為10 μ L。由此，可以進 一步提高他達拉非與其異構體的分離效果。
[0051] 根據本發明的又一個實施例，高效液相色譜采用4.6X250mm，5ym的ZORBAX SB-C8色譜柱，重量百分比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B進行等度 洗脫，其中，流動相A與流動相B的體積比為50:50,柱溫為35攝氏度，檢測波長為285nm， 流速為〇. 90ml/min，進樣體積為10 μ L。由此，可以進一步提高他達拉非與其異構體的分離 效果。
[0052] 根據本發明的又一個實施例，高效液相色譜采用4.6X250mm，5ym的ZORBAX SB-C8色譜柱，重量百分比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B進行等度 洗脫，其中，流動相A與流動相B的體積比為55:45,柱溫為40攝氏度，檢測波長為284nm， 流速為I. 〇ml/min，進樣體積為10 μ L。由此，可以進一步提高他達拉非與其異構體的分離 效果。
[0053] 根據本發明的又一個實施例，高效液相色譜采用4.6X250mm，5ym的ZORBAX SB-C8色譜柱，重量百分比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B進行等度 洗脫，其中，流動相A與流動相B的體積比為65:35,柱溫為38攝氏度，檢測波長為285nm， 流速為I. 〇5ml/min，進樣體積為10 μ L。由此，可以進一步提高他達拉非與其異構體的分離 效果。
[0054] 根據本發明的又一個實施例，高效液相色譜采用4.6X250mm，5ym的ZORBAX SB-C8色譜柱，重量百分比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B進行等度 洗脫，其中，流動相A與流動相B的體積比為60:40,柱溫為42攝氏度，檢測波長為285nm， 流速為I. l〇ml/min，進樣體積為10 μ L。由此，可以進一步提高他達拉非與其異構體的分離 效果。
[0055] 下面參考具體實施例，對本發明進行描述，需要說明的是，這些實施例僅僅是描述 性的，而不以任何方式限制本發明。
[0056] 實施例1
[0057] 檢測波長的確定：
[0058] 將乙腈與水按照體積比為1:1制成乙腈水溶液，然后用乙腈水溶液與他達拉非 原料藥振搖使其溶解，得到濃度為40 μ g/ml的他達拉非溶液，然后將他達拉非溶液在紫 外-可見分光光度計在190~400nm進行全掃描，他達拉非的紫外掃描圖分別見圖1所示。 由圖可知，他達拉非的最大吸收波長均為284nm，故選擇283~285nm作為檢測波長。
[0059] 實施例2
[0060] 色譜條件：
[0061] 高效液相色譜儀，配紫外檢測器，色譜柱：Venusil ASB Ti C8,4.6X250mm，5ym;
[0062] 采用重量百分比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液作為流動相A ;采用乙腈作為流動相B 進行等度洗脫，流動相A與流動相B的體積比為55:45 ;流速：1. 5mL/min ;檢測波長：285nm ; 柱溫：40°C ;進樣體積：20 μ L。
[0063] 實驗步驟：
[0064] 將乙腈與水按照體積比為1:1制成乙腈水溶液，取他達拉非原料藥適量，用乙腈 水溶液振搖他達拉非使溶解，并用乙腈水溶液定量稀釋配制成Iml含他達拉非0. 4mg的供 試品溶液，即得到濃度為0. 4mg/ml的他達拉非溶液作為供試品溶液，乙腈水溶液作為空白 溶劑；然后將10 μ L供試品溶液注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，樣品溶液HPCL圖譜如圖 2所示。
[0065] 由圖2可知，他達拉非溶液與異構體雜質未達到基線分離，且雜質峰型對稱性較 差。
[0066] 實施例3
[0067] 色譜條件：
[0068] 高效液相色譜儀，配紫外檢測器，色譜柱：Venusil ASB Ti C8,4.6X250mm，5ym;
[0069] 采用重量百分比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液作為流動相A ;采用乙腈作為流動相B 進行等度洗脫，流動相A與流動相B的體積比為55:45 ;流速：1. OmL/min ;檢測波長：285nm ; 柱溫：40 °C ;進樣體積：10 μ L ;
[0070] 實驗步驟：
[0071] 將乙腈與水按照體積比為1:1制成乙腈水溶液，取他達拉非原料藥適量，用乙腈 水溶液振搖他達拉非使溶解，并用乙腈水溶液定量稀釋配制成Iml含他達拉非0. 25mg的供 試品溶液，即得到濃度為0. 25mg/ml的他達拉非溶液作為供試品溶液，乙腈水溶液作為空 白溶劑；，然后將供試品溶液10 μ L，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，樣品溶液HPCL圖譜 如圖3所示。
[0072] 由圖3可知，在本發明的等度洗脫條件下，分析時間為lOmin，基線平穩且峰形對 稱，并且與實驗例2相比，采用本發明的方法所得他達拉非色譜峰中主峰與異構體雜質可 以達到良好的分離，且峰型好。
[0073] 實施例4
[0074] 檢測條件的驗證
[0075] (1)檢測限
[0076] 精密稱取他達拉非對照品（結構式如式2所示）適量，加體積比為1:1的乙腈水 溶液逐步稀釋得到對照品溶液，取對照品溶液10 μ L注入色譜儀，記錄色譜圖，當信噪比為 3時，他達拉非的最小檢出濃度為15mg/ml。
[0077] ⑵線性
[0078] 精密稱取他達拉非對照品適量，加體積比為1:1的乙腈水溶液分別定量稀釋 成 0· 1777mg/ml，0. 2031mg/ml，0. 2285mg/ml，0. 2539mg/ml，0. 2793mg/ml，0. 3047mg/ml， 0. 3301mg/ml的溶液，然后各取10 μ L溶液注入色譜儀，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標 進行線性回歸，該條曲線的線性回歸方程為Y = 18823. 6863Χ-29. 1143, R2= 0. 9999,線性 范圍為 0· 1777 ~0· 3301mg/ml。
[0079] (3)耐用性
[0080] 對照品溶液的配制：精密稱取他達拉非對照品12. 5mg置50ml量瓶中，加體積比為 1:1的乙腈水溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。
[0081] 供試品溶液的配制：精密稱取他達拉非原料12. 5mg置50ml量瓶中，加體積比為 1:1的乙腈水溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
[0082] 分別測定供試品溶液在實驗例3色譜條件下供試品的含量，當色譜條件有微小變 動（柱溫變化范圍為35~42攝氏度，所述有機相變化即流動相A與所述流動相B的體積 比為（50~65) : (50~35)，流速變化±0. 10ml/min，即流速為(λ 90~L lOml/min)，更換 色譜柱。在上述色譜條件下，分別精密量取對照品溶液和供試品溶液各l〇y L，注入液相色 譜儀，計算供試品的含量。該方法在柱溫變化范圍為35~42攝氏度時，含量測定RSD為 0. 2% ;該方法在有機相變化即流動相A與所述流動相B的體積比為（50~65) : (50~35) 時，含量測定RSD為0. 2%;該方法在流速變化±0. 10ml/min，即流速為0. 90~I. lOml/min 時，含量測定RSD為0. 3% ;更換色譜柱（ZORBAX SB-C85 μ m 4. 6*250mm)，含量測定RSD為 0. 6%，均符合對藥物含量測定的要求。
[0083] 實施例5
[0084] 色譜條件：同實驗例3 ;
[0085] 實驗步驟：
[0086] 將乙腈與水按照體積比為1:1制成乙腈水溶液，取他達拉非與乙腈水溶液混合， 得到濃度為0. 25mg/ml的他達拉非溶液作為供試品溶液，乙腈水溶液作為空白溶劑，分別 取他達拉非的異構體（結構式如式2所示）對照品適量，用乙腈水溶液溶解并用乙腈水溶 液定量稀釋制成濃度為〇. 25mg的雜質對照品溶液，然后分別取他達拉非溶液和雜質對照 品溶液各Iml置同一 100mL量瓶中，用乙腈水溶液稀釋至刻度，得到他達拉非和雜質對照品 混合溶液，然后將混合溶液注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，樣品溶液HPCL圖譜如圖4所 不。
[0087] 由圖4可知，他達拉非色譜峰中主峰與異構體雜質可以達到較好的分離，且峰形 好。
[0088] 實施例6
[0089] 色譜條件：同實驗例3 ;
[0090] 實驗步驟：
[0091] 將乙腈與水按照體積比為1:1制成乙腈水溶液，取他達拉非原料適量，加乙腈水 溶液溶解并稀釋制成2. 5mg/ml的樣品溶液作為溶液A ;
[0092] (1)氧化降解的樣品溶液配制：
[0093] 精密量取溶液A Iml置IOml量瓶中，然后移取1.0 ml的30%雙氧水（根據供試品 破壞難以程度選擇）置上述容量瓶中，45°C水浴破壞2h，用乙腈水溶液稀釋至刻度，搖勻即 得，作為氧化破壞降解溶液，然后將所得氧化破壞降解溶液注入高效液相色譜儀，記錄色譜 圖，樣品溶液HPCL圖譜如圖5所示。
[0094] (2)酸降解的樣品溶液配制：
[0095] 精密量取溶液A Iml置IOml量瓶中，加 lmol/L的鹽酸溶液2ml，99°C水浴破壞lh， 加 lmol/L氫氧化鈉溶液2ml，用乙腈水溶液稀釋至刻度，搖勻即得，作為酸降解溶液，然后 將所得酸降解溶液注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，樣品溶液HPCL圖譜如圖6所示。（3) 堿降解的樣品溶液配制：
[0096] 精密量取溶液A Iml置IOml量瓶中，加 lmol/L的氫氧化鈉溶液2ml，室溫放置 40min，加 lmol/L鹽酸溶液2ml，用乙腈水溶液稀釋至刻度，搖勻即得，作為堿降解溶液，然 后將所得堿降解溶液注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，樣品溶液HPCL圖譜如圖7所示。
[0097] 由圖5-7可知，采用本發明的方法的測定氧化破壞降解溶液、酸降解溶液和堿降 解溶液中他達拉非色譜峰中主峰與異構體雜質可以達到良好的分離，且基線平穩，峰形對 稱。
[0098] 實施例7
[0099] 色譜條件：
[0100] 高效液相色譜儀，配紫外檢測器，色譜柱：Venusil ASB Ti C8,4.6X250mm，5ym;
[0101] 采用重量百分比為0.1 %的三氟乙酸水溶液作為流動相A ;采用乙腈作為流動相 B進行等度洗脫，流動相A與流動相B的體積比為50:50 ;流速：0. 90mL/min ;檢測波長： 283nm ;柱溫：35°C ;進樣體積：10 μ L ;
[0102] 實驗步驟：同實施例3
[0103] 由圖8可知，在本發明條件下，所得他達拉非的圖譜基線平穩且峰形對稱，并且與 實驗例2相比，采用本發明的方法所得他達拉非色譜峰中主峰與異構體雜質可以達到良好 的分離，且峰型好。
[0104] 實施例8
[0105] 色譜條件：
[0106] 高效液相色譜儀，配紫外檢測器，色譜柱：Venusil ASB Ti C8,4.6X250mm，6ym;
[0107] 采用重量百分比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液作為流動相A ;采用乙腈作為流動相 B進行等度洗脫，流動相A與流動相B的體積比為58:42 ;流速：1. 05mL/min ;檢測波長： 285nm ;柱溫：38°C ;進樣體積：10 μ L ;
[0108] 實驗步驟：同實施例3
[0109] 在本發明條件下，所得他達拉非的圖譜基線平穩且峰形對稱，并且與實驗例2相 比，采用本發明的方法所得他達拉非色譜峰中主峰與異構體雜質可以達到良好的分離，且 峰型好。
[0110] 實施例9
[0111] 色譜條件：
[0112] 高效液相色譜儀，配紫外檢測器，色譜柱：Venusil ASB Ti C8,4.6X250mm，5ym;
[0113] 采用重量百分比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液作為流動相A ;采用乙腈作為流動相 B進行等度洗脫，流動相A與流動相B的體積比為60:40 ;流速：1. lOmL/min ;檢測波長： 284nm ;柱溫：42°C ;進樣體積：10 μ L ;
[0114] 實驗步驟：同實施例3
[0115] 在本發明條件下，所得他達拉非的圖譜基線平穩且峰形對稱，并且與實驗例2相 比，采用本發明的方法所得他達拉非色譜峰中主峰與異構體雜質可以達到良好的分離，且 峰型好。
[0116] 實施例10
[0117] 色譜條件：
[0118] 高效液相色譜儀，配紫外檢測器，色譜柱：ZORBAX SB-C8,4. 6X250mm，5 μπι;
[0119] 采用重量百分比為0.1 %的三氟乙酸水溶液作為流動相A ;采用乙腈作為流動相 B進行等度洗脫，流動相A與流動相B的體積比為50:50 ;流速：0. 90mL/min ;檢測波長： 285nm ;柱溫：35°C ;進樣體積：10 μ L ;
[0120] 實驗步驟：同實施例3
[0121] 在本發明條件下，所得他達拉非的圖譜基線平穩且峰形對稱，并且與實驗例2相 比，采用本發明的方法所得他達拉非色譜峰中主峰與異構體雜質可以達到良好的分離，且 峰型好。
[0122] 實施例11
[0123] 色譜條件：
[0124] 高效液相色譜儀，配紫外檢測器，色譜柱：ZORBAX SB-C8,4. 6X250mm，5 μπι;
[0125] 采用重量百分比為0.1 %的三氟乙酸水溶液作為流動相A ;采用乙腈作為流動相B 進行等度洗脫，流動相A與流動相B的體積比為55:45 ;流速：1. OmL/min ;檢測波長：284nm ; 柱溫：40 °C ;進樣體積：10 μ L ;
[0126] 實驗步驟：同實施例3
[0127] 在本發明條件下，所得他達拉非的圖譜基線平穩且峰形對稱，并且與實驗例2相 比，采用本發明的方法所得他達拉非色譜峰中主峰與異構體雜質可以達到良好的分離，且 峰型好。
[0128] 實施例12
[0129] 色譜條件：
[0130] 高效液相色譜儀，配紫外檢測器，色譜柱：ZORBAX SB-C8,4. 6X250mm，6 μπι;
[0131] 采用重量百分比為0.1 %的三氟乙酸水溶液作為流動相A ;采用乙腈作為流動相 B進行等度洗脫，流動相A與流動相B的體積比為65:35 ;流速：1. 05mL/min ;檢測波長： 285nm ;柱溫：38°C ;進樣體積：10 μ L ;
[0132] 實驗步驟：同實施例3
[0133] 由圖9可知，在本發明條件下，所得他達拉非的圖譜基線平穩且峰形對稱，并且與 實驗例2相比，采用本發明的方法所得他達拉非色譜峰中主峰與異構體雜質可以達到良好 的分離，且峰型好。
[0134] 實施例13
[0135] 色譜條件：
[0136] 高效液相色譜儀，配紫外檢測器，色譜柱：ZORBAX SB-C8,4. 6X250mm，5 μπι;
[0137] 采用重量百分比為0.1 %的三氟乙酸水溶液作為流動相A ;采用乙腈作為流動相 B進行等度洗脫，流動相A與流動相B的體積比為60:40 ;流速：1. lOmL/min ;檢測波長： 285nm ;柱溫：42°C ;進樣體積：10 μ L ;
[0138] 實驗步驟：同實施例3
[0139] 在本發明條件下，所得他達拉非的圖譜基線平穩且峰形對稱，并且與實驗例2相 比，采用本發明的方法所得他達拉非色譜峰中主峰與異構體雜質可以達到良好的分離，且 峰型好。
[0140] 在本說明書的描述中，參考術語"一個實施例"、"一些實施例"、"示例"、"具體示 例"、或"一些示例"等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特 點包含于本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不 一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任何 的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。
[0141] 盡管上面已經示出和描述了本發明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例 性的，不能理解為對本發明的限制，本領域的普通技術人員在不脫離本發明的原理和宗旨 的情況下在本發明的范圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。
【主權項】
1. 一種利用高效液相色譜分析他達拉非的方法，其特征在于，所述高效液相色譜： 采用辛烷基鍵合硅膠柱為色譜柱； 采用重量百分比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液作為流動相A ;以及 米用乙臆作為流動相B， 其中，進樣流速為〇. 90~1. 10ml/min。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，檢測波長為283~285nm。3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述色譜柱的柱溫為35~42攝氏度。4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述色譜柱的柱溫為40攝氏度。5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述進樣流速為1.0ml/min。6. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述辛烷基鍵合硅膠柱為Venusil ASB Ti C8色譜柱或ZORBAX SB-C8色譜柱。7. 根據權利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于，所述高效液相色譜采用 4. 6X250mm，5ym的Venusil ASB Ti C8色譜柱，重量百分比為0. 1%的三氟乙酸水溶液為 流動相A，乙腈為流動相B進行等度洗脫，其中，所述流動相A與所述流動相B的體積比為 (50~65) : (50~35)，柱溫為35~42攝氏度，檢測波長為283~285nm，流速為0. 90~ 1. 10ml/min，進樣體積為 10yL。8. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述高效液相色譜采用4. 6 X 250mm，5 μ m 的Venusil ASB Ti C8色譜柱，重量百分比為0.1 %的三氟乙酸水溶液為流動相A，乙腈為 流動相B進行等度洗脫，其中，所述流動相A與所述流動相B的體積比為55:45,柱溫為40 攝氏度，檢測波長為285nm，流速為1. 0ml/min，進樣體積為10 μ L， 任選地，所述高效液相色譜采用4. 6X250mm，5ym的Venusil ASB Ti C8色譜柱，重量 百分比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B進行等度洗脫，其中，流動相 A與流動相B的體積比為50:50,柱溫為35攝氏度，檢測波長為283nm，流速為0. 90ml/min， 進樣體積為10 μ L， 任選地，所述高效液相色譜采用4. 6X250mm，5ym的Venusil ASB Ti C8色譜柱，重量 百分比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B進行等度洗脫，其中，流動相 △與流動相8的體積比為58:42，柱溫為38攝氏度，檢測波長為28511111，流速為1.051111/1^11， 進樣體積為10 μ L， 任選地，所述高效液相色譜采用4. 6X250mm，5ym的Venusil ASB Ti C8色譜柱，重量 百分比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B進行等度洗脫，其中，流動相 A與流動相B的體積比為60:40,柱溫為42攝氏度，檢測波長為284nm，流速為1. 10ml/min， 進樣體積為10 μ L。9. 根據權利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于，所述高效液相色譜采用 4. 6 X 250mm，5 μ m的ZORBAX SB-C8色譜柱，重量百分比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液為流動 相A，乙腈為流動相B進行等度洗脫，其中，所述流動相A與所述流動相B的體積比為（50~ 65) : (50~35)，柱溫為35~42攝氏度，檢測波長為283~285nm，流速為0. 90~1. 10ml/ min，進樣體積為10 μ L。10. 根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述高效液相色譜采用4. 6X250mm， 5. m的ZORBAX SB-C8色譜柱，重量百分比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液為流動相A，乙腈為流 動相B進行等度洗脫，其中，所述流動相A與所述流動相B的體積比為55:45,柱溫為40攝 氏度，檢測波長為284nm，流速為1.0ml/min，進樣體積為10 μ L， 任選地，所述高效液相色譜采用4. 6 X 250mm，5 μ m的ZORBAX SB-C8色譜柱，重量百分 比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B進行等度洗脫，其中，流動相A與 流動相B的體積比為50:50,柱溫為35攝氏度，檢測波長為285nm，流速為0. 90ml/min，進樣 體積為10 μ L， 任選地，所述高效液相色譜采用4. 6 X 250mm，5 μ m的ZORBAX SB-C8色譜柱，重量百分 比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B進行等度洗脫，其中，流動相A與 流動相B的體積比為65:35,柱溫為38攝氏度，檢測波長為285nm，流速為1. 05ml/min，進樣 體積為10 μ L， 任選地，所述高效液相色譜采用4. 6 X 250mm，5 μ m的ZORBAX SB-C8色譜柱，重量百分 比為0. 1 %的三氟乙酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B進行等度洗脫，其中，流動相A與 流動相B的體積比為60:40,柱溫為42攝氏度，檢測波長為285nm，流速為1. 10ml/min，進樣 體積為10 μ L。
【文檔編號】G01N30/16GK105842365SQ201510247342
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2015年5月14日
【發明人】王學海, 史芳, 許勇, 楊仲文, 李莉娥, 周麗, 夏慶豐, 余艷平, 黃璐, 田華, 何珩, 肖強, 于靜, 楊菁, 張毅, 唐靜, 周文
【申請人】湖北生物醫藥產業技術研究院有限公司