一種用于生化需氧量檢測的電極敏感層的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種用于生化需氧量檢測的電極敏感層，其敏感層為以金電極為基底直接共價固定的單層枯草芽孢桿菌，無需透氧膜和微生物固定載體半透膜，結構更簡單，微生物層與電極結合更緊密，能夠有效縮短待測物質在溶液、微生物以及電極之間的傳質距離，減小待測物質擴散的傳質阻力，檢測生化需氧量的時間大為縮短；以金電極為微生物的固定基底提高了電極敏感層的機械強度，羧基氨基共價成鍵的固定方式增加了微生物與電極固定的穩定性，不易脫落；制備方法工藝簡單易行，操作簡便，可控性強，僅使用了巰基丙酸、EDC和NHS三種試劑，不使用其它有毒化學試劑，且該三種試劑均僅作用于電極，對微生物的活性影響較小。
【專利說明】
一種用于生化需氧量檢測的電極敏感層
技術領域
[0001] 本發明涉及生物傳感器技術領域，尤其涉及一種用于生化需氧量檢測的電極敏感 層。
【背景技術】
[0002] 生化需氧量(BOD)，是指在規定條件下，微生物分解水中某些可氧化性物質、特別 是有機物所進行的生物化學過程中消耗溶解氧的量，單位為毫克/升。其值越高，表明水中 有機污染物含量越多，污染越嚴重。生化需氧量能相對的表示出微生物可分解有機污染物 的量，符合水體自凈化的實際情況，因而在水質監測和評價方面更具有實際操作意義。
[0003] 傳統的BOD檢測方法為五日培養法，耗時5日，存在測定精度低、重現性差、分析周 期長、操作步驟繁瑣等缺點。微生物傳感器法以微生物為敏感元件，將水中可氧化有機物的 生物化學氧化分解轉換為物理或化學變化，再經轉換元件轉化為輸出信號。微生物傳感器 法由于具有檢測時間短和操作簡便等優點，成為當前BOD快速檢測中的研究熱點。
[0004] 微生物膜是微生物傳感器中的重要組成部分，其性能直接決定了傳感器的性能。 微生物一般通過吸附、包埋或交聯的方法固定于半透膜中，制備的微生物膜固定于氧電極 表面，通過氧電極檢測微生物代謝有機物的耗氧情況以測定B0D。微生物的固定基底半透膜 以及氧電極表面的透氧膜的雙層結構，不僅增大了氧化還原物質在溶液和電極表面之間的 傳質阻力，使微生物膜電極的響應時間較長，不利于BOD的快速測定，同時該雙層膜需要定 時更換，操作繁瑣且會對傳感器性能產生影響。因此，研究微生物固定化的方法及其簡化設 計十分重要。
[0005] 微生物固定方法中，吸附法固定對微生物無毒害作用，細胞活性損失小，但存在長 時間后微生物易脫落，影響使用壽命的問題。包埋法制備的微生物膜機械強度雖有提高，微 生物活性也較交聯法高，但該方法不適用于涉及大分子物質的反應，同時由于包埋材料的 使用引入較大的傳質阻力。交聯法制備的微生物膜使用壽命提高，但固定微生物的成活率 較低，制備過程較復雜，交聯劑用量和微生物量相互制約。
[0006] 例如，現有技術的一種包埋法制備微生物電極敏感層，首先混合海藻酸鈉溶液和 菌液，滴涂于工作電極表面，然后浸入氯化鈣溶液中固化，為防止包埋細胞脫落，細胞凝膠 表面覆蓋聚酰胺膜，制備的傳感器用于BOD快速檢測，制備過程如圖1所示。該方法使用直徑 為ΙΟμπι的超微鉬電極作為工作電極，使用的微生物是青紫色素桿菌（Chromobacterium violaceum Rl)，為防止微生物脫落，采用聚酰胺膜覆蓋，固定微生物的凝膠厚度范圍為百 微米量級，BOD檢測的待測量為電子媒介體鐵氰化鉀，測定BOD的耗時為30min。由此可見，該 方法存在的主要問題是，一是包埋凝膠厚度在百微米量級，不利于待測物質的傳質，二是固 定所用包埋材料和為防止包埋的微生物脫落而覆蓋的聚酰胺膜會引入較大的傳質阻力，不 利于BOD的快速檢測，固定過程中引入較多化學試劑，步驟較多，可能引入更多干擾，同時對 微生物的活性可能產生影響。
[0007]由此可見，現有技術絕大部分使用了半透膜作為固定基底，增大了傳質阻力，且沒 有利用微生物表面和固定基底的性質。因此，如何制備一種結構簡單，傳質阻力小，檢測時 間短、固定牢固、對微生物的活性影響較小的電極敏感層是本領域亟待研究的課題。
【發明內容】
[0008] (一)要解決的技術問題
[0009] 有鑒于此，本發明的主要目的在于提供一種用于生化需氧量檢測的電極敏感層。
[0010] (二)技術方案
[0011] 本發明提供了一種用于生化需氧量檢測的電極敏感層，包括:作為微生物固定基 底的電極和微生物，其中，該微生物直接交聯固定于電極表面，形成單層微生物的電極敏感 層。
[0012] 優選地，該微生物表面的氨基與該電極表面的活化后的羧基共價成鍵，使得該微 生物交聯固定于該電極表面，形成單層微生物的電極敏感層。
[0013] 優選地，該電極為金電極。
[0014] 優選地，該微生物為枯草芽孢桿菌。
[0015] 優選地，該枯草芽孢桿菌表面的氨基與金電極表面的活化后的羧基共價成鍵，使 得該枯草芽孢桿菌固定于該金電極表面，形成單層微生物的電極敏感層。
[0016] 本發明還提供了一種用于生化需氧量檢測的微生物傳感器，包括上述任一種用于 生化需氧量檢測的電極敏感層。
[0017] 本發明還提供了一種用于制備上述任一種用于生化需氧量檢測的電極敏感層的 制備方法，其特征在于，包括:步驟A:電極預處理;步驟B:電極表面自組裝化學基；以及步驟 C:活化電極表面的化學基并交聯固定微生物，形成單層微生物的電極敏感層。
[0018] 優選地，該步驟A具體包括:對金電極進行表面清潔處理和電化學性能穩定處理。 [0019]優選地:將預處理后的金電極浸泡于巰基丙酸溶液中，金電極表面自組裝羧基。 [0020] 優選地，該步驟C具體包括:子步驟Cl:采用EDC和NHS混合溶液活化金電極表面的 羧基；以及子步驟C2:將表面羧基被活化后的金電極浸泡于枯草芽孢桿菌菌液中，枯草芽孢 桿菌表面的氨基與金電極表面的活化后的羧基共價成鍵，單層枯草芽孢桿菌交聯固定于金 電極表面。
[0021](三)有益效果
[0022] 從上述技術方案可以看出，本發明的用于生化需氧量檢測的電極敏感層具有以下 有益效果：
[0023] (1)敏感層為固定的單層的枯草芽孢桿菌，無需透氧膜和微生物固定載體半透膜， 結構更簡單，微生物層與電極結合更緊密，能夠有效縮短待測物質在溶液、微生物以及電極 之間的傳質距離，減小待測物質擴散的傳質阻力，檢測生化需氧量的時間大為縮短；
[0024] (2)以金電極為微生物的固定基底提高了電極敏感層的機械強度，羧基氨基共價 成鍵的固定方式增加了微生物與電極固定的穩定性，不易脫落；
[0025] (3)制備方法工藝簡單易行，操作簡便，可控性強，僅使用了巰基丙酸、EDC和NHS三 種試劑，不使用其它有毒化學試劑，且該三種試劑均僅作用于電極，對微生物的活性影響較 小。
【附圖說明】
[0026] 圖1為現有技術中的一種制備電極敏感層的方法；
[0027] 圖2為本發明第一實施例的用于生化需氧量檢測的電極敏感層；
[0028] 圖3為本發明第一實施例的電極敏感層對BOD標準溶液的響應電流隨時間變化曲 線圖，Io為電極敏感層剛接觸待測液時的計時電流信號，I 5為電極敏感層接觸待測液5min后 的計時電流信號；
[0029]圖4為本發明第一實施例的電極敏感層對BOD標準溶液的響應電流與BOD標準溶液 的標定曲線圖；
[0030] 圖5為本發明第三實施例制備電極敏感層的制備方法流程圖；
[0031] 圖6示出了經表面清潔處理和電化學性能穩定處理后的金電極；
[0032]圖7示出了自組裝羧基后的金電極；
[0033]圖8示出了制成的電極敏感層。
[0034]【符號說明】
[0035] 1-金電極;2-枯草芽孢桿菌。
【具體實施方式】
[0036] 為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚明白，以下結合具體實施例，并參照 附圖，對本發明進一步詳細說明。
[0037] 參見圖2,本發明第一實施例的用于生化需氧量檢測的電極敏感層，其包括:作為 微生物固定基底的電極和微生物，其中，該微生物直接交聯固定于電極表面，形成單層微生 物的電極敏感層。
[0038]優選地，微生物表面與電極表面的活化后的羧基共價成鍵，使得微生物固定于電 極表面，形成單層微生物的電極敏感層;微生物表面的氨基與電極表面共價成鍵，使得微生 物固定于電極表面，形成單層微生物的電極敏感層;進一步地，微生物表面的氨基與電極表 面的活化后的羧基共價成鍵，使得微生物固定于電極表面，形成單層微生物的電極敏感層。
[0039] 優選地，該電極為金屬電極，尤其是金電極1，其直徑為0.5mm-2mm，優選Imm;該微 生物為枯草芽孢桿菌(Baci I Ius subti I is) 2;固定的單層微生物的厚度為μπι量級;枯草芽 孢桿菌表面的氨基與金電極表面的活化后的羧基共價成鍵，使得枯草芽孢桿菌2固定于金 電極表面，形成單層微生物的電極敏感層。
[0040] 本發明第一實施例的用于生化需氧量檢測的電極敏感層，其敏感層為單層枯草芽 孢桿菌2,該單層微生物結構相對于現有技術的將微生物固定于半透膜中、再覆蓋于含透氧 膜的溶氧電極表面的分立雙層結構，無需半透膜和透氧膜，結構更簡單，微生物層與電極結 合更緊密，能夠有效縮短待測物質在溶液、微生物以及電極之間的傳質距離，減小待測物質 擴散的傳質阻力。
[0041] 利用該電極敏感層檢測生化需氧量所需的檢測時間大為縮短，例如采用計時電流 法，利用該電極敏感層分別對磷酸緩沖溶液(PBS)和待測溶液進行測試，其以溶解氧為待測 量，所得差值即為生化需氧量的值，可在IOmin內完成檢測，圖3示出了電極敏感層對BOD標 準溶液的響應電流隨時間變化曲線，圖4示出了響應電流對BOD標準溶液的標定曲線，BOD標 準溶液為葡萄糖-谷氨酸溶液。不用于檢測時，電極敏感層可置于PBS中4°C保存。
[0042] 以金電極為微生物的固定基底提高了電極敏感層的機械強度，羧基氨基共價成鍵 的固定方式增加了微生物與電極固定的穩定性，不易脫落。
[0043] 本發明第二實施例提供了一種用于生化需氧量檢測的微生物傳感器，其包括上述 第一實施例中的用于生化需氧量檢測的電極敏感層。
[0044] 參見圖5,本發明第三實施例提供了一種用于制備上述電極敏感層的制備方法，其 包括：
[0045] 步驟A:電極預處理。
[0046] 該步驟A具體包括:對金電極1進行表面清潔處理和電化學性能穩定處理。圖6示出 了經表面清潔處理和電化學性能穩定處理后的金電極1。
[0047]優選地，所述金電極1選用商用體電極，也可以采用基于磁控濺射技術制備的金電 極，金電極1作為微生物固定基底，具有較好的機械強度。
[0048]所述表面清潔處理是分別在丙酮、乙醇、去離子水中對金電極表面做超聲清洗。
[0049] 步驟B:電極表面自組裝化學基。
[0050] 步驟B具體包括:將經步驟A預處理的金電極浸泡于巰基丙酸(MPA，HSCH2CH2COOH) 溶液中，金電極表面自組裝羧基。圖7示出了自組裝羧基后的金電極，其中一 S ~ ?皿表示 自組裝的羧基。
[00511 優選地，巰基丙酸溶液的濃度為10-200mM，浸泡時間為2-12h;巰基丙酸溶液的濃 度也可適當擴大，金電極浸泡于巰基丙酸溶液中的時間也可適當延長。雖然巰基丙酸會增 加一定的傳質阻力，但由于其碳鏈較短，引入的傳質阻力較小，對于生化需氧量檢測時間的 影響可忽略不計。
[0052]步驟C:活化電極表面的化學基并交聯固定單層微生物。
[0053] 步驟C具體包括：
[0054] 子步驟Cl:采用EDC(l-(3-二甲氨基丙酸)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)和NHS(N-羥基 琥珀酰亞胺)混合溶液活化金電極表面的羧基；
[0055] 子步驟C2:將表面羧基被活化后的金電極浸泡于枯草芽孢桿菌菌液中，枯草芽孢 桿菌表面的氨基與金電極表面的活化后的羧基共價成鍵，枯草芽孢桿菌2交聯固定于金電 極表面，形成單層微生物的電極敏感層。圖8示出了制成的電極敏感層，其中一3Λ/co-表 示活化后的羧基，-NH-表示枯草芽孢桿菌表面的、與羧基連接后的氨基的狀態。
[0056] 優選地，選用培養到穩定期的枯草芽孢桿菌;枯草芽孢桿菌菌液濃度為6 X IO7~6 X I O9CFlVml，浸泡時間為2-12h。
[0057] 該交聯固定方式利用了共價成鍵，穩定性好，固定牢固，同時由于只有金電極表面 的羧基被活化，所以金電極表面僅固定了單層枯草芽孢桿菌，促進了有機物和溶氧在溶液、 微生物和電極之間的擴散，減小了傳質阻力。
[0058]本發明第三實施例的制備方法，工藝簡單易行，操作簡便，可控性強，僅使用了巰 基丙酸、EDC和NHS三種試劑，不使用其它有毒化學試劑，且該三種試劑均僅作用于電極，對 微生物的活性影響較小。
[0059]至此，已對本發明的用于生化需氧量檢測的電極敏感層進行了詳細描述。需要說 明的是，在附圖或說明書正文中，未繪示或描述的實現方式，均為所屬技術領域中普通技術 人員所知的形式，并未進行詳細說明。此外，上述對各元件的定義并不僅限于實施例中提到 的各種具體結構和形狀，本領域普通技術人員可對其進行簡單地更改或替換，例如：
[0060] (1)微生物層還可采用其他菌類，只要能實現相同的功能即可；
[0061] (2)本文可提供包含特定值的參數的示范，但這些參數無需確切等于相應的值，而 是可在可接受的誤差容限或設計約束內近似于相應值；
[0062] (3)實施例中提到的方向用語，例如"上"、"下"、"前"、"后"、"左"、"右"等，僅是參 考附圖的方向，并非用來限制本發明的保護范圍；
[0063] (4)上述實施例可基于設計及可靠度的考慮，彼此混合搭配使用或與其他實施例 混合搭配使用，即不同實施例中的技術特征可以自由組合形成更多的實施例。
[0064] 綜上所述，本發明的用于生化需氧量檢測的電極敏感層，其敏感層為以金電極為 基底直接共價固定的單層枯草芽孢桿菌，無需透氧膜和微生物固定基底半透膜，結構更簡 單，微生物層與電極結合更緊密，能夠有效縮短待測物質在溶液、微生物以及電極之間的傳 質距離，減小待測物質擴散的傳質阻力，檢測生化需氧量的時間大為縮短；以金電極為微生 物的固定基底提高了電極敏感層的機械強度，羧基氨基共價成鍵的固定方式增加了微生物 與電極固定的穩定性，不易脫落;其制備方法工藝簡單易行，操作簡便，可控性強，僅使用了 巰基丙酸、EDC和NHS三種試劑，不使用其它有毒化學試劑，且該三種試劑均僅作用于電極， 對微生物的活性影響較小。
[0065] 以上所述的具體實施例，對本發明的目的、技術方案和有益效果進行了進一步詳 細說明，所應理解的是，以上所述僅為本發明的具體實施例而已，并不用于限制本發明，凡 在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保 護范圍之內。
【主權項】
1. 一種用于生化需氧量檢測的電極敏感層，其特征在于，包括:作為微生物固定基底的 電極和微生物，其中，該微生物直接交聯固定于電極表面，形成單層微生物的電極敏感層。2. 如權利要求1所述的電極敏感層，其特征在于，該微生物表面的氨基與該電極表面的 活化后的羧基共價成鍵，使得該微生物交聯固定于該電極表面，形成單層微生物的電極敏 感層。3. 如權利要求2所述的電極敏感層，其特征在于，該電極為金電極。4. 如權利要求3所述的電極敏感層，其特征在于，該微生物為枯草芽孢桿菌。5. 如權利要求4所述的電極敏感層，其特征在于，該枯草芽孢桿菌表面的氨基與金電極 表面的活化后的羧基共價成鍵，使得該枯草芽孢桿菌固定于該金電極表面，形成單層微生 物的電極敏感層。6. -種用于生化需氧量檢測的微生物傳感器，其特征在于，包括權利要求1-5中任一項 權利要求所述的用于生化需氧量檢測的電極敏感層。7. -種用于制備權利要求1-5中任一項權利要求所述的電極敏感層的制備方法，其特 征在于，包括： 步驟A:電極預處理； 步驟B:電極表面自組裝化學基；以及 步驟C:活化電極表面的化學基并交聯固定微生物，形成單層微生物的電極敏感層。8. 如權利要求7所述的制備方法，其特征在于，該步驟A具體包括:對金電極進行表面清 潔處理和電化學性能穩定處理。9. 如權利要求8所述的制備方法，其特征在于，該步驟B具體包括:將預處理后的金電極 浸泡于巰基丙酸溶液中，金電極表面自組裝羧基。10. 如權利要求9所述的制備方法，其特征在于，該步驟C具體包括： 子步驟C1:采用EDC和NHS混合溶液活化金電極表面的羧基；以及 子步驟C2:將表面羧基被活化后的金電極浸泡于枯草芽孢桿菌菌液中，枯草芽孢桿菌 表面的氨基與金電極表面的活化后的羧基共價成鍵，單層枯草芽孢桿菌交聯固定于金電極 表面。
【文檔編號】G01N27/327GK105842315SQ201610152887
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月17日
【發明人】夏善紅, 李錦 , 李一錦, 孫楫舟, 王晉芬, 邊超, 佟建華, 李洋
【申請人】中國科學院電子學研究所