一種肌醇檢測方法
【專利摘要】本發明的方法取血漿樣品與無水乙醇混合后，加入樣品濃縮玻璃管后，放入Biotage TurboVapLV多樣品自動濃縮儀，調節氮氣發生器產生60Psi壓力的氮氣，10分鐘后樣品氮吹至干后，加入5mL硅烷化試劑，70℃水浴中衍生反應1h，取出冷卻至室溫，加入5mL正己烷和10mL飽和NaCl，渦旋混勻，轉移到50mL離心管中，6000rmp離心5min，取上清液用同樣的方法，氮吹至干，正己烷定容至1mL。將人類血漿樣品及肌醇標準品進行衍生化，并進行了衍生化技術的優化，凈化提取后采用氣相色譜質譜儀進行分析，使檢測結果準確，樣本體積最小；可應用于出生缺陷神經管畸形的血漿樣本的檢測。
【專利說明】
一種肌醇檢測方法
技術領域
[0001] 本發明屬于應用基礎醫學研究領域，涉及氣相色譜-質譜聯用技術在檢測血漿肌 肉肌醇水平中的應用。
【背景技術】
[0002] 肌醇，又稱環己六醇，是一種無色、水溶性、味甜，耐酸、堿及熱的環己烷的多元烴 基衍生物。在自然界肌肉肌醇(myo - inos i to I，MI)的分布最為廣泛。在人體內，肌醇除了來 源于食物外，也可以由6-磷酸葡萄糖經肌醇合成關鍵酶作用在腦、睪丸及腎臟組織內合成。 大部分肌醇存在于腦、心肌和骨骼肌中。正常人腦組織中肌醇含量為血液中含量的200倍。 在細胞內，肌醇通過磷酸化與去磷酸化反應形成帶有不同磷酸基團的肌醇衍生物，參與不 同的生物代謝途徑，行使其功能，另一方面，細胞內的肌醇通過磷脂酸肌醇信號傳導途徑， 參與體內多種生化過程。已經有報道，在人體內MI代謝紊亂與多種臨床疾病有關，包括神經 管畸形、阿爾茨海默病、糖尿病引起的腎小球疾病等。補充肌醇在治療精神疾病，緩解絕經 后的代謝綜合征等方面有一定的效果。因此準確的檢測體內肌醇水平對于臨床肌醇紊亂相 關疾病的診療具有一定意義。
[0003] 有關文獻報道的MI檢測多適用于肌醇制劑和保健食品，常用的測定方法有重量 法、高鵬酸鉀氧化法、微生物法、High Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry(HPLC/MS)法和Gas Chromatography Mass Spectrometer(GC/MS)法等。重量 法測定時所需樣本量大、萃取劑為毒性較大的氯仿，容易污染環境;高碘酸鉀氧法則要嚴格 控制加熱氧化的時間，否則測定結果將會有很大誤差;微生物法的步驟比較繁瑣、費時，并 且由于需要細菌培養，使得檢測容易受到生物降解物，鹽類以及其他化合物的干擾。HPLC/ MS法與以上方法相比，無論從所需樣本量，檢測的準確性還是檢測速度方面均表現出明顯 的優勢，但液相色譜的分離效果較氣象色譜差，測試結果的誤差較大，且保留時間較長。GC/ MS法是將肌醇硅烷化處理后測定，目前嬰幼兒食品和乳品肌醇測定的國家標準方法即采用 氣象GC/MS法。但生物樣本中肌醇的檢測尚無國家標準方法。在嬰幼兒食品和乳品肌醇測定 的國家標準方法中，待測物質在有水的情況下進行衍生化反應，硅烷化試劑直接與水反應， 對于基質復雜的血漿樣本來說，造成衍生化效率低，影響檢測結果。
[0004] 如上所述，雖GC/MS法是目前比較公認的能夠精確檢測肌醇的方法，但對于血漿等 復雜基質的生物樣本，尚缺乏準確、快速、穩定的準確方法。同時由于血漿樣本的特殊性，檢 測所需的樣本體積，樣本的存放時間等因素均可影響檢測方法在臨床的適用性。本發明是 在已建立的GC/MS檢測混合血漿肌醇方法基礎上進一步改進，以便更好地應用于臨床樣本 的的檢測，迄今尚未見有相關報道。本發明的目的是，提供一種適用于臨床檢測的快速、準 確、穩定的檢測血漿肌醇的方法。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種肌醇檢測方法，其可以解決現有技術中的分離和定量結 果不穩定，檢測較慢的缺點。
[0006] 本發明采用以下技術方案：
[0007] 一種肌醇檢測方法，包括以下步驟：
[0008] 樣品處理步驟：取血漿樣品與無水乙醇混合后，加入樣品濃縮玻璃管后，放入 Biotage TurboVapLV多樣品自動濃縮儀，調節PerMuta氮氣發生器產生60Psi壓力的氮氣， I 〇分鐘后樣品氮吹至干后，加入5mL硅烷化試劑，70 °C水浴中衍生反應Ih (每I Omin取出震蕩 一次），取出冷卻至室溫，加入5mL正己烷和IOmL飽和NaCl，渦旋混勻，轉移到50mL離心管中， 6000rmp離心5min，取上清液用同樣的方法，氮吹至干，正己燒定容至lmL。
[0009] 血衆樣品的體積為30yL，無水乙醇的體積為I OmL。
[0010]還包括以下步驟:采用不分流式進樣模式，分流比50:1，進樣口溫度為240°C，檢測 器溫度為250°C，后運行溫度為270°C，后運行時間為1分鐘，傳輸口溫度為270°C，氣相與質 譜接口溫度為280°C;四級桿溫度150°C，離子源溫度230°C。以高純度氦氣為載氣，流速為 lmL/min;進樣量為IyL，肌醇衍生物的保留時間為7.2分鐘，溶劑延遲時間為5分鐘。
[0011] 以電子轟擊為離子源，電子轟擊能量為70eV，采用全掃描離子采集方式，通過離子 豐度比來確定待測化合物與譜圖庫中譜圖的匹配度，進行定性，掃描時間為5min后，掃描范 圍：12.00-650.OOamu，采用選擇離子采集方式進行定量。
[0012] 將人類血漿樣品及肌醇標準品與硅烷化試劑進行衍生化，并進行了衍生化技術的 優化，凈化提取后采用氣相色譜質譜儀進行分析，將定量檢測系統的線性、檢測線、定量線、 回收率、日間及日內差異判斷方法的準確度、靈敏度和穩定性與金標準的同位素稀釋法進 行了比較，同時在檢測體積上進行了優化，使檢測結果準確，樣本體積達到最小；且可應用 于出生缺陷神經管畸形的血漿樣本的檢測。
【附圖說明】
[0013] 下面結合實施例和附圖對本發明進行詳細說明，其中：
[0014] 圖IA是本發明的血漿肌醇衍生物在選擇離子檢測模式下的色譜圖，
[0015] 圖IB為本發明的全掃模式總離子流圖。
【具體實施方式】
[0016] 下面結合附圖進一步闡述本發明的【具體實施方式】：
[0017] 1.實驗試劑、材料和儀器、
[0018] 肌醇（Inositol，美國Sigma公司，產品編號：15125);無水乙醇（Alcohol Anhydrous，色譜純，美國Tedia試劑公司，產品編號:ASl 131-001 )、正己燒(n-Hexan，色譜 純，美國Tedia公司，產品編號：HA1722-001);三甲基氯硅烷(Chlorotrimethylsilane，美國 Alfa Aesar公司，產品編號75-77-4)、六甲基二硅胺烷（美國Alfa Aesar公司，產品編號 999-97-3) ;N，N-二甲基甲酰胺(N，N-N,N-Dimethylformamide，分析純，上海麥克林生化科 技有限公司，產品編號N807505);高純度氦氣(北京綠氧天里科技開發有限公司），硅烷化試 劑:分別取體積比為1:2:8的三甲基氯硅烷、六甲基二硅胺烷、N，N-二甲基甲酰胺，超聲至澄 清。
[0019] 7890A型氣相色譜儀，配備5975C質譜儀（美國Agilent公司）；DB-5MS(柱長30m，內 徑O · 25mm，膜厚0·25μηι，美國 Agilent 公司）；Avant i J-30I 高效離心機（美國 Beckman Coulter公司）；R_215V旋轉蒸發儀(瑞士BUCHI公司）；Biotage TurboVapLV多樣品自動濃縮 儀（英國Biotage公司）！PerMuta氮氣發生器。
[0020] 2.樣本前處理
[0021]取3OyL血漿樣品與I OmL無水乙醇混合后，加入樣品濃縮玻璃管（英文名稱： Disposable Culture Tube)后，放入Biotage TurboVapLV多樣品自動濃縮儀，調節PerMuta 氮氣發生器產生60Psi壓力的氮氣，10分鐘后樣品氮吹至干后，加入5mL硅烷化試劑，70 °C水 浴中衍生反應Ih(每IOmin取出震蕩一次），取出冷卻至室溫，加入5mL正己烷和IOmL飽和 NaCl，禍旋混勾，轉移到50mL離心管中，6000rmp離心5min，取上清液用同樣的方法，氮吹至 干，正己烷定容至ImL，上機檢測。
[0022]本發明的樣品前處理過程，以40個樣本為單位技術，提取需要10分鐘，衍生化需要 60分鐘，再提取的過程為25分鐘，這樣總共需要95分鐘，每個樣本不到2分半，加上質譜的 7.2分鐘。一個樣本在10分鐘內可以完成全部的檢測。同時30ul血漿可以滿足檢測需要，使 得這個方法很適用于臨床樣本的檢測。
[0023]本發明通過優化前處理步驟和過程，在樣本檢測的整個過程中，因為色譜分離過 程只能完成前一個樣本分離檢測后，才能進行下一個樣本的檢測。因此，縮短樣本的前處理 時間對于加快檢測速度就顯得至關重要。因此本發明方法大大縮短了樣本的處理時間，使 樣本可以在短時間內完成檢測。
[0024] 3.色譜與質譜條件參數
[0025] 采用不分流式進樣模式，分流比50:1。進樣口溫度為240°C，檢測器溫度為250°C， 后運行溫度為270°C，后運行時間為1分鐘，傳輸口溫度為270°C。氣相與質譜接口溫度為280 °C ;四級桿溫度150°C，離子源溫度230°C。以高純度氦氣為載氣，流速為lmL/min;進樣量為1 yL，升溫程序見表1此條件下，肌醇衍生物的保留時間為7.2分鐘，溶劑延遲時間為5分鐘，如 圖IA所示。
[0026]表1血漿肌醇檢測的色譜升溫程序
[0028]以電子轟擊（EI)為離子源，電子轟擊能量為70eV。采用全掃描離子采集方式 (SCAN)，通過離子豐度比來確定待測化合物與譜圖庫中譜圖的匹配度，進行定性，掃描時間 為5min后，掃描范圍：12.00-650.0 Oamu。采用選擇離子采集方式(SIM)方式進行定量。肌醇 衍生物的母離子質量數為612. lm/z，子離子質量數為73. lm/z、147.0m/z、217. lm/z、 305. lm/z，定量離子為73. lm/z，如圖IB所示。
[0029] 4、檢測方法的線性、靈敏度和準確性
[0030]由于血漿中含有肌醇，且找不到完全空白血漿，因此本發明采用混合血漿樣品作 為空白血漿進行加標實驗，并用實驗結果所得峰面積扣除空白血漿的峰面積即為加標肌醇 的峰面積，以此來對實驗中各項參數的優化進行考核。取500mg/L肌醇標準品水溶液進行衍 生化后，得到2m g//L的肌醇標準品衍生化產物。將混合血漿樣本進行前處理衍生化后，加入 不同量的肌醇標準品衍生化產物，使得肌醇標準品衍生化產物的濃度為20yg/L，50yg/L， 100yg/L，200yg/L和500yg/L.在選定的色譜條件和質譜條件下進行測定，以提取離子色譜 圖的峰面積(Y)為縱坐標，質量濃度(X)為橫坐標進行線性分析，線性方程為：Y=1.12 X 104Χ+1·04 XIO6，r2 = 0·9995，LOD為2·Oyg/L，LOQ為5·Oyg/L。
[0031 ] 分別取濃度為1.6mg/L，3.2mg/L和6.4mg/L的加入標準品的混合血衆樣品作為質 控樣本計算日內、日間差異及回收率。每個濃度分別取9例，在同一天的3個不同時間點測定 質控樣本肌醇水平來評價本發明的日內差異。連續5天檢測在同一時間檢測質控樣本肌醇 水平來評價本發明的日間差異，如表2所示。
[0032]表2質控血漿樣本的精確度和回收率
[0034]為了驗證本方法的靈敏度，專利將本方法與同位素稀釋內標法進行對比，將質控 血漿樣本分別加入不同含量的肌醇標品，分別用專利方法與同位素稀釋法進行檢測，此外 隨機挑選3份臨床血漿樣本，每份樣本等分為2份，同樣分別用兩種方法進行檢測，結果見表 3，由此可見專利方法與"金標準"的同位素稀釋方法的結果無顯著差異。
[0035]表3同位素內標方法與本專利外標法檢測血漿肌醇的結果比較
[0038] 5、樣本檢測體積的優化
[0039] 在同一份混合血漿樣本中，分別取IOyL，30yL，50yL，70yL，分別進行前處理并檢測 MI水平。當檢測體積為30yL或以上時，檢測結果的峰面積正比于樣本體積，故30yL為本發明 所需的最小檢測體積，如表4所示。
[0040]表4血漿肌醇檢測體積的優化
[0042]綜上所述，本發明建立的氣象色譜-質譜聯用檢測血漿肌醇水平的方法，準確、穩 定、快速、簡便，是一種較為理想的用于臨床檢測的方法，與其它方法相比，保留時間短，所 需樣本量少，因此可為臨床與肌醇水平相關疾病的診療提供檢測的技術平臺，也為研究肌 醇缺乏在疾病中的機制研究提供了檢測基礎。
[0043] 本方法通過優化前處理中的提取過程，用硼硅管進行前處理，使前處理過程可批 量進行，大大加快了檢測速度。具體如下：前處理包括3個步驟:提取(extraction)，衍生化 (derivatization)，再提取(reextraction);把提取的過程進行了優化，通過硼娃管氮吹， 一個樣本需要10分鐘左右，可以40個樣本一起做，一個樣本就只用0.25分鐘，大大節省了時 間，可以滿足臨床大量樣本的檢測。
[0044] 使用本發明檢測方法與同位素內標檢測方法進行比較，檢測結果的一致性好，說 明本方法具有較高的靈敏度和準確性，可以準確的檢測臨床樣本血漿肌醇的水平。
[0045] 運用本發明的方法，只需30微升的血漿樣本即可以完成肌醇含量的檢測。在前期 建立的檢測方法只是在其他條件上進行了優化，并沒有將樣本的體積進行優化，為了便于 臨床檢測，減輕病人痛苦，進行了樣本檢測體積的優化，采集被檢者的末梢血可以滿足檢測 需要。與采集靜脈血相比，末梢血可以減輕受檢者的痛苦，方便嬰幼兒受檢者進行檢查，提 高了方法的可操作性。
[0046] 本發明通過氣質聯用有效結合既充分利用氣象色譜的快速分離能力，又發揮了質 譜的定性專長，優勢互補，可以得到較滿意的分離和定量結果。相比既往重量法、高碘酸鉀 氧化法、微生物法、HPLC/MS方法，結果更為準確可信。
[0047]以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精 神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種肌醇檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： 樣品處理步驟:取血漿樣品與無水乙醇混合后，加入樣品濃縮玻璃管后，放入Biotage TurboVapLV多樣品自動濃縮儀，調節PerMuta氮氣發生器產生60Psi壓力的氮氣，10分鐘后 樣品氮吹至干后，加入5mL硅烷化試劑，70 °C水浴中衍生反應lh，取出冷卻至室溫，加入5mL 正己燒和10mL飽和NaCl，禍旋混勾，轉移到50mL離心管中，6000rmp離心5min，取上清液用同 樣的方法，氮吹至干，正己燒定容至lmL。2. 根據權利要求1所述的肌醇檢測方法，其特征在于，血漿樣品的體積為30yL，無水乙 醇的體積為10mL。3. 根據權利要求1所述的肌醇檢測方法，其特征在于，還包括以下步驟:采用不分流式 進樣模式，分流比50:1，進樣口溫度為240°C，檢測器溫度為250°C，后運行溫度為270°C，后 運行時間為1分鐘，傳輸口溫度為270°C，氣相與質譜接口溫度為280°C ;四級桿溫度150°C， 離子源溫度230°C。以高純度氦氣為載氣，流速為lmL/min;進樣量為lyL，肌醇衍生物的保留 時間為7.2分鐘，溶劑延遲時間為5分鐘。4. 根據權利要求3所述的肌醇檢測方法，其特征在于，還包括以下步驟：以電子轟擊為 離子源，電子轟擊能量為70eV，采用全掃描離子采集方式，通過離子豐度比來確定待測化合 物與譜圖庫中譜圖的匹配度，進行定性，掃描時間為5min后，掃描范圍：12.00-650.OOamu， 采用選擇離子采集方式進行定量。
【文檔編號】G01N30/06GK105842356SQ201610169620
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月23日
【發明人】張霆, 郭金, 王建華, 張峰, 李偉清, 牛勃
【申請人】張霆, 郭金, 王建華, 張峰, 李偉青, 牛勃