水溶性寡肽的萃取方法及測定方法
【專利摘要】本發明公開了一種水溶性寡肽的萃取方法，包括：制備含水溶性寡肽的給出相溶液；將附著有陽離子載體中間相的中空纖維膜的一端熱封，向所述中空纖維膜內緩慢注射接收相溶液，并熱封所述中空纖維膜的另一端，制備成離子載體輔助的溶劑棒微萃取裝置；將所述離子載體輔助的溶劑棒微萃取裝置轉移至裝有所述給出相溶液的容器中并振蕩一段時間，進而把水溶性寡肽從所述給出相溶液萃取到接收相溶液。本發明還公開了一種水溶性寡肽血漿樣品的測定方法。通過上述實施方式，水溶性寡肽富集倍數高，有利于提高水溶性寡肽的分析效率。
【專利說明】
水溶性寡肽的萃取方法及測定方法
技術領域
[0001 ]本發明涉及一種水溶性寡肽的萃取方法及測定方法。
【背景技術】
[0002]水溶性肽生物樣品因其含量低、雜質多和不易被有機溶劑萃取等特點，其快速萃取、富集和準確定量分析是目前水溶性肽生物樣品檢測的難點。目前水溶性肽生物樣品多采用化學方法或有機溶劑方法去除蛋白后旋轉蒸發或氮吹等去除有機溶劑的提取方式。存在費時費力、去除雜質效果不好、基質效應高，水溶性肽濃度低等缺點。
[0003]肽類分析物的分析方法主要包括免疫法、高效液相色譜法(HPLC)電泳法(CE)和液相色譜-質譜法(HPLC-MS)等，其中HPLC是肽類分析物含量測定應用最廣泛的技術，反相高效液相色譜法(RP-HPLC)用于寡肽分析具有成本低、操作簡單、較高的分辨率，能夠應用于大量樣品分析等優點。但是，當生物基質中肽的濃度很低，結構與內源性物質非常接近或相似時，HPLC靈敏度低、特異性不強的缺點會凸顯，因此需要一個高效、靈敏的前處理過程。然而，常規液相萃取方法并不適用從生物樣品中萃取水溶性肽。
【發明內容】
[0004]本發明為解決上述技術問題提供一種水溶性寡肽的萃取方法及測定方法，該萃取方法使水溶性寡肽富集倍數高，有利于提高水溶性寡肽的分析效率。
[0005]為解決上述技術問題，本發明提供一種水溶性寡肽的萃取方法，包括如下步驟:制備含水溶性寡肽的給出相溶液;將附著有陽離子載體中間相的中空纖維膜的一端熱封，向所述中空纖維膜內緩慢注射接收相溶液，并熱封所述中空纖維膜的另一端，制備成離子載體輔助的溶劑棒微萃取裝置;將所述離子載體輔助的溶劑棒微萃取裝置轉移至裝有所述給出相溶液的容器中并振蕩一段時間，進而把水溶性寡肽從所述給出相溶液萃取到接收相溶液。
[0006]進一步地，在制備含水溶性寡肽的給出相溶液的步驟之中，包括:取適量含水溶性寡肽的溶液并進行蛋白沉淀;對所述溶液進行離心分離后取上清液；向所述上清液中加入緩沖液調節PH值至適量值以作為所述給出相溶液。
[0007]進一步地，所述水溶性寡肽是降血壓肽，所述溶液是血漿；在進行沉淀的步驟之中，具體為:對所述血漿進行醇沉淀，其中，向所述血漿中加入甲醇并調配至血漿:甲醇的比例為1: 3?1: 5以進行醇沉淀；在對所述血漿進行醇沉淀的步驟之后，包括:將所述血漿搖勻，并冷卻至4±0.5°C。
[0008]進一步地，在對所述血楽進行離心分離后取上清液的步驟之中:在轉速12000rpm、時長5min、溫度4°C的條件下進行離心分離。
[0009]進一步地，在向所述上清液中加入緩沖液調節pH值至適量值的步驟之中:用添加氫氧化鈉的磷酸鹽緩沖液調節所述上清液的PH值至9-13。
[0010]進一步地，在將附著有陽離子載體中間相的中空纖維膜的一端熱封的步驟之中，具體為:將所述中空纖維膜在室溫下浸入含有陽離子載體的有機溶液中間相5-8min后取出；在將所述中空纖維膜轉移至裝有所述給出相溶液的容器中并振蕩一段時間中，采用渦旋振蕩儀振蕩10-90min。
[00?1 ]進一步地，所述陽離子載體為al iguat336，其濃度范圍為1%_20%;所述有機溶劑選用正辛醇、甲苯、二甲苯和鄰苯二甲酸二丁酯中的一種。
[0012]進一步地，所述接收相溶液為添加鹽酸的pH值為1-5、濃度為lm0l/L-4m0l/L的NaCl溶液。
[0013]為完整解決上述技術問題，本發明還提供一種水溶性寡肽的測定方法，包括如下步驟:制備含水溶性寡肽的給出相溶液;將附著有陽離子載體中間相的中空纖維膜的一端熱封，向所述中空纖維膜內緩慢注射接收相溶液，并熱封所述中空纖維膜的另一端，制備成離子載體輔助的溶劑棒微萃取裝置;將所述離子載體輔助的溶劑棒微萃取裝置轉移至裝有所述給出相溶液的容器中并振蕩一段時間，進而把水溶性寡肽從所述給出相溶液萃取到接收相溶液;吸取一定量的接收相溶液并注入裝有襯管的液相瓶中；將所述接收相溶液稀釋5-10倍后進行高效液相色譜檢測。
[0014]進一步地，所述高效液相色譜檢測的色譜條件為流動相為各含有0.1%TFA的乙腈和水，所述乙腈與所述水的比例為18:82，流速ImL.min—1，檢測波長202nm，柱溫35 °C，1yL進樣。
[0015]本發明實施方式的水溶性寡肽的萃取方法及測定方法，該萃取方法使水溶性寡肽富集倍數高，有利于提高水溶性寡肽的分析效率。
【附圖說明】
[0016]圖1是本發明水溶性寡肽的萃取方法實施方式的流程圖。
[0017]圖2是圖1所示水溶性寡肽的萃取方法中制備含水溶性寡肽的給出相溶液的流程圖。
[0018]圖3是本發明水溶性寡肽的測定方法實施方式的流程圖。
【具體實施方式】
[0019]下面結合附圖和實施方式對本發明進行詳細說明。
[0020]參閱圖1，本發明提供一種水溶性寡肽的萃取方法。該方法包括如下步驟:
步驟SI，制備含水溶性寡肽的給出相溶液。
[0021]步驟S2，將附著有陽離子載體中間相的中空纖維膜的一端熱封，向中空纖維膜內緩慢注射接收相溶液，并熱封中空纖維膜的另一端，制備成離子載體輔助的溶劑棒微萃取裝置。采用中空纖維膜能夠增加萃取液滴的穩定性，避免有機溶劑的損失，而且大分子物質、雜質不能進入有機溶劑。其中，陽離子載體中間相附著于中空纖維膜的膜壁內，接收相溶液注入于中空纖維膜的內腔內。
[0022]步驟S3，將離子載體輔助的溶劑棒微萃取裝置轉移至裝有給出相溶液的容器中并振蕩一段時間，進而把水溶性寡肽從給出相溶液萃取到接收相溶液。舉例而言，可選渦旋振蕩儀振蕩10-90min。
[0023]如圖2所示，在步驟SI之中，包括如下子步驟: 步驟Sll，取適量含水溶性寡肽的溶液，并對其進行蛋白沉淀以抑制寡肽的進一步酶解。
[0024]在一【具體實施方式】中，該水溶性寡肽通常可以是降血壓肽，該溶液可以是血漿。進而，該蛋白沉淀步驟具體可以為:對血漿進行醇沉淀。
[0025]具體而言，向血漿中加入甲醇，血漿:甲醇比例為1: 3?1: 5，然后進行醇沉淀以去除血漿中的蛋白。在醇沉淀之后，可以將血漿搖勻，并冷卻至4 ± 0.5°C。冷卻時可以將血漿置入冰箱等冷卻設備進行，在預設為4±0.5°C的冰箱等設備中，通常冷卻降溫5-lOminSP可。
[0026]步驟SI 2，對溶液進行離心分離后取上清液。
[0027]以溶液為含降血壓肽的血漿為例進行說明，該離心分離的條件可以設置為:轉速12000rpm、時間5min、溫度4°C。
[0028]步驟S13，向上清液中加入緩沖液調節pH值至適量值以作為給出相溶液。其中，可以用添加氫氧化鈉的磷酸鹽緩沖液調節上清液的PH值至9-13。
[0029]在一【具體實施方式】中，具體在步驟S2中，需要先準備附著有陽離子載體中間相的中空纖維膜，具體準備步驟為:將中空纖維膜在室溫下浸入含有陽離子載體有機溶液的中間相5-8min后取出。該陽離子載體可以選用aliguat336，其濃度范圍可選為1%_20%。進一步地，有機溶劑的選擇要求對水溶性寡肽有足夠大的溶解度，以得到較高的萃取效率，在水中有較小的溶解度盡量減少在萃取過程中的損失，舉例而言，有機溶劑可選用正辛醇、甲苯、二甲苯和鄰苯二甲酸二丁酯中的任意一種。
[0030]上述實施方式中，接收相溶液可選用添加鹽酸的pH值為1-5、濃度為lm0l/L-4m0l/L的NaCl溶液。
[0031]本發明的萃取原理是在較高的pH條件下，水溶性寡肽陰離子(具體如降血壓肽)由原來不容易被有機溶劑萃取的的被分析物，依靠離子載體的主動運輸功能，暫時變成了易于進入中空纖維膜的疏水離子對化合物。當離子對化合物到達中空纖維膜腔內水相的接收相時，受PH和鹽效應的影響，重新解離，向中空纖維膜腔內接收相釋放被分析物。因為接收相溶液的體積遠遠小于樣品溶液的體積，所以分析物具有富集效應。
[0032]參閱圖3，本發明還提供一種水溶性寡肽的測定方法。該方法包括上述步驟S1-S3，還包括:
步驟S4，從由步驟S1-S3制備的接收相溶液中，吸取一定量的接收相溶液并注入裝有襯管的液相瓶中。
[0033]步驟S5，將接收相溶液稀釋5-10倍后進行高效液相色譜檢測。
[0034]〈實施例1>
(I)樣品準備
取適量含5yg/mL水溶性降血壓肽VLPVPR( Val-Leu-Pro-Val-Pro-Arg)的血漿，按血漿:甲醇=1: 3比例對血楽進行醇沉淀，4°C下經12000rpm/min、離心5min后取上清液，用緩沖液調節pH至12，作為給出相溶液。
[0035](2)萃取過程
先將合適大小的聚偏氟乙烯(PVDF)中空纖維膜浸入離子載體aliquat 336濃度為10%的正辛醇溶液中5min后取出，隨后將中空纖維膜小管的一端熱封，然后用微量進樣器緩慢的將25μ1添加鹽酸的pH值為2，濃度為2mol/L的NaCl溶液加入到中空纖維膜腔中，熱封閉中空纖維膜的另外一端。將該中空纖維膜轉移至裝有8ml給出相的樣品瓶中，置于渦旋速度為650 rpm的禍旋振蕩儀上振蕩50min，取出中空纖維膜。
[0036](3)HPLC 檢測
用微量進樣器吸取20μ1接收相溶液，注入裝有襯管的液相瓶中，稀釋至ΙΟΟμΙ后進行HPLC檢測。
[0037]其中，高效液相色譜檢測的色譜條件可以為流動相為各含有0.1%TFA的乙腈和水，乙腈與水的比例為18:82，流速ImL.min—S檢測波長202nm，柱溫35 °C，1yL進樣。
[0038]根據上述的VLPVPR降血壓肽萃取和測定方法，其線性回歸方程為y= I X 10—5X +
0.331 (R=0.995)，線性范圍為0.2-20 yg/mL，富集倍數為35，回收率為108%。
[0039]〈實施例2>
(I)樣品準備
取適量含lyg/mL水溶性降血壓肽VLPVP(Val-Leu-Pro-Val-Pro)的血漿，按血漿:甲醇=1:3比例對血楽進行醇沉淀，4°C下經12000rpm/min、離心5min后取上清液，用緩沖液調節pH至9，作為給出相溶液。
[0040](2)萃取過程
先將合適大小的聚偏氟乙烯(PVDF)中空纖維膜浸入離子載體aliquat 336濃度為15%的正辛醇溶液中5min后取出，隨后將中空纖維膜小管的一端熱封，然后用微量進樣器緩慢的將25μ1添加鹽酸的pH為4，濃度為1.5mol/L的NaCl溶液加入到中空纖維膜腔中，熱封閉中空纖維膜的另外一端。將該中空纖維膜轉移至裝有8ml給出相的頂空瓶中，置于渦旋速度為600 rpm的禍旋振蕩儀上振蕩40min，取出中空纖維膜。
[0041 ] (3)HPLC 檢測
用微量進樣器吸取20μ1接收相溶液，注入裝有襯管的液相瓶中，稀釋至ΙΟΟμΙ后進行HPLC檢測。
[0042]其中，高效液相色譜檢測的色譜條件可以為流動相為各含有0.1%TFA的乙腈和水，乙腈與水的比例為18:82，流速ImL.min—S檢測波長202nm，柱溫35 °C，1yL進樣。
[0043]根據上述的VLPVP降血壓肽萃取和測定方法，其線性回歸方程為y = 31.654x -8.5251 (R=0.998)，線性范圍為0.2-20 yg/mL，富集倍數為29，回收率為103%。
[0044]本發明實施方式的水溶性寡肽的萃取方法及測定方法，接收相溶液中寡肽富集倍數尚，有利于提尚暴妝的分析效率。
[0045]以上僅為本發明的實施方式，并非因此限制本發明的專利范圍，凡是利用本發明說明書及附圖內容所作的等效結構或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關的技術領域，均同理包括在本發明的專利保護范圍內。
【主權項】
1.一種水溶性寡肽的萃取方法，其特征在于，包括如下步驟: 制備含水溶性寡肽的給出相溶液； 將附著有陽離子載體中間相的中空纖維膜的一端熱封，向所述中空纖維膜內緩慢注射接收相溶液，并熱封所述中空纖維膜的另一端，制備成離子載體輔助的溶劑棒微萃取裝置；將所述離子載體輔助的溶劑棒微萃取裝置轉移至裝有所述給出相溶液的容器中并振蕩一段時間，進而把水溶性寡肽從所述給出相溶液萃取到接收相溶液。2.根據權利要求1所述的水溶性寡肽的萃取方法，其特征在于，在制備含水溶性寡肽的給出相溶液的步驟之中，包括: 取適量含水溶性寡肽的溶液并進行蛋白沉淀； 對所述溶液進行離心分離后取上清液； 向所述上清液中加入緩沖液調節pH值至適量值以作為所述給出相溶液。3.根據權利要求2所述的水溶性寡肽的萃取方法，其特征在于: 所述水溶性寡肽是降血壓肽，所述溶液是血漿； 在進行蛋白沉淀的步驟之中，具體為:對所述血漿進行醇沉淀蛋白，其中，向所述血漿中加入甲醇并調配至血漿:甲醇的比例為1:3?1:5以進行醇沉淀； 在對所述血漿進行醇沉淀的步驟之后，包括:將所述血漿搖勻，并冷卻至4 ± 0.5 °C。4.根據權利要求3所述的水溶性寡肽的萃取方法，其特征在于，在對所述血漿進行離心分離后取上清液的步驟之中:在轉速12000rpm、時長5min、溫度4°C的條件下進行離心分離。5.根據權利要求3所述的水溶性寡肽的萃取方法，其特征在于，在向所述上清液中加入緩沖液調節PH值至適量值的步驟之中:用添加氫氧化鈉的磷酸鹽緩沖液調節所述上清液的pH 值至 9-13 ο6.根據權利要求1所述的水溶性寡肽的萃取方法，其特征在于: 在將附著有陽離子載體的中空纖維膜的一端熱封的步驟之中，具體為:將所述中空纖維膜在室溫下浸入含有陽離子載體的有機溶液中間相中5-8min后取出； 在將所述離子載體輔助的溶劑棒微萃取裝置轉移至裝有所述給出相溶液的容器中并振蕩一段時間中，米用禍旋振蕩儀振蕩10_90min。7.根據權利要求6所述的水溶性寡肽的萃取方法，其特征在于，所述中間相溶液中陽離子載體為aliguat 336，其濃度范圍為1%_20%；有機溶劑選用正辛醇、甲苯、二甲苯和鄰苯二甲酸二丁酯中的一種。8.根據權利要求1所述的水溶性寡肽的萃取方法，其特征在于，所述接收相溶液為添加鹽酸的PH值為1-5、濃度為Imo l/L-4mo 1/L的NaCl溶液。9.一種血漿中水溶性寡肽的測定方法，其特征在于，包括如下步驟: 制備含水溶性寡肽的給出相溶液； 將附著有陽離子載體中間相的中空纖維膜的一端熱封，向所述中空纖維膜內緩慢注射接收相溶液，并熱封所述中空纖維膜的另一端制備成離子載體輔助的溶劑棒微萃取裝置；將所述離子載體輔助的溶劑棒微萃取裝置轉移至裝有所述給出相溶液的容器中并振蕩一段時間，進而把水溶性寡肽從所述給出相溶液萃取到接收相溶液； 吸取一定量的接收相溶液并注入裝有襯管的液相瓶中； 將所述接收相溶液稀釋5-10倍后進行高效液相色譜檢測。10.根據權利要求9所述的血漿中水溶性寡肽的測定方法，其特征在于，所述高效液相色譜檢測的色譜條件為流動相為各含有0.1% TFA的乙腈和水，所述乙腈與所述水的比例為18:82，流速ImL.min—1，檢測波長202nm，柱溫35 °C，1yL進樣。
【文檔編號】G01N30/06GK105823848SQ201610298664
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年5月6日
【發明人】崔淑芬, 王金林, 翁盼偉
【申請人】深圳職業技術學院