胃癌脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法
【專利摘要】本發明公開了一種胃癌脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法，包括以下步驟：樣品收集；納米磁珠預處理；樣品預處理；唾液樣品洗脫上樣；質譜分析；數據采集；數據分析；建立診斷模型。本發明運用WCX與MALDI?TOF?MS蛋白質組學技術，基于唾液蛋白質組開展胃癌脾虛證病證結合分子診斷研究，發現胃癌脾虛證與非脾虛證比較，有6個差異蛋白峰具有統計學意義。胃癌脾虛證與正常對照組對比，共有106個差異蛋白質峰有統計學意義，其中有101個蛋白峰差異具有非常顯著性意義，其中，26個質峰在脾虛證組表達下調，80個質峰在脾虛證組表達上調。
【專利說明】
胃癌脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法
技術領域
[0001 ]本發明屬于蛋白質譜應用技術領域，具體地說，涉及一種胃癌脾虛證唾液蛋白指 紋圖譜分子診斷模型建立方法。
【背景技術】
[0002] 胃癌為本虛標實之證，以痰凝、氣滯、血瘀、邪熱為標，脾虛為本]。脾胃虛弱是胃癌 發生、發展的基礎，存在于胃癌前疾病-癌前病變-胃癌的整個過程。脾虛失運可致痰飲內 生，痰濕交阻易在局部結聚形成腫塊，且痰飲隨氣流行，機體內外無所不至，以致腫瘤易于 復發、轉移。江澄等對500例胃癌患者進行調查，結果顯示胃癌手術前后單一證型以胃癌所 占的比率最多。趙群等根據中醫辨證標準，將102例患者分為胃癌無脾虛證和有脾虛證兩 組，分析統計脾虛證的有無與胃癌浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移以及ΡΩ#分期等生物學 行為的關系，結果顯示胃癌患者脾虛證與其臨床生物學行為之間有密切的關系，脾虛證患 者的預后比非脾虛證患者差。
[0003] 病證結合已經成為現代中西醫結合臨床的主要模式。鑒于不同疾病的特征性病理 實質不同，開展病證結合的證候診斷客觀化研究是十分必要的。脾虛是中醫臨床最常見的 基本證候之一，也是胃癌的重要病機和常見證候。
[0004] 唾液檢測的應用已廣泛應用于感染性疾病、內分泌疾病等各系統疾病的研究，尤 其是在各系統腫瘤診斷、病情變化監測、臨床分期、療效監測等方面具有巨大的應用前景。 唾液中含有大量蛋白質，而蛋白質是生命活動的執行者和體現者，因而不同的疾病有蛋白 質組學水平上的差異。已有研究證明，唾液中含有HP(HP感染是胃炎、胃癌的重要病因 ）、HP 抗體IgG、硫酸還原菌（SRP)、KYNA(具有抗結腸癌作用）等180種生物標志物。質譜蛋白質組 學技術的發展促進了唾液生物標志物的探索進程。
[0005] 目前MALDI-T0F蛋白質組學技術已較多應用于胃癌的病因、診斷、治療、預后以及 是否發生轉移的判斷等多方面的研究。Ding Y發現胃上皮AGS細胞癌變與EBV病毒感染有 關;Oya-Ito T通過該技術發現熱休克蛋白27的翻譯后修飾在胃腸腫瘤上皮細胞損傷的過 程中發揮著重要的作用;Repetto 0等發現胃癌與自身免疫性胃炎存在27個差異蛋白點；南 蛇藤可使胃癌患者HSP蛋白表達顯著下調，而過度表達的HSP蛋白也可降低南蛇藤的療效； Bal Iuf f B等研究發現HNP-I、S100-A6可進一步用來區分早期胃癌（UICC-I)和晚期胃癌 (UICC-II和III)，而CRIPl則為一個新型、有效且獨立的腫瘤預后因子。ZhangF等發現 TRAKl/MGb2-Ag可作為診斷胃印戒細胞癌和粘液腺癌的生物標志物。與親代細胞系相比，順 鉑耐藥細胞系，PK_M2(丙酮酸激酶-M2)蛋白表達和活性水平均降低，而使用反義寡核苷酸 抑制PK-M2表達可進一步增加細胞對順鉑的耐藥性。PAR-I-直參與胃腸道炎癥、腫瘤細胞 生長和胃癌細胞的入侵，據研究，在華裔受試者中，PAR-IIVSn-HT等位基因的表達是發生 幽門螺旋桿菌相關型胃癌的風險因素之一，而PAR-1-506ins/del基因的多態性則沒有參與 胃癌過程。胃癌患者胃癌組著和血衆中的AGP(alpha-l_acid glycoprotein)水平均表達增 高。胃癌患者15-PGDH與C0X-2表達承負相關，并與胃癌的??Μ分期、淋巴結轉移密切相關。胃 癌組織中CLICl過度表達，實驗證明，胃癌患者體內CLICl低表達者5年生存率明顯高于高表 達者，因而CLICl可作為判斷胃癌預后的重要分子。胃癌存在β-cat異常表達，檢測β-cat的 表達可作為判斷胃癌分化、浸潤、轉移和預后的良好參考指標。環氧化酶-2(C0X-2)和基質 金屬蛋白酶-9(MMP_9)表達與胃癌的生物學行為密切相關。可作為反映胃癌浸潤、轉移和預 后的重要指標。
[0006] 因此，提供一種診斷模型簡便、快速、標本用量少，靈敏度高，特異性好的胃癌脾虛 證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型的建立方法，就成為該技術領域急需解決的技術難題。
【發明內容】
[0007] 有鑒于此，本發明所要解決現有方法對于胃癌脾虛證的診斷復雜，診斷時間長， 靈敏度低，特異性差的問題，提供了一種胃癌脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立 方法。
[0008] 為了解決上述技術問題，本發明公開了一種胃癌脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診 斷模型建立方法，包括以下步驟：
[0009] (1)樣品收集；
[0010] (2)納米磁珠預處理；
[0011] (3)樣品預處理:取出冷凍保存的唾液樣品，冰上解凍，所有唾液樣品均1次凍融， 取5μ1唾液樣品加入?ομL的U9裂解液，混合孵育30min后，加入185μ1的Wash Buffer稀釋（唾 液最終上樣量為2.5μ1);
[0012] (4)唾液樣品洗脫上樣:③向每個裝有納米磁珠的PCR管中分別加入100μΙ預處理 后的唾液樣品，混勻，置于室溫孵育30min，將所述PCR管置于磁鐵上孵育lmin，去除上清液； ④每管加入100μΙ的Wash Buffer洗脫5min，然后將所述PCR管置于磁鐵上孵育Imin，去除上 清液;再重復步驟④操作一次，以洗脫更干凈，獲得較純的目的蛋白；⑤在所述PCR管中加入 10μ1的Elution Buffer洗脫5min，將所述PCR管置于磁鐵上孵育lmin，取5μ1上清液移至另 一個PCR管中；⑥將裝有5μ1上清液的PCR管中加入5μ1的CHCA飽和溶液，充分混勻，至樣品顏 色發灰，而沒有明顯的沉淀時，取2μ1混合溶液，加樣到Au/Steel芯片上，晾干后放入儀器讀 取；
[0013] (5)質譜分析:采用質譜儀讀取所述Au/Steel芯片信息，設置激光強度為190,靈敏 度為5;
[0014] (6)數據采集；
[0015] (7)數據分析；
[0016] (8)建立診斷模型：用Biomarker Pattern Software 5.0.2采用決策樹算法計算 出多個變量變化對兩樣本的判別價值，確定最佳的診斷模型。
[0017] 進一步的，所述步驟（1)樣品收集的方法為：胃癌脾虛證組和正常對照組在取材前 一天晚上臨睡前清水漱口，之后不再進食任何食物和藥物，于第二天晨起后漱口前采用非 刺激性唾液采集方式空腹取材，前5min內的唾液自然吞下后開始收集，收集到的唾液置于 冰浴中的15ml唾液離心管內，4°C下靜置Ih后，3000r/min、4°C下離心10min，冰浴上分裝在 Iml的EP管中，每管200μ1，于-80 °C冰箱冷凍保存備用。
[0018] 進一步的，所述步驟(2)納米磁珠預處理的方法為:①取WCX納米磁珠50μ1加入到 200μ1的PCR管中，置于磁鐵上孵育Imin，去除上清液;②再加入100μΙ的Wash Buffer洗脫 5min，在磁鐵上孵育Imin，去除上清液;再重復步驟②操作一次，這樣洗脫更干凈，質譜檢測 受到干擾的可能性會更少。
[0019] 進一步的，所述步驟(6)數據采集的方法為：用Ciphergen Proteinchip Software 3.2.1軟件采集數據，縱坐標為峰強度，橫坐標為蛋白質質荷比，收集數據的質荷比范圍為 2000~25000m/z，信號收集位置40~60,平均每點收集20次，收集總點為100次，已知多肽標 準芯片標準，激光離子流0.5。
[0020] 進一步的，所述步驟（7)數據分析的方法為：對位于2000~25000m/z峰值，用 Biomarker Wizard軟件過濾噪音;設置初始的噪音過濾值為5，二次信噪比為2，以10%為最 小閾值進行聚類，經上述數據預處理后，采用t檢驗比較所述胃癌脾虛證組和所述正常對照 組唾液蛋白質質譜數據，找出所述胃癌脾虛證組和所述正常對照組之間具有統計學意義的 差異表達蛋白質峰。
[0021] 進一步的，步驟(7)中，設置P<0.01，所述胃癌脾虛證組和所述正常對照組之間具 有統計學意義的差異表達蛋白質峰有101個(P<〇.01)，其中所述胃癌脾虛證與所述正常對 照組比值比率>4的有17個差異蛋白，其中，有4個蛋白質峰在所述胃癌脾虛證組表達下調， 13個蛋白質峰在所述胃癌脾虛證組表達上調，所述17個差異蛋白具體如下：
[0024] 進一步的，步驟(6)所述荷質比范圍為2000~15000m/z。
[0025] 與現有技術相比，本發明可以獲得包括以下技術效果：
[0026] 1)本發明運用WCX與MALDI-T0F-MS蛋白質組學技術，基于唾液蛋白質組開展胃癌 脾虛證病證結合分子診斷研究，發現胃癌脾虛證與非脾虛證比較，有6個差異蛋白峰具有統 計學意義(P<〇.〇5)，其中有2個差異蛋白峰(m/z分別為5439.67、5380.16)具有非常顯著意 義（P<0 · 01)。經Biomarker Patterns 5 · 0 · 2診斷模型軟件篩選出m/z為5439 · 67、2411 ·67、 3619.18等3個差異蛋白質峰建立胃癌脾虛證與正常對照組的診斷判別模型。經臨床回代檢 驗，該模型的靈敏度和特異度分別達100% (40/40)和93% (42/45);通過交叉驗證法進一步 驗證診斷模型的可靠性，結果該模型的靈敏度和特異度分別為87% (35/40)和89% (40/ 45)。說明該模型對胃癌脾虛證的診斷效率優良，靈敏度高、特異性強。
[0027] 2)本發明的研究結果已顯示出良好的應用前景，值得進一步深入研究并在臨床推 廣轉化。
[0028] 當然，實施本發明的任一產品必不一定需要同時達到以上所述的所有技術效果。
【附圖說明】
[0029] 此處所說明的附圖用來提供對本發明的進一步理解，構成本發明的一部分，本發 明的示意性實施例及其說明用于解釋本發明，并不構成對本發明的不當限定。在附圖中：
[0030] 圖1為本發明實施例中胃癌脾虛證組與正常對照組蛋白質代表性圖譜；
[0031] 圖2為本發明實施例中胃癌脾虛證組與胃癌非脾虛證組蛋白質代表性圖譜；
[0032] 圖3為本發明實施例中胃癌脾虛證組與正常對照組中放大后的蛋白質峰m / z = 3255的質譜峰圖；
[0033]圖4為本發明實施例中胃癌脾虛證組與正常對照組中放大后的蛋白質峰m/z = 5439的質譜峰圖；
[0034]圖5為本發明實施例中胃癌脾虛證組與正常對照組唾液無創分子診斷模型樹狀 圖；
[0035]圖6為本發明實施例中診斷模型十字交叉驗證的ROC曲線。
【具體實施方式】
[0036]以下將配合附圖及實施例來詳細說明本發明的實施方式，藉此對本發明如何應用 技術手段來解決技術問題并達成技術功效的實現過程能充分理解并據以實施。
[0037] 實施例
[0038] 1病例選擇
[0039] 1.1診斷標準
[0040] 1.1.1胃癌診斷標準
[0041 ]胃癌的診斷根據《內科學》的診斷標準。
[0042] 1.1.2脾虛證診斷標準
[0043] (1)脾虛證:脾虛證包括脾虛與氣虛兩部分：
[0044] 氣虛主癥:①體倦乏力；②神疲懶言；③舌質淡、舌體胖或有齒痕，苔薄白；④脈細 弱。
[0045] 脾虛主癥:①胃納減少或食欲差;②大便不正常(溏、爛、先硬后溏、時溏時硬）；③ 食后腹脹，午后腹脹。
[0046] 脾虛次癥：口淡不渴，喜熱飲，口泛清涎，腹痛綿綿或喜按喜溫，或得食則減，或遇 勞則發，惡心嘔吐，脘悶腸鳴，消瘦或虛胖，面色萎黃，唇淡，短氣，浮腫，久嗽，痰多清稀，失 眠不寐，排便無力，白帶清稀，小便清長。
[0047] 氣虛主癥2個+脾虛主癥2個，或氣虛主癥舌象+脾虛主癥2個，或氣虛主癥舌象+脾 虛1個加次癥2個，即可診斷為脾虛證。
[0048] (2)非脾虛證：胃癌患者不符合上述脾虛證的診斷，均為胃癌非脾虛證。
[0049] 1.2納入標準
[0050] (1)符合診斷標準，未經手術和放化療；
[0051 ] (2)年齡在20-75歲之間；
[0052] (3)自愿且能夠配合參加的受試對象。
[0053]以上3項必須全部符合才能納入。
[0054] 1.3排除標準
[0055] (1)不符合上述診斷標準者；
[0056] (2)年齡 <20 或 >75 歲者；
[0057] (3)患有口腔局部及唾液腺的炎癥、消化道潰瘍、腫瘤及先天性疾病；患有舍格倫 綜合征、囊性纖維病;患有其他系統嚴重并發疾病。
[0058] h 4質量控制
[0059] (1)采用統一診斷標準、統一調查表格、統一調查方法；
[0060] (2)調查者在調查時嚴格按照"標準化"執行，減少調查者偏倚，確保資料的一致性 和真實性；
[0061] (3)電子胃鏡及病理結果均由1月內三級甲等醫院診斷。
[0062] 2納入病例基本資料
[0063]本研究共納入2014年12月-2015年04月在湖南省腫瘤醫院胃十二指腸胰腺外科胃 癌脾虛證患者40例，男25例、女15例；胃癌非脾虛證患者17例，均為術前未進行放化療，男14 例、女3例;年齡36-68歲，中位年齡52歲；正常對照組45例，男28例、女17例;年齡23-72歲，中 位年齡52歲，均來自于湖南中醫藥大學附屬第一醫院體檢科健康自愿者。所有病例均按照 納入標準進行納入。
[0064] 3研究分組
[0065] 40例未進行任何治療的胃癌脾虛證患者為胃癌脾虛證組(A組），17例未進行任何 治療的胃癌脾虛證患者為胃癌非脾虛證組(B組），45例健康志愿者為正常對照組(N組）。 [0066] 4實驗方法
[0067] 4.1主要儀器和試劑
[0068] 蛋白指紋圖譜（液體芯片）試劑盒(WCX磁珠、Wash Buffer、Elution Buffer、U9裂 解液)及MALDI-TIF-MS(蛋白指紋圖譜儀I型），均為湖州賽爾迪生物醫藥科技有限公司產 品，試劑盒批號為K20150501; dH20(HPLC級）、CHCA為Sigma公司產品。
[0069] 4.2樣品收集
[0070]按照本課題專用臨床觀察表進行臨床觀察記錄。取材前一天晚上臨睡前清水漱口 三次(不再進任何食物和藥物），采用非刺激性唾液采集方式，第二天晨起后漱口前空腹取 材。由經過培訓的課題組專人取材，前5min內的唾液自然吞下后開始收集，患者將已經過消 毒的無菌小圓柱形棉花含入口中，口腔唾液積聚至一定量后，將該棉花吐入置于冰浴中的 15ml唾液離心管內，4°C下靜置Ih后，3000r/min、4°C下離心10min，冰浴上分裝在Iml的EP管 中，每管200μ1，于-80°C冰箱冷凍保存。實驗時取出樣本，冰上解凍，所有檢測唾液樣本均1 次凍融。取5μ1唾液加入10μ1的U9裂解液，混合孵育30min后，加入185μ1的Wash Buffer稀釋 (唾液最終上樣量為2· 5μ1)。
[0071] 4.3納米磁珠預處理
[0072] ①取WCX納米磁珠50μ1加入到200μ1的PCR管，置于磁鐵上孵育lmin(注意避免由于 孵育時間過長導致磁珠結塊），去除上清液;②再依次加入IOOyl的Wash Buffer洗脫5min， 在磁鐵上孵育Imin，去除上清液;再重復步驟②操作一次。
[0073] 4.4唾液樣品洗脫上樣
[0074]①向每個裝有納米磁珠的PCR管中加入100μΙ處理好的唾液樣品，混勻后，置于室 溫孵育30min，將PCR管置于磁鐵上孵育Imin，去除上清液;②每管加入100μΙ的Wash Buffer 洗脫5min，然后將PCR管置于磁鐵上孵育lmin，去除上清液;再重復步驟②操作一次。③在 PCR管中加入10μ1的Elution Buffer洗脫5min(不能少于5min)，將PCR管置于磁鐵上孵育 lmin，取5μ1上清液移至另一個PCR管中；④裝有5μ1上清液的PCR管中加入5μ1的CHCA(基質） 飽和溶液，充分混勻（混合到樣品顏色發灰，而沒有明顯的沉淀并及時上樣），取2μ1混合溶 液(ΙμL唾液樣品+ΙμL基質）加樣到Au/Steel芯片上，待干后放入儀器讀取。
[0075] 4.5芯片檢測、數據采集和參數設置
[0076] 采用蛋白指紋圖譜儀I型(湖州賽爾迪生物醫藥科技有限公司）質譜儀讀取芯片信 息。設置激光強度為190，靈敏度為5，收集數據的質荷比(m/z)范圍為2000~25000m/z，優化 范圍為2000~15000m/z，信號收集位置40~60,平均每點收集20次，收集總點為100次。已知 多肽標準芯片標準（all-in-one)，激光離子流0 · 5。用Ciphergen Proteinchip Software 3.2.1軟件自動采集數據，縱坐標為峰強度(蛋白相對含量），橫坐標為蛋白質質荷比(m/z)。
[0077] 4.6數據分析
[0078] 對位于2000~25000m/z峰值，用Biomarker Wizard軟件過濾噪音。設置初始的噪 音過濾值為5,二次信噪比為2,以10%為最小閾值進行聚類，經上述數據預處理后，采用t檢 驗比較2組唾液蛋白質質譜數據（由Biomarker Wizard軟件完成），找出2組之間具有統計學 意義的差異表達蛋白質峰。用Biomarker Pattern Software 5.0.2采用決策樹算法計算出 多個變量(m/z蛋白質質譜峰)變化對兩樣本的判別價值(診斷貢獻度），確定最優化的診斷 模型。
[0079] 5 結果
[0080] 5.1胃癌脾虛證組與正常對照組對比
[0081 ] 兩組共85份唾液標本，經過標準化后，在相對分子質量為2000~25000Da范圍內共 檢測到375個蛋白質峰，兩組間比較，符合m/z強度平均值的比值>2(脾虛證/正常對照組> 2,或者正常對照組/脾虛證>2)的條件，共有106個差異蛋白質峰有統計學意義(P<0.05)， 其中有101個蛋白峰差異具有非常顯著性意義（P<0.01)(胃癌脾虛證與正常對照組之間 ratio>4差異有統計學意義的蛋白質峰，見表1)，（胃癌脾虛證及正常對照組典型圖譜，圖 1)。其中，26個質峰在脾虛證組表達下調，80個質峰在脾虛證組表達上調。
[0082]表1胃癌與正常對照組之間差異有統計學意義的蛋白質峰(ratio>4)
[0085]圖1為胃癌脾虛證組與正常對照組典型圖譜，上第1、2幅圖為胃癌脾虛證組，下第 3、4幅圖為正常對照組。胃癌脾虛證組質峰范圍主要在1000-4500Da，正常對照組質峰范圍 主要在1000-5000Da。縱坐標為峰強度(蛋白相對含量），橫坐標為蛋白質質荷比(m/z)。 [0086] 圖3為胃癌與正常對照組MALDI質譜峰圖(m/z = 3255 )，縱坐標為峰強度(蛋白相對 含量），橫坐標為蛋白質質荷比(m/z)。上第1、2幅圖為胃癌脾虛證組，下第3、4幅圖為正常對 照組。與正常對照組對比，胃癌脾虛證組表達下調。
[0087] 5.2胃癌脾虛證組與胃癌非脾虛證組對比
[0088] 兩組共57份唾液標本，經過標準化后，在相對分子質量為2000~25000m/z范圍內 共檢測到375個蛋白質峰，質峰多集中在0~15000m/z之間（胃癌脾虛證及胃癌非脾虛證典 型圖譜，圖2)。滿足P<0.05,且兩組m/z強度平均值得比值>2(脾虛證/非脾虛證>2,或者 非脾虛證/脾虛證>2)的條件，兩組間比較，共有6個差異蛋白質峰（3225.359、2493.291、 5380.163、5306.461、5355.632、5439.673)有統計學意義（Ρ<0· 05)，共有2個蛋白峰 (5380.163、5439.673)(圖3、圖4)差異具有非常顯著性意義（Ρ<0.01)(表2)。其中， 3225.359、2493.291兩個質譜峰在脾虛證組表達下調，而5380.163、5306.461、5355.632、 5439.673在脾虛證組表達上調。
[0089]表2癌脾虛證組與胃癌非脾虛證組之間差異有統計學意義的蛋白質峰(ratio>2)
[0091]圖2為胃癌脾虛證組與胃癌非脾虛證組典型圖譜，上第1、2幅圖為胃癌脾虛證組， 下第3、4幅圖為正常對照組。胃癌脾虛證組質峰范圍主要在0-40000Da，正常對照組質峰范 圍主要在0_30000Da。縱坐標為峰強度(蛋白相對含量），橫坐標為蛋白質質荷比(m/z)。 [0092] 圖4為胃癌與正常對照組MALDI質譜峰圖（m/z = 5439)上第1、2幅圖為胃癌脾虛證 組，下第3、4幅圖為正常對照組。與正常對照組對比，胃癌脾虛證組表達上調。縱坐標為峰強 度(蛋白相對含量），橫坐標為蛋白質質荷比(m/z)。
[0093] 5.3胃癌脾虛證分子診斷模型建立
[0094] 用Biomarker Pattern Software 5.0.2米用決策樹算法計算出多個變量(m/z蛋 白質質譜峰)變化對兩組樣本的判別價值(診斷貢獻度），最終選定m/z為5439.67、2411.67、 3619.18建立胃癌脾虛證唾液無創分子診斷模型（圖5)，經臨床回代檢驗，該模型的靈敏度 和特異度分別為100 % (40/40)和93 % (42/45)(見表3)。
[0095] 弄3所律詮斷樽型對g癌胞慮證的詮斷效鑾0你床冋代拾3合結里）
LUU7/」 團07^111/^1 - 0/±0?.0/、2/±丄丄.0//|^00丄》.丄00，0'「:111有左開'蟲|=| 11|軍姐；3乂口、」冃；1街胖膽^： 診斷模型。當 5439.67m/z>l .72,或者 5439.67m/z < 1.72 且 2411.67m/z>4.15,或者 5439 · 67m/z < 1 · 72且2411 · 67m/z < 4 · 15且3619 · 18m/z>9 · 02提示為早期胃癌脾虛證患者； 當5439 · 67m/z < 1 · 72且2411 · 67m/z < 4 · 15且3619 · 18m/z < 9 · 02提示為正常。M:質譜峰相對 強度。
[0098] 5.4診斷模型十字交叉驗證
[0099]對所建立的胃癌脾虛證診斷模型采用十字交叉法進行驗證，結果該模型的靈敏度 和特異度分別87 % (35/40)和89 % (40/45)(表4)。
[0100]表4所建診斷模型對胃癌脾虛證的診斷效率(十字交叉驗證結果）
[0102] 圖6為診斷模型十字交叉驗證的ROC曲線，軸坐標為假陽性率（1-特異度），縱坐標 為真陽性率（靈敏度KROC曲線下面積越大，其診斷價值越高。圖6中ROC曲線下面積為 0.976，進一步地驗證所建立模型的診斷價值。
[0103] 病證結合已經成為現代中西醫結合臨床的主要模式。鑒于不同疾病的特征性病理 實質不同，開展病證結合的證候診斷客觀化研究是十分必要的。脾虛是中醫臨床最常見的 基本證候之一，也是胃癌的重要病機和常見證候。本發明運用WCX與MALDI-T0F-MS蛋白質組 學技術，基于唾液蛋白質組開展胃癌脾虛證病證結合分子診斷研究，發現胃癌脾虛證與非 脾虛證比較，有6個差異蛋白峰具有統計學意義(P<0.05)，其中有2個差異蛋白峰(m/z分 別為5439·67、5380.16)具有非常顯著意義（Ρ<0·01)。經Biomarker Patterns 5.0.2診斷 模型軟件篩選出m/z為5439.67、2411.67、3619.18等3個差異蛋白質峰建立胃癌脾虛證與正 常對照組的診斷判別模型。經臨床回代檢驗，該模型的靈敏度和特異度分別達100% (40/ 40)和93% (42/45);通過交叉驗證法進一步驗證診斷模型的可靠性，結果該模型的靈敏度 和特異度分別為87% (35/40)和89% (40/45)。說明該模型對胃癌脾虛證的診斷效率優良， 靈敏度高、特異性強。
[0104] 如在說明書及權利要求當中使用了某些詞匯來指稱特定成分或方法。本領域技術 人員應可理解，不同地區可能會用不同名詞來稱呼同一個成分。本說明書及權利要求并不 以名稱的差異來作為區分成分的方式。如在通篇說明書及權利要求當中所提及的"包含"為 一開放式用語，故應解釋成"包含但不限定于"。"大致"是指在可接收的誤差范圍內，本領域 技術人員能夠在一定誤差范圍內解決所述技術問題，基本達到所述技術效果。說明書后續 描述為實施本發明的較佳實施方式，然所述描述乃以說明本發明的一般原則為目的，并非 用以限定本發明的范圍。本發明的保護范圍當視所附權利要求所界定者為準。
[0105] 還需要說明的是，術語"包括"、"包含"或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的 包含，從而使得包括一系列要素的商品或者系統不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確 列出的其他要素，或者是還包括為這種商品或者系統所固有的要素。在沒有更多限制的情 況下，由語句"包括一個……"限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系統中還 存在另外的相同要素。
[0106] 上述說明示出并描述了本發明的若干優選實施例，但如前所述，應當理解本發明 并非局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、 修改和環境，并能夠在本文所述發明構想范圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識 進行改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離本發明的精神和范圍，則都應在本發 明所附權利要求的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種胃癌脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法，其特征在于，包括W下 步驟： (1) 樣品收集； (2) 納米磁珠預處理； (3) 樣品預處理:取出冷凍保存的唾液樣品，冰上解凍，所有唾液樣品均1次凍融，取扣1 所述唾液品加入1〇μ1的U9裂解液，混合解育30min后，加入18化1的Wash Buffer稀釋； (4) 唾液樣品洗脫上樣:③向每個裝有納米磁珠的PCR管中分別加入10化1預處理后的 所述唾液樣品，混勻，置于室溫解育30min，將所述PCR管置于磁鐵上解育Imin，去除上清液； ④每管加入10化1的Wash Buffer洗脫5min，然后將所述PCR管置于磁鐵上解育Imin，去除上 清液;再重復步驟④操作一次;⑤在所述PCR管中加入10μ1的Elution Buffer洗脫5min，將 所述PCR管置于磁鐵上解育Imin，取扣1上清液移至另一個PCR管中；⑥將裝有扣1上清液的 PCR管中加入化1的C肥A飽和溶液，充分混勻，至樣品顏色發灰，而沒有明顯的沉淀時，取化1 混合溶液，加樣到Au/Steel忍片上，驚干后放入儀器讀取； (5) 質譜分析:采用質譜儀讀取所述Au/Steel忍片信息，設置激光強度為190,靈敏度為 5; (6) 數據采集； (7) 數據分析； (8) 建立診斷模型：用Biomarker Pattern Software 5.0.2采用決策樹算法計算出多 個變量變化對兩樣本的判別價值，確定最佳的診斷模型。2. 如權利要求1所述的胃癌脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法，其特征 在于，所述步驟（1)樣品收集的方法為：胃癌脾虛證組和正常對照組在取材前一天晚上臨睡 前清水漱口，之后不再進食任何食物和藥物，于第二天晨起后漱口前采用非刺激性唾液采 集方式空腹取材，前5min內的唾液自然吞下后開始收集，收集到的唾液置于冰浴中的15ml 唾液離屯、管內，4°C下靜置化后，300化/min、4°C下離屯、lOmin，冰浴上分裝在1ml的EP管中， 每管20化1，于-80°C冰箱冷凍保存備用。3. 如權利要求2所述的胃癌脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法，其特征 在于，所述步驟(2)納米磁珠預處理的方法為:①取WCX納米磁珠50μ1加入到20化1的PCR管 中，置于磁鐵上解育Imin，去除上清液;②再加入10化1的Wash Buffer洗脫5min，在磁鐵上 解育Imin，去除上清液;再重復步驟②操作一次。4. 如權利要求3所述的胃癌脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法，其特征 在于，所述步驟(6)數據采集的方法為：用〔;[曲日巧日]1?1'〇1日;[]1證19 5〇的￥日'日3.2.1軟件采 集數據，縱坐標為峰強度，橫坐標為蛋白質質荷比，收集數據的質荷比范圍為2000~ 25000m/z，信號收集位置40~60,平均每點收集20次，收集總點為100次，已知多膚標準忍片 標準，激光離子流0.5。5. 如權利要求4所述的胃癌脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法，其特征在 于，所述步驟(7)數據分析的方法為:對位于2000~25000m/z峰值，用Biomarker Wizard軟件 過濾噪音;設置初始的噪音過濾值為5,二次信噪比為2, WlO%為最小闊值進行聚類，經上 述數據預處理后，采用t檢驗比較所述胃癌脾虛證組和所述正常對照組唾液蛋白質質譜數 據，找出所述胃癌脾虛證組和所述正常對照組之間具有統計學意義的差異表達蛋白質峰。6. 如權利要求5所述的胃癌脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法，其特征 在于，步驟(7)中，設置P<0.01，所述胃癌脾虛證組和所述正常對照組之間具有統計學意義 的差異表達蛋白質峰有101個，其中所述胃癌脾虛證與所述正常對照組比值比率>4的有17 個差異蛋白，其中，有4個蛋白質峰在所述胃癌脾虛證組表達下調，13個蛋白質峰在所述胃 癌脾虛證組表達上調，所述17個差異蛋白具體如下：7. 如權利要求6所述的胃癌脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法，其特征 在于，步驟(6)所述荷質比范圍為2000~15000m/z。
【文檔編號】G01N27/62GK105842327SQ201610168131
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月23日
【發明人】吳正治, 謝夢洲, 黃飛娟, 曹美群, 孫珂煥, 賀佐梅
【申請人】深圳市老年醫學研究所, 吳正治