一種嗜肺軍團菌抗原近紅外熒光檢測試劑盒及其用圖
【專利摘要】本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種嗜肺軍團菌抗原近紅外熒光檢測試劑盒及其用途。本發明提供一種嗜肺軍團菌抗原近紅外熒光檢測試劑盒，包括位于背板上的試劑條，試劑條從加樣端開始依次為樣品墊、標記有免疫熒光探針的玻璃纖維素膜、包被有LP抗體的硝酸纖維素膜和吸水紙。本發明所提供的檢測試劑盒以患者的尿液或痰液作為檢測樣本，結合近紅外熒光檢測技術，可快速，準確的檢測出患者標本中特異性、可溶性LP抗原。
【專利說明】
-種嗜肺軍團菌抗原近紅外黃光檢測試劑盒及其用途
技術領域
[0001] 本發明設及生物技術領域，特別是設及一種嗜肺軍團菌抗原近紅外巧光檢測試劑 盒及其用途。
【背景技術】
[0002] 軍團菌屬的模式菌是嗜肺軍團菌化egionella Pneumo地ila)，占軍團菌的90% (路鳳，程義斌，王仲，等.呼吸系統疾病就診患者嗜肺軍團菌感染的流行病學調查[J].環 境與健康雜質，2012, 27(3) :203-205),其散發病例占社區獲得性肺炎的1% -15%、醫院 內感染肺炎的3. 8%、診斷困難的不典型肺炎的4%-11% (陸風，金銀龍，程義斌，等.軍 團菌病的流行概況[J].國外醫學：衛生學分冊，2008, 35(2) :78)。軍團病化egionnaires disease)主要是由嗜肺軍團菌引起的一種細菌性呼吸道傳染病。針對尿液中LP抗原的 檢測方法主要有RIA、及EIA等（張旭，馬妮，鄭洪.環境中軍團菌快速檢測方法的研究進 展.[J].中國衛生檢驗雜志，2009, 19(1) :210-241)。但是，RIA法具有放射性，EIA耗時較 長且感染初期血清中抗體含量達不到檢測水平，不適合臨床檢測應用。我國現階段對于嗜 肺軍團菌的檢測技術水平仍相對滯后（朱家馨，陳文思，黃靜，等.一種國產嗜肺軍團菌抗 原檢測試劑盒的初步評價[J].實用醫學雜志，2010, 26巧）：1637-1638)。因此，開發一種可 W快速準確的檢測嗜肺軍團菌的方法已成為臨床檢測研究中亟待解決的問題。
【發明內容】
[0003] 鑒于W上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種嗜肺軍團菌抗原近紅 外巧光檢測試劑盒及其用途，用于建立高效可行的嗜肺軍團菌抗原近紅外巧光檢測技術， 解決現有技術中的問題。
[0004] 為實現上述目的及其他相關目的，本發明第一方面提供一種嗜肺軍團菌抗原近紅 外巧光檢測試劑盒，包括位于背板上的試劑條，試劑條從加樣端開始依次為樣品墊、標記有 免疫巧光探針的玻璃纖維素膜、包被有LP抗體的硝酸纖維素膜和吸水紙。 陽〇化]優選的，所述免疫巧光探針為LP抗體包被的近紅外巧光乳膠微球顆粒。
[0006] 更優選的，所述巧光乳膠微球顆粒的直徑為140-160nm。
[0007] 近紅外光（NIR)，是介于可見光（VI巧和中紅外光（MIR)之間的電磁波，ASTM定義 NIR為波長在780nm-2526皿范圍內的電磁波。在近紅外光區，生物體自吸收或巧光強度很 小，可避免背景干擾。同時由于散射光強度與波長的四次方呈反比，近紅外區的散射干擾大 為減少。
[0008] 本發明第二方面提供所述嗜肺軍團菌抗原近紅外巧光檢測試劑盒的制備方法，包 括如下步驟：
[0009] 1)用憐酸鹽緩沖液將巧光乳膠微粒離屯、清洗并將乳膠顆粒分散（將巧光乳膠微 粒用PH7. 3,0.0 lmol/L的憐酸鹽緩沖溶液清洗，10000巧m離屯、lOmin，離屯、后的沉淀物用憐 酸鹽緩沖液復溶，并用超聲波細胞粉碎機將乳膠微粒分散，此步驟重復兩次），在清洗好的 乳膠顆粒中加入LP抗體；加入邸CA使抗體與顆粒偶聯；再加入乙醇胺封閉乳膠顆粒上多 余的基團，制備獲得探針溶液；
[0010] 2)利用微量蛋白點膜系統將含有LP抗體的緩沖溶液噴加到硝酸纖維素膜上，烘 干備用；
[0011] 3)用制備好的探針溶液浸潤玻璃纖維薄膜，真空干燥機中干燥備用；
[0012] 4)將包被LP抗體的硝酸纖維素膜、標記有免疫巧光探針的玻璃纖維素膜、樣品 墊、吸水紙及背板組裝制備成嗜肺軍團菌抗原近紅外巧光檢測試劑盒。
[0013] 優選的，所述步驟1中，憐酸鹽緩沖液為0. 009-0.0 llmol/l，PH7. 25-7. 35的憐酸 鹽緩沖液。
[0014] 優選的，所述步驟1中，巧光乳膠微粒的直徑為140-160nm。
[0015] 優選的，所述步驟1中，乳膠顆粒、LP抗體、邸CA的重量比為9-11 :0. 9-1. 1 : 0. 9-1. 1。
[0016] 在本發明一實施例中，乳膠顆粒、LP抗體、邸CA的投料量分別為lmg、100ug、 lOOugo
[0017] 所述步驟1中乙醇胺的加入量為適量，本領域技術人員可根據實際情況調整乙醇 胺的用量。
[0018] 優選的，所述步驟2中，所述緩沖溶液為PBS緩沖液。
[0019] 本領域技術人員可選取適當濃度和抑的PBS緩沖液。
[0020] 優選的，所述步驟2中，含有LP抗體的緩沖溶液中LP抗體的濃度為1. 8-2. 2mg/ ml。
[0021] 優選的，所述步驟2中，LP抗體的噴加量為0. 9-1. lul/cm。
[0022] 優選的，所述步驟2中，烘干的具體條件為36-38Γ烘箱烘干。
[0023] 優選的，所述LP抗體的制備方法如下：
[0024] 1)抗原的制備：將嗜肺軍團菌菌株接種在培養基上，培養后用生理鹽水從平板上 洗脫細菌，離屯、獲取菌泥（同時去除平板被洗脫的液體成分），菌泥加適量PBS緩沖液超聲 破裂，過陰離子柱純化，用化C1水溶液洗涂，再用化C1水溶液洗脫，洗脫液裝透析袋，用PEG 包埋吸水濃縮，獲取抗原；
[0025] 優選的，所述嗜肺軍團菌菌株購自ATCC。
[00%] 優選的，所述抗原的制備過程中的培養條件具體為：37°C、5% C02的條件下培養， 3-5天后洗下菌苔。
[0027] 優選的，所述抗原的制備過程中的培養基為緩沖活性碳酵母瓊脂培養基度CYE)。
[0028] 優選的，所述離屯、獲取菌泥的條件為4500-550化pm。
[0029] 優選的，所述用化化水溶液洗涂時，化Cl的溶液濃度為45-55mM。
[0030] 優選的，所述用化Cl水溶液洗脫時，化Cl的溶液濃度為135-165mM。
[0031] 2)單克隆抗體的制備：
[0032] 動物免疫對小鼠進行免疫；
[0033] 優選的，所述對小鼠進行免疫具體包括如下步驟：第一次免疫時抗原加等量的福 氏完全佐劑充分乳化，第二次及第Ξ次抗原加等量福氏不完全佐劑充分乳化，細胞融合前 腹腔直接注射抗原加強免疫，一免抗原加福氏完全佐劑，皮下免疫，抗原量為0.1 mg/鼠，15 天后2免，皮下免疫抗原加福氏不完全佐劑，抗原量為0. 2mg/鼠，25天后Ξ免抗原加福氏不 完全佐劑，皮下免疫，抗原量為0. 2mg/鼠，10天后剪尾己取血測化ISA效價，選取效價大于 10萬倍的小鼠進行加強免疫，水劑腹腔注射抗原Img/鼠，Ξ天后取脾臟細胞融合；
[0034] 細胞融合：處死小鼠，無菌操作取出脾臟，制備B淋己細胞懸浮液，將B淋己細胞與 準備好的處于對數生長期的同系SP2/0骨髓瘤細胞混合，制備雜交瘤細胞，并進行雜交瘤 細胞篩選；
[0035] 優選的，所述單克隆抗體的制備過程中雜交瘤細胞篩選的具體方法為：用HAT培 養基培養細胞，2周后即可篩選出骨髓瘤細胞與B淋己細胞的雜交瘤細胞。
[0036] 雜交瘤細胞的克隆化：克隆細胞生長的各個孔檢測100%抗體陽性為止；
[0037] 優選的，所述克隆化的方法是有限稀釋法。
[003引抗體的制備：將小鼠首先腹腔注射石蠟，1-2周后，腹腔內接種雜交瘤細胞，1-2周 后，用注射器抽取腹水，純化后即可獲得大量的單克隆抗體。優選的，所述腹腔內接種雜交 瘤細胞時，將雜交瘤細胞濃度調節到IX 105個/ml按每只小鼠腹腔注射1ml接種。
[0039] 優選的，所述單克隆抗體的制備過程中，小鼠為6-8周齡BALB/C小鼠。
[0040] 優選的，單克隆抗體的純化：選擇化Trap巧rotein A FF 5ml預裝色譜柱純化抗 體，收集純化的抗體備用。
[0041] 本發明第Ξ方面提供所述嗜肺軍團菌抗原近紅外巧光檢測試劑盒在嗜肺軍團菌 抗原檢測領域的用途。
[0042] 所述用途具體為使用所述嗜肺軍團菌抗原近紅外巧光檢測試劑盒對嗜肺軍團菌 抗原進行檢測。 陽0創近紅外光（NIR)是介于可見光（VI巧和中紅外光（MIR)之間的電磁波，ASTM定義 NIR為波長在780nm-2526皿范圍內的電磁波。在近紅外光區，生物體自吸收或巧光強度很 小，可避免背景干擾。同時由于散射光強度與波長的四次方呈反比，近紅外區的散射干擾大 為減少。隨著激光巧光、傳感器、免疫檢測裝置的建立，近紅外巧光分析儀在免疫測定領域 中顯示出極大的優越性。
[0044] 本發明所提供的檢測試劑盒W患者的尿液或疲液作為檢測樣本，結合近紅外巧光 檢測技術，可快速，準確的檢測出患者標本中特異性、可溶性LP抗原。LP抗原近紅外巧光檢 測法靈敏度高，特異性好，檢測過程中樣品收集及處理簡單，可快速準確的獲得結果，非常 適合突發事件現場和基層使用。
[0045] 嗜肺軍團菌抗原近紅外巧光檢測技術靈敏度高，特異型好，可應用到臨床檢測中， 為臨床治療提供定性依據。
【具體實施方式】
[0046] 細菌培養是LP感染檢測的金標準，但LP的培養條件苛刻，耗時長，不適合臨床檢 測及現場檢測；因感染LP第3-6周后患者血清中抗體含量才能達到檢測水平，達不到疾病 早期診斷的要求，故血清抗體檢測常用于LP感染的流行病學回顧性調查。LD患者在感染 1-3天后即可由尿液排出具有熱穩定性及抗膜蛋白酶活性的LP 0-多糖抗原，該抗原在尿 液中的濃度比血清中高30-100倍。與EIA相比，近紅外巧光檢測法操作更簡便，耗時更短， 是更理想更有發展前景的檢測手段。
[0047] 本發明所提供的嗜肺軍團菌抗原近紅外巧光檢測法，實驗室考核結果顯示，該法 對LP1型抗原的最低檢出量為lOng/ml，不與其他血清型抗原及多種細菌發生交叉反應，與 細菌培養結果較一致，具有較高的敏感性和特異性。由于嗜肺軍團菌培養條件要求苛刻，可 能導致陽性樣品漏檢。整體而言，近紅外巧光法檢測嗜肺軍團菌的可信度及各項性能均已 達到臨床定性檢測的要求，有望用于由嗜肺軍團菌引發的軍團病的快速早期診斷。
[0048] W下通過特定的具體實例說明本發明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書 所掲露的內容輕易地了解本發明的其他優點與功效。本發明還可W通過另外不同的具體實 施方式加 W實施或應用，本說明書中的各項細節也可W基于不同觀點與應用，在沒有背離 本發明的精神下進行各種修飾或改變。
[0049] 在進一步描述本發明【具體實施方式】之前，應理解，本發明的保護范圍不局限于下 述特定的具體實施方案；還應當理解，本發明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體 實施方案，而不是為了限制本發明的保護范圍；在本發明說明書和權利要求書中，除非文中 另外明確指出，單數形式"一個"、"一"和"運個"包括復數形式。
[0050] 當實施例給出數值范圍時，應理解，除非本發明另有說明，每個數值范圍的兩個端 點W及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義，本發明中使用的所有技術和 科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、 材料外，根據本技術領域的技術人員對現有技術的掌握及本發明的記載，還可W使用與本 發明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實 現本發明。
[0051] 除非另外說明，本發明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術 領域常規的分子生物學、生物化學、染色質結構和分析、分析化學、細胞培養、重組DNA技 術及相關領域的常規技術。運些技術在現有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor L油oratory Press，1989and Third edition，2001;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons，化w York,1987and periodic updates ;the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego ；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998 ;METH0DS IN ENZYMOLOGY， Vol. 304,Chromatin(P. M. Wassarman and A. P. Wolffe，eds. )，Academic Press，San Diego， 1999;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, C虹omatin Protocols (P.B. Becker, ed. )Humana Press, Totowa，1999 等。
[0052] 本發明各實施例中試驗菌種由軍事醫學科學院提供；交叉實驗所用細菌由本實驗 室培養保存。近紅外巧光檢測儀，由上海凱創生物技術有限公司開發提供。 陽〇5引實施例1
[0054] 1.疲液采集及保存 陽化5] 患者在醫務人員指導下，用力咳出呼吸道深部的疲液，吐至無菌廣口瓶內，立即蓋 緊蓋子保存備用，待處理的樣本應置于4°C冰箱保存。
[0056] 2.尿液采集及保存
[0057] 患者在醫務人員的指導下清洗并收集清晨第一次尿液，收集的尿液裝在干凈無菌 的容器中保存備用。尿液樣本在2-8°C條件下可W保存72小時，如需保存更長時間，則必須 將樣品保存在-20°C環境下。應避免反復凍融樣品，否則會產生錯誤的實驗結果。樣品不可 保存在自動除霜冰箱中。 陽化引 3.抗原的制備：
[0059] 從ATCC購買嗜肺軍團菌菌株，接種在緩沖活性碳酵母瓊脂培養基度CY巧上， 37°C、5% C02的條件下培養，3-5天后用生理鹽水從平板上洗脫細菌，500化pm離屯、獲取菌 泥（同時去除平板被洗脫的液體成分），菌泥加適量PBS緩沖液超聲破裂，過陰離子柱純化， 用50mM化C1洗涂，再用150mM化C1洗脫，洗脫液裝透析袋，用陽G包埋吸水濃縮，獲取抗 原。
[0060] 4. LP單克隆抗體的制備： 陽06U 動物免疫：選擇6-8周齡BALB/C小鼠進行免疫，第一次免疫時抗原加等量的福氏 完全佐劑充分乳化，第二次及第Ξ次抗原加等量福氏不完全佐劑充分乳化，細胞融合前3 天腹腔直接注射抗原加強免疫，一免抗原加福氏完全佐劑，皮下免疫，抗原量為0.1 mg/鼠， 15天后2免，皮下免疫抗原加福氏不完全佐劑，抗原量為0. 2mg/鼠，25天后Ξ免抗原加福 氏不完全佐劑，皮下免疫，抗原量為0. 2mg/鼠，10天后剪尾己取血測化ISA效價，選取效價 大于10萬倍的小鼠進行加強免疫，水劑腹腔注射抗原Img/鼠，Ξ天后取脾臟細胞融合； 陽06引細胞融合：采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟，制備B淋己細胞懸 浮液，將B淋己細胞與準備好的處于對數生長期的同系SP2/0骨髓瘤細胞混合，制備雜交瘤 細胞；
[0063] 雜交瘤細胞篩選：用HAT培養基培養細胞，2周后即可篩選出骨髓瘤細胞與B淋己 細胞的雜交瘤細胞；
[0064] 雜交瘤細胞的克隆化：克隆化的方法是有限稀釋法，按照實驗室的常規方法進行， 克隆化3-4次，直至克隆細胞生長的各個孔檢測100%抗體陽性為止； W65] 抗體的制備：取BALB/C小鼠，首先腹腔注射石蠟，1-2周后，腹腔內接種雜交瘤細 胞，將雜交瘤細胞濃度調節到1X 1〇5個/ml按每只小鼠腹腔注射1ml接種。1-2周后，用注 射器抽取腹水，即可獲得大量的單克隆抗體。
[0066] 單克隆抗體的純化：選擇化Trap巧rotein A FF 5ml預裝色譜柱純化抗體，收集純 化的抗體備用。
[0067] 5.免疫巧光LP抗體顆粒制備： W側用0. 01mol/L，PH7. 3 + 0. 05的憐酸鹽緩沖液將直徑為150皿的巧光乳膠微粒離屯、 清洗2遍并將乳膠顆粒分散，在清洗好的乳膠顆粒中加入LP抗體；加入邸CA使抗體與顆粒 偶聯；加入乙醇胺封閉乳膠顆粒上多余的基團按每毫克微球乳膠100微克的待標記抗體， 100微克的邸CA用量標記。每毫克的微球乳膠最后加20微克的乙醇胺進行封閉。
[0069] 6.試劑盒的制備： 陽070] 用0. 01M pH7. 2的PBS緩沖液稀釋LP抗體至最適濃度2. Omg/ml，利用微量蛋白點 膜系統將溶液噴加到適當孔徑的硝酸纖維素膜上，按lul/cm的量進行噴膜，37°C烘箱烘干 備用。
[0071] 用制備的巧光乳膠微粒-抗體復合物浸潤玻璃纖維薄膜，真空干燥機中干燥備 用。
[0072] 將包被LP抗體的硝酸纖維素膜、標記有免疫巧光探針的玻璃纖維素膜、樣品墊、 吸水紙及背板組裝制備成嗜肺軍團菌抗原近紅外巧光檢測試劑盒。 陽〇7引 實施例2
[0074] 嗜肺軍團菌抗原近紅外巧光檢測法與疲液細菌培養對比實驗： 陽0巧]疲液細菌培養：
[0076] 將疲液進行預處理（采用lug/ml膜酶溶液與玻璃碎片振蕩相結合的方法對疲液 進行前處理后再接種培養），預處理后的樣品立即接種在GVPC選擇性培養基上，對疑似嗜 肺軍團菌的菌落進行革蘭染色，并將革蘭染色陰性的疑似菌落接種在BCYE-a和BCYE-Cys 瓊脂平板上，37°C溫箱培養2d。凡是在BCYE-a培養基上生長而在BCYE-切S培養基上不生 長的菌落即可認為是嗜肺軍團菌。
[0077] 試劑盒檢測： 陽07引待測樣品為疲液稀釋液，使用0. 01M pH7. 2的PBS緩沖液稀釋，稀釋比例為1 :1。
[0079] 待測樣品及試劑盒均平衡至室溫開始檢測，用滴管在每個試劑盒的加樣孔內滴加 3滴樣本（約120-150U1)。15分鐘時，用近紅外巧光檢測儀檢測巧光信號，并用巧光儀器 進行判斷，分析儀的對巧光信號的檢測范圍是AD值0-10000,根據儀器的性能，CUTOFF值為 50,檢測AD值大于等于50為陽性結果。
[0080] 實驗結果與細菌培養結果對比驗證。用于細菌培養的疲液樣本與尿液樣本來自相 同的患者。嗜肺軍團菌抗原近紅外巧光檢測法與疲液細菌培養結果如表1所示： W81]表 1
[0082]
[0084] Sensitivity = 75%
[00 化]Specificity = 94. 11 %
[0086] 此外，W尿液為待測樣品時，其檢測結果與疲液細菌培養檢測結果相符。
[0087] 實施例3
[0088] 交叉實驗：
[0089] 在嗜肺軍團菌抗原近紅外檢測試劑盒分別滴加制備好的糞腸球菌、尿腸球菌、大 腸埃希菌、鮑曼不動桿菌、克雷伯菌、乳酸桿菌、淋病奈瑟菌、綠脈假單胞菌、大腸桿菌、人型 支原體、解脈脈原體、金黃色葡萄球菌、鏈球菌及幽口螺旋菌菌液（1 X l〇6cFU/ml)，進行交 叉實驗檢測，檢測W上細菌是否對本試劑盒檢測結果產生影響，嗜肺軍團菌抗原近紅外巧 光檢測試劑與細菌交叉實驗結果如表2所示，各細菌交叉實驗中均無交叉反應發生：
[0090] 表 2
[0091]
[0092] 由實施例2中的表1和實施例3中的表2可W看出，在共30份臨床樣本的檢測中， 經近紅外巧光檢測法檢測LP陽性為4例，陰性為26例；疲液細菌培養LP陽性樣本為3例， 陰性樣本為27例。本方法的靈敏度為75%，特異性為94. 11% ;不與其他細菌發生交叉反 應；最低測出量為lOng/ml，穩定性及重復性良好。
[0093] 綜上所述，本發明有效克服了現有技術中的種種缺點而具高度產業利用價值。
[0094] 上述實施例僅例示性說明本發明的原理及其功效，而非用于限制本發明。任何熟 悉此技術的人±皆可在不違背本發明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術領域中具有通常知識者在未脫離本發明所掲示的精神與技術思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應由本發明的權利要求所涵蓋。
【主權項】
1. 一種嗜肺軍團菌抗原近紅外熒光檢測試劑盒，包括位于背板上的試劑條，試劑條從 加樣端開始依次為樣品墊、標記有免疫熒光探針的玻璃纖維素膜、包被有LP抗體的硝酸纖 維素膜和吸水紙。2. 如權利要求1所述的一種嗜肺軍團菌抗原近紅外熒光檢測試劑盒，其特征在于，所 述免疫熒光探針為LP抗體包被的近紅外熒光乳膠微球顆粒。3. 如權利要求1-2任一權利要求所述的嗜肺軍團菌抗原近紅外熒光檢測試劑盒的制 備方法，包括如下步驟： 1) 用磷酸鹽緩沖液將熒光乳膠微粒離心清洗并將乳膠顆粒分散，在清洗好的乳膠顆粒 中加入LP抗體；加入EDCA使抗體與顆粒偶聯；再加入乙醇胺封閉乳膠顆粒上多余的基團， 制備獲得探針溶液； 2) 利用微量蛋白點膜系統將含有LP抗體的緩沖溶液噴加到硝酸纖維素膜上，烘干備 用； 3) 用制備好的探針溶液浸潤玻璃纖維薄膜，真空干燥機中干燥備用； 4) 將包被LP抗體的硝酸纖維素膜、標記有免疫熒光探針的玻璃纖維素膜、樣品墊、吸 水紙及背板組裝制備成嗜肺軍團菌抗原近紅外熒光檢測試劑盒。4. 如權利要求3所述的嗜肺軍團菌抗原近紅外熒光檢測試劑盒的制備方法，其特征在 于，所述步驟1中，熒光乳膠微粒的直徑為140-160nm。5. 如權利要求3所述的嗜肺軍團菌抗原近紅外熒光檢測試劑盒的制備方法，其特征在 于，所述步驟1中，乳膠顆粒、LP抗體、EDCA的重量比為9-11 :0.9-1. 1 :0.9-1. 1。6. 如權利要求3所述的嗜肺軍團菌抗原近紅外熒光檢測試劑盒的制備方法，其特征在 于，所述步驟2中，LP抗體的噴加量為：1. 8-2. 2mg/ml的抗體溶液按0. 9-1. lul/cm的噴量 制備免疫硝酸纖維素膜。7. 如權利要求3所述的嗜肺軍團菌抗原近紅外熒光檢測試劑盒的制備方法，其特征在 于，所述LP抗體的制備方法如下： 1) 抗原的制備：將嗜肺軍團菌菌株接種在培養基上，培養后用生理鹽水從平板上洗脫 細菌，離心獲取菌泥，菌泥加適量緩沖液超聲破裂，過陰離子柱純化，洗滌后洗脫，洗脫液裝 透析袋，用PEG包埋吸水濃縮，獲取抗原； 2) 單克隆抗體的制備： 動物免疫：對小鼠進行免疫； 細胞融合：處死小鼠，無菌操作取出脾臟，制備B淋巴細胞懸浮液，將B淋巴細胞與準備 好的處于對數生長期的同系SP2/0骨髓瘤細胞混合，制備雜交瘤細胞，并進行雜交瘤細胞 篩選； 雜交瘤細胞的克隆化：克隆細胞生長的各個孔檢測100%抗體陽性為止； 抗體的制備：將小鼠首先腹腔注射石蠟，1-2周后，腹腔內接種雜交瘤細胞，1-2周后， 用注射器抽取腹水，純化后即可獲得大量的單克隆抗體。8. 如權利要求1-2任一權利要求所述的嗜肺軍團菌抗原近紅外熒光檢測試劑盒在嗜 肺軍團菌抗原檢測領域的用途。
【文檔編號】G01N33/543GK105823874SQ201510006063
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2015年1月6日
【發明人】姜小華
【申請人】中國人民解放軍第八五醫院