一種基于hcr信號放大的無標記電致發光生物傳感器及檢測轉錄因子的方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于HCR信號放大的無標記電致發光生物傳感器及檢測轉錄因子的方法，與現有技術相比，本發明利用轉錄因子對特定序列DNA的識別，實現目標DNA從三鏈中分離，脫附下來的目標鏈引發雜交鏈式反應，通過Ru(phen)32+(1,10?鄰二氮菲釕)可以插入雙鏈作為信號進行檢測，制備出無標記電致發光生物傳感器，實現了對轉錄因子的靈敏性，特異性，穩定性的檢測。
【專利說明】
一種基于HCR信號放大的無標記電致發光生物傳感器及檢測轉錄因子的方法
技術領域
[0001]本發明屬于生物傳感器技術領域，具體涉及一種基于HCR信號放大的無標記電致發光生物傳感器及檢測轉錄因子的方法。
【背景技術】
[0002]真核生物轉錄起始十分復雜，往往需要多種蛋白因子的協助，轉錄因子(Transcript1n factors，TFs)與RNA聚合酶II形成轉錄起始復合體，共同參與轉錄起始的過程。根據轉錄因子的作用特點可分為二類;第一類為普遍轉錄因子，它們與RNA聚合酶II共同組成轉錄起始復合體時，轉錄才能在正確的位置開始。除TFII D以外，還發現TFII A，TFII F，TFII E，TFII H等，它們在轉錄起始復合體組裝的不同階段起作用。第二類轉錄因子為組織細胞特異性轉錄因子，這些TF是在特異的組織細胞或是受到一些類固醇激素\生長因子或其它刺激后，開始表達某些特異蛋白質分子時，才需要的一類轉錄因子。
[0003]TFs(轉錄因子)是一種管理蛋白質，通過綁定特定的DNA序列，在調節各種重要的細胞過程中，例如:基因復制，基因轉錄，細胞分裂以及DNA修復起著非常重要的作用。
[0004]然而，TFs(轉錄因子)的誤調節及突變可能會導致各種疾病，例如，癌癥，糖尿病，先天性心臟病，自身免疫病以及發展性綜合征。
[0005]如何實現快速、準確的檢測轉錄因子成為現在研究的熱點之一。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于，提供一種基于HCR信號放大的無標記電致發光生物傳感器及檢測轉錄因子的方法，利用轉錄因子對特定序列DNA的識別，實現目標DNA從三鏈中分離，脫附下來的目標鏈引發雜交鏈式反應，通過Ru(phen)32+(1，10-鄰二氮菲釕)可以插入雙鏈作為信號進行檢測，制備出無標記電致發光生物傳感器，實現了對轉錄因子的靈敏性，特異性，穩定性的檢測。
[0007]—種基于HCR信號放大的無標記電致發光生物傳感器，其制備方法包括以下步驟:
[0008]a、將單鏈DNA-1緩沖溶液、單鏈DNA-2緩沖溶液混合在Tris_HCl雜交緩沖液中，加熱，使其互補配對成雙鏈DNA，冷卻至室溫；
[0009]b、取得到的雙鏈DNA、目標DNA緩沖溶液和硝酸銀溶液混合在磷酸緩沖液中，混合，加入轉錄因子培養，得到混合溶液；
[0010]C、將探針DNA滴在處理后的金電極上，室溫培育一夜，清洗后，去除非特異性綁定的巰基DNA，將制備的修飾電極浸入步驟b中所得的混合溶液中吸收，然后，在含有輔助DNA-1和輔助DNA-2的混合溶液中培育，最后，滴Ru (phen) 32+溶液在修飾電極上，培育，得到基于HCR信號放大的無標記電致發光生物傳感器。
[0011 ] 在步驟a之前，首先將購買的DNA探針、目標DNA、單鏈DNA-1、單鏈DNA-2、輔助DNA-
1、輔助DNA-2分別溶解在Tris-HCl緩沖溶液中，得到濃度均為ΙΟΟμΜ的DNA探針緩沖溶液、目標DNA緩沖溶液、單鏈DNA-1緩沖溶液、單鏈DNA-2緩沖溶液、輔助DNA-1緩沖溶液、輔助DNA-2緩沖溶液，并在4°C下保存備用；后續使用時根據需要稀釋;所述Tris-HCl緩沖溶液，具體為:0.0lM pH 7.4的Tris-HCl緩沖溶液。
[0012]進一步的，巰基化DNA(SH-CP)序列為:5’-SH-GAAAGGG-3’；
[0013]目標DNA序列為:5’-TTTTTTTTCCCTTTC-3’；
[0014]單鏈DNA-1序列為:5’-TTTTTTTTCCCTTTCAGGGGAGTA-3’；
[0015]單鏈DNA-2序列為:5，-AAAAAAAAGGGAAAGTCCCCTCAT-3，；
[0016]輔助DNA-1序列為:5’-AAAAAAAAGTACTATTTTTTTT-3’；
[0017]輔助DNA-2序列為:5’ -TTTTTTTTTCGTACAAAAAAAA-3 ’。
[0018]步驟a具體為:將單鏈DNA-1緩沖溶液、單鏈DNA-2緩沖溶液稀釋至濃度為5μΜ，各取5yL，混合在1yL濃度為0.0lM的Tris-HCl雜交緩沖液中，在95°C加熱5min，單鏈DNA-1和單鏈DNA-2通過堿基互補配對成雙鏈DNA，然后冷卻至室溫;所述的Tris-HCl雜交緩沖液為:pH為7.4，含有10mM NaCl和ImM EDTA。
[0019]步驟b具體為:取2yL步驟b制備的雙鏈DNA、10yL 2.5μΜ目標DNA緩沖溶液，2yL 500μΜ的硝酸銀溶液混合在I OmM磷酸緩沖液中，37 °C下混合30分鐘，然后加入I OyL的轉錄因子，37 °C下培育I Omin，終體積為50yL;得到混合溶液；
[0020]步驟b中所述磷酸緩沖液pH為7.4，含有200mM亞硝酸鈉；
[0021]步驟c處理后的電極具體為:將金電極先浸入食人魚洗液30分鐘，然后用去離子水徹底清洗，再依次用直徑0.3和0.5mm的鋁粉進行拋光處理，再依次用去離子水、乙醇溶液、超純水超聲清洗5分鐘，之后，再將電極浸入0.5M的硫酸溶液中進行電化學清洗，掃描電壓為0.2-1.6V，直至出現穩定的伏安圖，最后在氮氣中干燥，得到處理后的電極;所述食人魚洗液為體積比3:1的濃硫酸與過氧化氫混合溶液。
[0022]步驟c具體為:滴1yL濃度為2μΜ的DNA探針緩沖溶液在處理后的金電極上，室溫培育一夜，然后，電極表面用去離子水清洗，放在ImM 6-巰基己-1-醇中2小時，以去除非特異性綁定的巰基DNA，然后用1mM pH為7.4磷酸洗液清洗后，修飾電極浸入步驟b中所得的混合溶液中吸收I小時，再次用1mM pH為7.4的磷酸洗液清洗，氮氣干燥，然后，將5yL濃度為IμΜ輔助DNA-1緩沖溶液和5yL濃度為ΙμΜ的輔助DNA-2混合，修飾電極在其中培育2小時，然后，滴1yL 2mM的Ru(phen)32+溶液在修飾電極上培育7小時，得到基于HCR信號放大的無標記電致發光生物傳感器。
[0023]—種檢測轉錄因子的方法，包括以下步驟:
[0024](I)、將單鏈DNA-1緩沖溶液、單鏈DNA-2緩沖溶液混合在Tris-HCl雜交緩沖液中，加熱，使其互補配對成雙鏈DNA，冷卻至室溫；
[0025](2)、取得到的雙鏈DNA、目標DNA緩沖溶液和硝酸銀溶液混合在磷酸緩沖液中，混合，分別加入濃度為O、50、100、200、300、600、1000、2000pM的轉錄因子培養，分別得到混合溶液；
[0026](3)、將探針DNA滴在處理后的金電極上，室溫培育一夜，清洗后，去除非特異性綁定的巰基DNA，將制備的修飾電極浸入步驟(2)中所得的混合溶液中吸收，然后，在含有輔助DNA-1和輔助DNA-2的混合溶液中培育，最后，滴Ru(phen)32+溶液滴在修飾電極上，培育；利用電致化學發光分析儀檢測制備的修飾電極的發光強度;構建轉錄因子濃度與發光強度的線性關系；
[0027](4)根據待檢測轉錄因子的發光強度及所得到的線性關系，得到待檢測轉錄因子的濃度。
[0028]步驟(I)具體為:ECL電致化學發光強度利用MP1-E型電致化學發光分析儀在0.1M磷酸緩沖液(pH 7.4，20mM三丙胺)掃描修飾電極，掃描電壓從O到1.2V，掃速為0.lV/s，光電倍增管高壓設置為400-600V，構建轉錄因子濃度與發光強度的線性關系；
[0029]由于RU(Phen)32+(l，10-鄰二氮菲釕)的信號強度與目標DNA濃度有關，也就與轉錄因子的濃度有關，隨著NF-kB p50(轉錄因子)濃度的增加，ECL(電致化學發光)的峰強度即RU(phen)32+(l，10-鄰二氮菲釕)的信號強度會隨之增加，因此，此傳感器可實現對不同濃度的NF-kB p50(轉錄因子)進行檢測。
[0030]與現有技術相比，本生物傳感器的制備方法，利用RU(Phen)32+(l，10-鄰二氮菲釕)插入雙鏈DNA作為信號分子，步驟簡單，無標記。通過轉錄因子與雙鏈DNA的特異性結合，使得目標DNA從三鏈脫附下來，將脫附下的目標DNA引發HCR雜交鏈式反應，實現更多的Ru(phen)32+(l，10-鄰二氮菲釕)插入，從而使得ECL電致化學發光信號得到放大，構建ECL電致化學發光信號與轉錄因子NF-kB p50濃度的線性關系，ECL強度的測量是在5mL，濃度為0.1M含有20mM的三丙胺的磷酸緩沖液中進行。掃描電壓以0.lV/s的掃速從OV掃到1.2V，光電倍增管電壓設置至400-60(^，所得線性關系為1 = 1066.5+7.9200(:(?1)，線性范圍為0-2000pM，檢測限為0.017nM，相關系數為0.9990。
[0031]與現有技術相比，本發明具有對轉錄因子的檢測具有靈敏度高，檢測限低，選擇性好，穩定性好的特點。
【附圖說明】
[0032]圖1為基于HCR信號放大的無標記電致化學發光檢測轉錄因子的生物傳感器的制備不意圖；
[0033]圖2A為有轉錄因子的傳感器組裝各步驟的循環伏安圖；
[0034]圖2B為無轉錄因子的傳感器組裝各步驟的循環伏安圖；
[0035]a為裸金電極;b為SH-CP修飾的金電極；c為Target DNA/SH-CP修飾的金電極;d為Hi/H2/Target DNA/SH-CP修飾的金電極；
[0036]圖3A為有轉錄因子的傳感器組裝各步驟的阻抗圖；
[0037]圖3B為無轉錄因子的傳感器組裝各步驟的阻抗圖；
[0038]a為裸金電極;b為SH-CP/裸金電極；c為Target DNA/SH-CP/裸金電極；(!為出/出/Target DNA/SH-CP/裸金電極；e為Ru(phen)32+/Target DNA/SH-CP/裸金電極；
[0039]圖4A為有轉錄因子傳感器組裝各步驟的循環伏安圖；
[0040]圖4B為無轉錄因子傳感器組裝各步驟的循環伏安圖；
[0041 ] a為裸金電極;b為裸金電極/TPrA;c為SH-CP/裸金電極/TPrA;d為Target DNA/SH-CP/裸金電極/TPrA ； eSHi/U/Target DNA/SH-CP/裸金電極/TPrA ； f為Ru (phen) 32+/Ηι/Η2/Target DNA/SH-CP/裸金電極/TPrA
[0042]圖5為傳感器可行性圖；
[0043]a為裸金電極；b為SH-CP/裸金電極；c為Ru(phen)32+/Target DNA/SH-CP/裸金電極;d為Ru(phen) 32+/Hi/H2/Target DNA/SH-CP/裸金電極；
[0044]圖6A為基于HCR信號放大的無標記電致化學發光生物傳感器對不同濃度轉錄因子的電致化學發光圖；(電壓-強度)
[0045]圖6B為基于HCR信號放大的無標記電致化學發光生物傳感器對不同濃度轉錄因子的電致化學發光圖；(時間-強度)
[0046]圖6C為轉錄因子的濃度和電信號強度的線性關系圖；
[0047]圖7A基于HCR信號放大的無標記電致化學發光生物傳感器的穩定性圖；
[0048]圖7B基于HCR信號放大的無標記電致化學發光生物傳感器的選擇性圖;a為對人凝血酶的信號強度;b為對人免疫球蛋白的信號強度;c為對牛血清蛋白的信號強度;d為NF-kBp50的信號強度
[0049]圖8為基于HCR信號放大的無標記電致化學發光生物傳感器的實樣檢測圖；a為未處理的核提取物加入NF-kB p50;b為TNF-α處理的核提取物；c為未處理的核提取物;d為不加核提取物。
【具體實施方式】
[0050]本領域公知的以下簡稱對應為:巰基化DNA:SH-CP、目標DNA:Target DNA、單鏈DNA-1: sDNA-Ι、單鏈DNA-2: sDNA-2、輔助DNA-1: Hl、輔助DNA-2: H2。
[0051 ] 實施例1
[0052]—種檢測轉錄因子的方法，包括以下步驟:
[0053](1)將購買的所有0難探針(巰基化0難:3!1-0?:5’-3!1-6444666-3’；目標DNA:Target DNA:5’-TTTTTTTTCCCTTTC_3’ ；單鏈DNA-l:sDNA_l:5’-TTTTTTTTCCCTTTCAGGGGAGTA-3 ’ ；單鏈DNA-2: sDNA-2: 5 ’ -AAAAAAAAGGGAAAGTCCCCTCAT-3 ’ ；輔助DNA-1-U-AAAAAAAAGTACTATTTTTTm ;輔助DNAUd’-TTTTTTTTTCGTACAAAAAAAA-3，)分別溶解在0.0lM Tris-HCl(三羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液)(pH 7.4)緩沖溶液中，其中，巰基化DNA所用緩沖液體積為119yL，目標DNA所用緩沖液體積為88yL，單鏈DNA-1所用緩沖液體積為46yL，單鏈DNA-2所用緩沖液體積為38yL，輔助DNA-1所用緩沖液體積為106yL，輔助DNA-2所用緩沖液體積為11OyL，均得到IΟΟμΜ的原液，并在4°C下保存備用。
[0054](2)、相應的互補配對的sDNA-Ι和sDNA-2各取5yL，濃度為5μΜ，混合在10yL，濃度為
0.0lM Tris-HCK三羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液)雜交緩沖液中(pH 7.4 ,10mM NaCl(氯化鈉)，ImM EDTA(二乙胺四乙酸))，sDNA-1，sDNA_2終濃度均為1.25μΜ，將上述混合物在95°C加熱5分鐘，兩條單鏈DNA通過堿基互補配對成dsDNA(雙鏈DNA)，然后緩慢冷卻至室溫。
[0055](3)、取2yL上述dsDNA(雙鏈DNA)與10μ?，2.5μΜ目標DNA、2yL 500μΜ的硝酸銀溶液混合在1mM磷酸緩沖液中(pH 7.4，200mM亞硝酸鈉)，37°C下混合30分鐘，將1yL濃度分別為O，50，100，200，300，600，1000，2000pM的轉錄因子NF_kB p50分別加入上述體系中，37°C下培育10分鐘;得到混合溶液；
[0056](4)、將金電極先進入食人魚洗液(濃硫酸與過氧化氫體積比3:1混合溶液)30分鐘，然后用去離子水徹底清洗，再依次用直徑0.3和0.5_的鋁粉進行拋光處理，再依次用去離子水、乙醇溶液、超純水超聲清洗5分鐘。之后，再將電極浸入0.5M的硫酸溶液中進行電化學清洗，掃描電壓為0.2-1.6V，直至出現穩定的伏安圖，最后在氮氣中干燥，得到處理后的電極；
[0057](5)、一滴1yL的SH-CP (巰基DNA)滴在處理后的電極上，室溫培育一夜，然后電極表面用去離子水清洗，放在ImM MCH( 6-巰基己-1 -醇)中2小時以去除非特異性綁定的巰基DNA，用I OmM磷酸洗液(pH 7.4)清洗后，修飾電極浸入步驟(3)得到的混合溶液中吸收I小時，得到的修飾電極再次用1mM的磷酸洗液(pH 7.4)清洗，氮氣干燥，然后，在含有5yL濃度為ΙμΜ HjP5yL濃度為ΙμΜ H2的混合反應溶液中培育2小時，然后，一滴1yL 2mM的Ru(phen)32+(l，10-鄰二氮菲釕)溶液滴在修飾電極上培育7小時，最后，ECL強度利用MP1-E型電致化學發光分析儀在0.1M磷酸緩沖液(pH 7.4，20mM三丙胺)掃描修飾電極，掃描電壓從O至IJ1.2V，掃速為0.lV/s，光電倍增管高壓設置為400-600V，得到轉錄因子濃度與發光強度的線性關系。
[0058](6)重復步驟(1)-(5)，將步驟(3)中的濃度分別為0，50，100，200，300，600，1000，2000pM的轉錄因子NF-kB p50替換為相同體積待檢測的轉錄因子，根據步驟(5)構建的線性關系，得到待檢測的轉錄因子的濃度。
[0059]實施例1以轉錄因子NF-kBp50為例，其他種類的轉錄因子檢測，通過改變轉錄因子的識別序列，檢測其他的轉錄因子。
[0060]實施例2
[0061 ]電致化學發光生物傳感器的選擇性分析實驗
[0062]重復實施例1中步驟(1)-(5)，將步驟(3)中的轉錄因子分別替換為相同體積的人凝血酶、人免疫球蛋白或牛血清蛋白，其他條件不變，得到的基于HCR信號放大的無標記電致化學發光生物傳感器的選擇性圖，如圖7B。
[0063]實施例3實樣檢測
[0064]重復實施例1中步驟(1)-(5)，將步驟(3)中的轉錄因子分別替換為a含有InM的NF-kB p50的未處理的，濃度為50ngAiL的海拉細胞核提取物，b TNF-α處理的海拉細胞核提取物，c未處理的海拉細胞核提取物以及d，沒有加入細胞核提取物，其他實驗條件相同，得到基于HCR信號放大的無標記電致化學發光生物傳感器的實樣檢測圖，如圖8。
【主權項】
1.一種基于HCR信號放大的無標記電致發光生物傳感器，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟: a、將單鏈DNA-1緩沖溶液、單鏈DNA-2緩沖溶液混合在Tris-HCl雜交緩沖液中，加熱，使其互補配對成雙鏈DNA，冷卻至室溫； b、取得到的雙鏈DNA、目標DNA緩沖溶液和硝酸銀溶液混合在磷酸緩沖液中，混合，加入轉錄因子培養，得到混合溶液； C、將探針DNA滴在處理后的金電極上，室溫培育一夜，清洗后，去除非特異性綁定的巰基DNA，將制備的修飾電極浸入步驟b中所得的混合溶液中吸收，然后，在含有輔助DNA-1和輔助DNA-2的混合溶液中培育，最后，滴Ru(Phen)32+溶液在修飾電極上，培育，得到基于HCR信號放大的無標記電致發光生物傳感器。2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟a具體為:將單鏈DNA-1緩沖溶液、單鏈DNA-2緩沖溶液稀釋至濃度為5μΜ，各取5yL，混合在1yL濃度為0.0lM的Tris-HCl雜交緩沖液中，在95°C加熱5min，單鏈DNA-1和單鏈DNA-2通過堿基互補配對成雙鏈DNA，然后冷卻至室溫。3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟b具體為:取2yL步驟b制備的雙鏈DNA、1yL 2.5μΜ目標DNA緩沖溶液，2μ?500μΜ的硝酸銀溶液混合在1mM磷酸緩沖液中，37°C下混合30分鐘，然后加入1yL的轉錄因子，37 V下培育1min，終體積為50yL;得到混合溶液。4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟c具體為:滴1yL濃度為2μΜ的DNA探針緩沖溶液在處理后的金電極上，室溫培育一夜，然后，電極表面用去離子水清洗，放在ImM 6-巰基己-1-醇中2小時，以去除非特異性綁定的巰基DNA，然后用1mM pH為7.4磷酸洗液清洗后，修飾電極浸入步驟b中所得的混合溶液中吸收I小時，再次用I OmM pH為7.4的磷酸洗液清洗，氮氣干燥，然后，將5Λ濃度為ΙμΜ輔助DNA-1緩沖溶液和濃度為ΙμΜ的輔助DNA-2混合，修飾電極在其中培育2小時，然后，滴1yL 2mM的Ru(phen)32+溶液在修飾電極上培育7小時，得到基于HCR信號放大的無標記電致發光生物傳感器。5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，巰基化DNA (SH-CP)序列為:5 ’ -SH-GAAAGGG-3 ’ ；目標DNA序列為: 5 ’ -TTTTTTTTCCCTTTC-3 ’ ；單鏈DNA-1 序列為: 5 ’ -TTTTTTTTCCCTTTCAGGGGAGTA-3 ’ ；單鏈DNA-2序列為: 5 ’ -AAAAAAAAGGGAAAGTCCCCTCAT-3 ’ ；輔助DNA-1 序列為: 5 ’ -AAAAAAAAGTACTATTTTTTTT-3 ’ ；輔助DNA-2序列為: 5’-TTTTTTTTTCGTACAAAAAAAA-3’。6.—種檢測轉錄因子的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (I )、將單鏈DNA-1緩沖溶液、單鏈DNA-2緩沖溶液混合在Tris-HCl雜交緩沖液中，加熱，使其互補配對成雙鏈DNA，冷卻至室溫； (2)、取得到的雙鏈DNA、目標DNA緩沖溶液和硝酸銀溶液混合在磷酸緩沖液中，混合，分別加入濃度為O、50、100、200、300、600、1000、2000pM的轉錄因子培養，分別得到混合溶液； (3)、將探針DNA滴在處理后的金電極上，室溫培育一夜，清洗后，去除非特異性綁定的巰基DNA，將制備的修飾電極浸入步驟(2)中所得的混合溶液中吸收，然后，在含有輔助DNA-I和輔助DNA-2的混合溶液中培育，最后，滴Ru(Phen)32+溶液滴在修飾電極上，培育；利用電致化學發光分析儀檢測制備的修飾電極的發光強度;構建轉錄因子濃度與發光強度的線性關系;(4)根據待檢測轉錄因子的發光強度及所得到的線性關系，得到待檢測轉錄因子的濃度。
【文檔編號】G01N21/76GK105842232SQ201610158660
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月18日
【發明人】王廣鳳, 熊云芳
【申請人】安徽師范大學