一測多評法測定益心復脈顆粒中丹酚酸b和五味子醇甲含量的方法
【專利摘要】本發明涉及一種一測多評法測定益心復脈顆粒中丹酚酸B和五味子醇甲含量的方法。具體為制備益心復脈顆粒供試品溶液和五味子醇甲對照品溶液，將其分別注入高效液相色譜儀，在本發明特定的色譜條件下采用梯度洗脫，測定五味子醇甲的含量，通過一測多評法，利用丹酚酸B與五味子醇甲之間的相對校正因子計算益心復脈顆粒中丹酚酸B的含量。本發明建立的一測多評法進一步提高了該產品的質量控制水平，同時節省檢測成本。
【專利說明】
-測多評法測定益心復脈顆粒中丹齡酸B和五味子醇甲含 量的方法
技術領域
[0001] 本發明設及一種藥物的分析檢測方法，具體設及一種采用一測多評法測定益屯、復 脈顆粒中丹酪酸B和五味子醇甲含量的方法。
【背景技術】
[0002] 益屯、復脈顆粒是天津天±力（迂寧）制藥有限責任公司出品的藥品，其功能主治 為益氣養陰，活血復脈；用于氣陰兩虛，屯、血內阻，胸搏屯、痛，胸悶不舒，屯、惇脈結代。具有載 藥量高、起效快、無異味、攜帶方便等特性。該制劑是由生曬參、黃巧、麥冬、五味子、丹參、川 號6味藥材組成的復方制劑，針對該產品，現有檢測方法僅包含性狀、2個顯色鑒別及檢查 項下的相關檢測項，未進行藥材的定性或定量檢測，不能全面反映產品的質量狀況。
[0003] 由于植物化學成分的復雜性，多指標含量測定已經成為植物來源藥物質量控制的 共識。W傳統測定方法同時測定中藥材中幾種成分，不但面臨對照品難得，檢驗周期長，還 耗能、耗時。一測多評法通過中藥有效成分間存在的內在函數關系和比例關系法，測定一個 成分（對照品易得、廉價、有效者）實現多個成分（對照品難W得到或難供應者）同步測定。 不僅解決了中藥多成分定量和多指標質量控制中存在的對照品缺乏問題，同時實現多指標 同步質量控制反應中藥質量。
[0004] 本發明采用一測多評法針對臣藥五味子和佐藥丹參建立了產品中丹酪酸B和五 味子醇甲含量測定的方法，填補了益屯、復脈顆粒定量控制的空白，使得對該產品能夠進行 更有效的質量分析，更全面反映產品的質量狀況，保證該產品的質量穩定性，同時節省檢測 成本。
【發明內容】
[0005] 本發明設及的一測多評法測定益屯、復脈顆粒中丹酪酸B和五味子醇甲含量的方 法，該方法包括W下步驟：
[0006] 步驟1 :五味子醇甲對照品溶液的制備；
[0007] 步驟2 :益屯、復脈顆粒供試品溶液的制備；
[0008] 步驟3 :將五味子醇甲對照品溶液及益屯、復脈顆粒供試品溶液分別注入高效液相 色譜儀，測定益屯、復脈顆粒供試品溶液中五味子醇甲的含量；
[0009] 步驟4 :通過一測多評法，利用丹酪酸B與五味子醇甲之間的相對校正因子f與丹 酪酸B峰面積計算益屯、復脈顆粒中丹酪酸B的含量。
[0010] 其中，步驟1，五味子醇甲對照品溶液的制備方法如下：
[0011] 取五味子醇甲對照品適量，精密稱定，加70 %甲醇制成每1ml含五味子醇甲 0. 030 - 0. 045mg，即得。
[0012] 其中，步驟2,益屯、復脈顆粒供試品溶液的制備方法如下：
[0013] 取益屯、復脈顆粒適量研細，精密稱定，加 5 - 20倍量重量體積比的70%甲醇，超聲 溶解，放冷至室溫，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，離屯、，過濾，取續濾液即得。
[0014] 優選地，供試品溶液的制備方法如下：
[0015] 取益屯、復脈顆粒適量研細，精密稱定，加10倍量重量體積比的70%甲醇，超聲 20 - 40min溶解，放冷至室溫，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，離心過0. 45 μ m微孔濾 膜，取續濾液即得。
[0016] 最優選地，供試品溶液的制備方法中，優選超聲30min溶解。
[0017] 其中，步驟3中，所述高效液相色譜，色譜條件如下：
[0018] 采用C18色譜柱；流動相：A% : B% = 0. 1 %甲酸水溶液：乙臘，梯度洗脫條件 如表1所示；柱溫：25°C - 35°C ;流速：0. 8 - 1. 5ml/min ;檢測波長：220 - 280nm ;進樣量： 5 - 20 μ1〇
[0019] 表1梯度洗脫條件
[0020]
[0021] 優選的，色譜條件如下： 陽02引 C18色譜柱；流動相：Α% : Β% = 0. 1 %甲酸水溶液：乙臘；梯度洗脫條件見表2 ; 柱溫：30°C ;流速：1.0ml/min ;檢測波長：250nm ;進樣量：10 μ 1。
[0023] 表2梯度洗脫表
[0024]
[00巧]其中，步驟4,丹酪酸Β與五味子醇甲之間的相對校正因子是按照如下方法計算得 到的： 陽0%] ①配制丹酪酸Β及五味子醇甲對照品溶液：
[0027] 取丹酪酸Β對照品適量，精密稱定，加70 %甲醇分別制成每1ml含丹酪酸Β 0. 0655 - 0.5244mg，即得；
[0028] 取五味子醇甲對照品適量，精密稱定，加70%甲醇分別制成每1ml含五味子醇甲 0.01827 - 0.07308mg，即得；
[0029] ②配制益屯、復脈顆粒供試品溶液：其中，益屯、復脈顆粒供試品溶液的制備方法與 步驟2中相同，具體為：
[0030] 取益屯、復脈顆粒適量研細，精密稱定，加10倍量重量體積比的70%甲醇，超聲 20 - 40min溶解，放冷至室溫，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，離心過0. 45 μ m微孔濾 膜，取續濾液即得。
[0031] 優選地，供試品溶液的制備方法如下：
[0032] 取益屯、復脈顆粒適量研細，精密稱定，加10倍量重量體積比的70%甲醇，超聲 20 - 40min溶解，放冷至室溫，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，離心過0. 45 μ m微孔濾 膜，取續濾液即得。
[0033] 最優選地，供試品溶液的制備方法中，優選超聲30min溶解。
[0034] ③將丹酪酸B及五味子醇甲對照品溶液W及益屯、復脈顆粒供試品溶液分別注入 高效液相色譜儀，測定益屯、復脈顆粒供試品溶液中丹酪酸B及五味子醇甲的含量，其中，高 效液相色譜的色譜條件與步驟3中相同，具體如下：
[0035] 采用C18色譜柱；流動相：A% : B%= 0.1 %甲酸水溶液：乙臘；梯度洗脫條件 如下所示；柱溫：25°C -35°C ;流速：0. 8- 1.5ml/min;檢測波長：220 - 280nm;進樣量： 5 - 20 μ 1 ;
[0036]
[0037] 優選的，色譜條件如下： 陽03引 C18色譜柱；流動相：Α% : Β% = 0. 1 %甲酸水溶液：乙臘；梯度洗脫條件見表2 ; 柱溫：30°C ;流速：1.0ml/min ;檢測波長：250nm ;進樣量：10 μ 1。
[0039] 表2梯度洗脫表
[0040]
[0041 ]
[0042] ④利用公式
計算丹酪酸B及五味子醇甲之間的相對校 正因子f，其中Ilf為五味子醇甲對照品峰面積，Ilf為五味子醇甲對照品濃度；A& MSB-為丹酪酸B對照品峰面積，C丹sHiB為丹酪酸B對照品濃度。
[0043] 本發明所述的的益屯、復脈顆粒為天津天±力（迂寧）制藥有限責任公司的原研藥 品，其處方如下：生曬參75 - 225重量份、黃巧75 - 225重量份、麥冬75 - 225重量份、五味 子50 - 150重量份、丹參100 - 300重量份、川號50 - 150重量份W及適量輔料。
[0044] 優選的，本發明的益屯、復脈顆粒處方如下：生曬參150重量份，黃巧150重量份，麥 冬150重量份，五味子100重量份，丹參200重量份，川號100重量份W及適量輔料。
[0045] 本發明的益屯、復脈顆粒，其制備方法如下：W上6味藥材，加水煎煮2次，第一次加 水10倍量，煎煮2小時，第二次加水8倍量，煎煮1小時，合并煎煮液，靜置12小時，吸取上 清液，濃縮至相對密度1. 20 - 1. 30 (80°C測）的清膏，加入1 %的甜葉菊武，混合均勻，取清 膏1份，加入糊精1份，干燥，粉碎，過60目篩，加入乳糖2份，混勻，制成600g，分裝，即得。
[0046] 本發巧優洗的連輪方法、傳譜條件巧溶劑提取方法，是經過篩洗得到的，篩洗過括 化下：
[0047] 1、供試品處理方法的選擇 W48] (1)提取溶劑的考察
[0049] 結合益屯、復脈顆粒產品工藝制法，選取不同的提取溶劑，考察供試品處理方法。
[0050] ①樣品研細，取l.Og，精密稱定，置25ml錐形瓶中，加水10ml，稱定重量，超聲 30min，溶解，取出，放冷至室溫，用水補足減失的重量，搖勻（離屯、），過0. 45 μ m微孔濾膜， 取續濾液即得。結果如圖1所示。
[0051] ②樣品研細，取1. Og，精密稱定，置25ml錐形瓶中，加30%甲醇10ml，稱定重量，超 聲30min溶解，取出，放冷至室溫，用30%甲醇補足減失的重量，搖勻（離屯、），過0. 45 μm 微孔濾膜，取續濾液即得。結果如圖2所示。
[0052] ③樣品研細，取1. Og，精密稱定，置25ml錐形瓶中，加50%甲醇10ml，稱定重量，超 聲30min溶解，取出，放冷至室溫，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻（離屯、），過0. 45 μm 微孔濾膜，取續濾液即得。結果如圖3所示。
[0053] ④樣品研細，取1. Og，精密稱定，置25ml錐形瓶中，加70%甲醇10ml，稱定重量，超 聲30min溶解，取出，放冷至室溫，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻（離屯、），過0. 45 μm 微孔濾膜，取續濾液即得。結果如圖4所示。
[0054] ⑥樣品研細，取l.Og，精密稱定，置25ml錐形瓶中，加100%甲醇10ml，稱定重量， 超聲30min溶解，取出，放冷至室溫，用100%甲醇補足減失的重量，搖勻（離屯、），過0. 45 μ 微孔濾膜，取續濾液即得。結果如圖5所示。 陽化5] W上處理方法的考察結果顯示：供試品處理方法①、②、③、⑥峰面積均較小，不能 滿足準確定量的要求，而供試品處理方法④的峰面積較高，故初步確定70%甲醇溶液作為 提取溶劑。
[0056] (2)供試品處理提取方法條件的考察
[0057] 基于W上的供試品處理方法④進行提取條件的細致考察，分別對液固比、超聲時 間進行了考察，結果如表3 W及圖譜結果：液固比5 :1見圖6 ;液固比10 : 陽化引 1見圖7 ;液固比20 :1見圖8。
[0059] 表3供試品處理提取方法條件的考察結果
[0060]
[0062] 2、色譜條件的選擇
[0063] (1)梯度洗脫條件的選擇
[0064] 使用色譜柱Agilent Z0RBAX SB-C18(4. 6X250mm，5ym)分離丹酪酸B和五味子 醇甲，在滿足分離度要求的前提下，將梯度洗脫條件進行考察調整，結果在表2所示的梯度 條件下，丹酪酸B和五味子醇甲的分離度滿足要求，分析時長為65min。 W65] 似不同進樣量的選擇
[0066] 考察不同進樣量進行試驗，結果進樣量分別為10 μ 1、15 μ 1、20 μ 1時，丹酪酸B與 后一色譜峰之間分離度依次為1. 67、1. 65、1. 62 (積分方法為波谷到波谷），結果如圖9、圖 10和圖11所示。因此，可見增大進樣量使丹酪酸Β與后一色譜峰之間的分離度減小，進樣 量的多少對五味子醇甲與相鄰雜質峰的分離度無影響，故選10 μ 1進樣量。
[0067] (3)不同柱溫的選擇
[0068] 分別考察35°C、30°C和25°C的情況，結果如圖12、圖13和圖14所示。結果顯示 柱溫為35°C時，丹酪酸B與其前面的色譜峰有交叉，影響其分離度；柱溫為25°C時，丹酪酸 B與其后面色譜峰分離度良好，但其色譜峰有一定展寬，出峰時間延遲并同時影響后面的色 譜峰的出峰時間和峰寬；柱溫為30°C時，丹酪酸B與其后面色譜峰分離度良好，故在上述色 譜梯度洗脫程序時建議柱溫采用30°C。
[0069] 3、益屯、復脈顆粒中丹酪酸B和五味子醇甲含量測定的方法學考察
[0070] (1)標準曲線的制備
[0071] 取丹酪酸B對照品適量，精密稱定，加70 %甲醇分別制成每1ml含丹酪酸 B0. 06555、0. 131U0. 2622、0. 41952、0. 5244mg的系列溶液，分別精密量取10 μ 1，注入液相 色譜儀，按步驟3中的色譜條件分析，測定峰面積，W對照品進樣濃度（mg/ml)為橫坐標，峰 面積值為縱坐標，求得回歸方程：丹酪酸BY = 10000000X+34833，r = 0. 9998。結果表明丹 酪酸B在0. 06555~0. 5244mg范圍內線性良好，結果見表4。
[0072] 表4丹酪酸B標準曲線
[0073]
[0074] 取五味子醇甲對照品適量，精密稱定，加 70%甲醇分別制成每1ml含五味子醇甲 0. 01827、0. 027405、0. 03654、0. 0548U0. 07308mg 的系列溶液，分別精密量取 10 μ 1，注入 液相色譜儀，按步驟3中的色譜條件分析，測定峰面積，W對照品進樣濃度（mg/ml)為橫坐 標，峰面積值為縱坐標，求得回歸方程：五味子醇甲Y = 20000000X+9823. 2，r = 0. 9998。結 果表明五味子醇甲在0.01827~0.07308mg范圍內線性良好，結果見表5,線性圖譜見圖15 所示。 陽0巧]表5五味子醇甲標準曲線
[0076]
[0077] (2)進樣精密度試驗
[0078] 取丹酪酸B、五味子醇甲對照品，按照步驟1制備對照品溶液，色譜條件為：W十八 烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Agilent Z0RBAX SB-C18(4. 6X250mm，5ym)色譜柱；UV檢測 器；流動相：A% : B%= 0. 1%甲酸水溶液：乙臘；梯度洗脫條件見表2。柱溫：30°C;流速： 1.0ml/min ;檢測波長：250nm進樣量：10 μ 1。連續進樣6次，測定丹酪酸B、五味子醇甲峰 面積，測得峰面積平均值分別為2322178、719510,峰面積的RSD分別為0. 82%、0. 39%，符 合要求，結果見表6,圖譜如圖16所示。 陽0巧]表6進樣精密度試驗 [0080]
[0081] (3)重復性試驗
[0082] 取益屯、復脈顆粒樣品，制備低、中、高3種濃度的供試品溶液，濃度范圍為50%~ 150 %，共9份，按照步驟2制備供試品溶液，色譜條件為：W十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充 劑，Agilent ZORBAX SB-C18(4. 6X250mm，5ym)色譜柱；UV 檢測器；流動相：Α% : Β% = 0. 1%甲酸水溶液：乙臘；梯度洗脫條件見表2。柱溫：30°C ;流速：1.0ml/min ;檢測波長： 250nm;進樣量：10 μ 1。測定每份樣品中丹酪酸B、五味子醇甲的含量。結果樣品中丹酪酸 Β、五味子醇甲平均含量分別為為1. 8572mg/g、0. 3916mg/g，RSD分別為1. 7%、2. 8%，重復 性良好，結果見表7,圖譜如圖17所示。
[0083] 表7重復性試驗
[0084]
陽0財 （4)穩定性試驗
[0086] 取益屯、復脈顆粒樣品，精密稱定1. Og，按照步驟2制備供試品溶液，色譜條件為： W十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Agilent Z0RBAX SB-C18 (4.6 X 250mm，5 μ m)色譜柱； UV檢測器；流動相：A% : B%= 0. 1 %甲酸水溶液：乙臘；梯度洗脫條件見表2。柱溫： 30°C ;流速：1.0ml/min ;檢測波長：250nm ;進樣量：10 μ 1。分別在 0、2、4、6、8、12 及 24 小 時，測定樣品中丹酪酸Β、五味子醇甲峰面積，測得峰面積值的RSD分別為0. 50%、0. 63%， 結果表明供試品溶液在24小時內測定穩定，結果見表8,圖譜如圖18所示。
[0087] 表8穩定性試驗
[0088]
[0089] 妨回收率試驗
[0090] 取益屯、復脈顆粒樣品，取供試品稱樣量的1/2,精密稱定9份，分別加入對照品（溶 液）適量，按照步驟2制備3個不同濃度的含相應對照品的供試品溶液（W供試品溶液所含 待測成分的濃度為100%，3個不同濃度為70%~130% )，每個濃度制備3份供試品溶液， 色譜條件為：W十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Agilent Z0RBAX SB - C18 (4. 6 X 250mm， 5 μm)色譜柱；UV檢測器；流動相：A% : B%= 0. 1 %甲酸水溶液：乙臘；梯度洗脫條件見 表2。柱溫：30°C ;流速：1.0ml/min ;檢測波長：250皿；進樣量：10 μ 1。按上述色譜條件分 析，計算回收率，結果丹酪酸Β、五味子醇甲平均回收率為101. 1%、，RSD分別為1.45%，結 果見表9與表10,圖譜見圖19和圖20,回收率試驗符合要求。
[0091] 表9益屯、復脈顆粒中丹酪酸Β回收率試驗
[0092]
[0096] (6)耐用性試驗
[0097] 取益屯、復脈顆粒樣品，按照步驟2制備供試品溶液，分別用Agilent Z0RBAXC-18(4. 6X250mm，5ym) ;0mniBond HiAble C-18 巧 μL? 4. 6X250mm)色譜柱，色譜 條件為：W十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Agilent ZORBAX SB - C18 (4. 6 X 250mm，5 μ m) 色譜柱；UV檢測器；流動相：A% : B% = 0. 1%甲酸水溶液：乙臘；梯度洗脫條件見表2。柱 溫：30°C;流速：1.0ml/min ;檢測波長：250nm ;進樣量：10 μ 1。測定樣品中丹酪酸B、五味子 醇甲含量，結果見表11，色譜圖見圖21和圖22。
[009引表11不同色譜柱對含量測定的影響（η = 2)
[0099]
[0100] 測定結果顯示，不同品牌色譜柱對含量測定的結果無影響。 陽101] (7)理論板數的確定 陽102] 綜合考慮益屯、復脈顆粒2種不同色譜柱的分離情況及理論塔板數結果，見表11， 將丹酪酸Β和五味子醇甲的理論板數均規定為不得低于10000。 陽103] (8)校正因子的確定
[0104] 考慮在一定的范圍內，指標成分的量與檢測器的響應成正比，在多指標質量評價 時，W藥材中某一典型有效成分作內參物，建立內參物與其他待測成分間的相對校正因子。 在本方法中，建立W五味子醇甲對照品同時測定益屯、復脈顆粒中丹酪酸Β和五味子醇甲含 量的方法。
[0105] f為校正因子，公式如下： 陽 106]
陽107] As內參物對照品峰面積，Cs內參物對照品濃度；Ai待測成分對照品峰面積，Ci待 測成分對照品濃度
[0108] 引用到本方法中即
陽109] 表12 陽110]
陽111] 通過校正因子（f)計算12份樣品，比較兩種方法計算丹酪酸B含量的RAD值，具 體數據見表13。 陽…]表13 陽11引
[0114] 由上表可W看出，兩種方法測定的含量的RAD值均小于3%。
[0115] 本發明的有益效果為：
[0116] 1、本發明建立的一測多評法測定益屯、復脈顆粒中丹酪酸B、五味子含量的方法，符 合方法學驗證的要求，并操作簡便，靈敏度高，測定準確，適用性強，能夠用于對該產品的質 量控制。
[0117] 2、本發明的方法僅使用五味子醇甲一種對照品測定益屯、復脈顆粒中丹酪酸B和 五味子醇甲含量，為該制劑的質量控制提供更完善的檢測方法，同時節省檢測成本。
[0118] 3、本發明的方法填補了益屯、復脈顆粒定量控制的空白，使得對該產品能夠進行更 有效的質量分析，更全面反映產品的質量狀況，保證該產品的質量穩定性。
【附圖說明】
[0119] 圖1提取溶劑：水 陽120] 圖2提取溶劑：30%甲醇 陽121] 圖3提取溶劑：50%甲醇 陽122] 圖4提取溶劑：70%甲醇 陽123] 圖5提取溶劑：100%甲醇 陽124] 圖6液固比5:1 陽12引 圖7液固比10:1 陽126] 圖8液固比20:1 陽127] 圖9 10 μ 1進樣量 陽12引 圖10 15 μ 1進樣量 陽129] 圖11 20 μ 1進樣量 陽130] 圖12柱溫35 °C
[0131]圖 13 柱溫 30°C 陽132] 圖14柱溫25 °C 陽133] 圖15線性圖譜
[0134] 圖16進樣精密度圖譜 陽135] 圖17重復性試驗圖譜 陽136] 圖18穩定性試驗圖譜 陽137] 圖19丹酪酸B回收率圖譜 陽13引 圖20五味子醇甲回收率圖譜 陽 139]圖 21 OmniBond HiAble C - 18 色譜柱譜圖 陽 140]圖 22 Agilent Z0RBAX C - 18 色譜柱譜圖
【具體實施方式】 陽14。 本發巧所洗用的化器與材料化下: 陽142] 1、高效液相色譜儀：美國Waters HPLC - 2695 - 2996, Empower工作站。 陽143] 2、色譜柱
[0144] ① Agilent Z0RBAX SB - C18(4. 6X250mm，5ym)色譜柱：適合于低 PH 值色譜柱， 固定相W十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，安捷倫科技有限公司。
[0145] ② OmniBond HPLC Column HiAble C18(4. 6X250mm，5ym)色譜柱：通用性寬 PH 值色譜柱，固定相W純度高達99. 999%的高純硅膠為填料，北京歐姆尼科技有限公司。 陽146] 3、試劑：乙臘（色譜純，天津市康科德科技有限公司）。 陽147] 甲醇（分析純，天津市康科德科技有限公司）。
[0148] 甲酸（分析純，天津市化學試劑一廠）。 陽149] 4、對照品：丹酪酸B(中國藥品生物制品檢定所，批號：111562 - 201313,含量測定 用）；五味子醇甲（中國藥品生物制品檢定所，批號：110857 - 201211，含量測定用）
[0150] 5、樣品：益屯、復脈顆粒（天津天±力（迂寧）制藥有限責任公司，編號：試驗1，試 驗2,試驗3,均通過本發明中提供的益屯、復脈顆粒的制法制得） 陽151] 實施例1 陽152] 取編號為試驗1的益屯、復脈顆粒，測定其丹酪酸B及五味子醇甲的含量。 陽153] 步驟1 :五味子醇甲對照品溶液的制備
[0154] 取五味子醇甲對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1ml含五味子醇甲 0. 036mg的溶液，即得。
[0K5] 步驟2 :益屯、復脈顆粒供試品溶液的制備 陽156] 取益屯、復脈顆粒適量研細，取約1. Og，精密稱定，加10ml 70%甲醇超聲30min溶 解，取出，放置至室溫，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，離屯、，過0. 45 μ m微孔濾膜過濾， 取濾液即得。
[0157] 步驟3 :將五味子醇甲對照品溶液及供試品溶液分別注入高效液相色譜儀，W 十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Agilent Z0RBAX SB-C18(4. 6X250mm，5ym)色譜柱；UV 檢測器；流動相：A% : B%= 0. 1%甲酸水溶液：乙臘；梯度洗脫條件見表2。柱溫：30°C ; 流速：1.0ml/min ;檢測波長：250nm ;進樣量：10 μ 1。ii得益屯、復脈顆粒中五味子醇甲的含 量為 0. 3116mg/g。
[0158] 步驟4 :通過一測多評法，利用丹酪酸B與五味子醇甲之間的相對校正因子f與丹 酪酸B峰面積計算益屯、復脈顆粒中丹酪酸B的含量為2. 3325mg mg/g。
[0159] 在步驟3所述色譜條件下對益屯、復脈顆粒中丹酪酸B的含量進行實際檢測，測得 每克益屯、復脈顆粒中丹酪酸B的含量為2. 4471mg/g，與依據校正因子測定的丹酪酸B含量 相比，兩種方法測定丹酪酸B含量的RAD值為2. 6%。 陽16〇] 實施例2 陽161] 取編號為試驗2的益屯、復脈顆粒，測定其丹酪酸B及五味子醇甲的含量。 陽16引步驟1 :五味子醇甲對照品溶液的制備
[0163] 取五味子醇甲對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1ml含五味子醇甲 0. 030mg的溶液，即得。
[0164] 步驟2 :益屯、復脈顆粒供試品溶液的制備 陽1化]取益屯、復脈顆粒適量研細，取約1. Og，精密稱定，加5ml 70%甲醇超聲20min溶 解，取出，放置至室溫，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，離屯、，過0. 45 μ m微孔濾膜過濾， 取濾液即得。
[0166] 步驟3 :將五味子醇甲對照品溶液及供試品溶液分別注入高效液相色譜儀，W高 純硅膠為填充劑，OmniBond HPLC Column Hut)ble C18(4. 6X250mm，5ym)色譜柱；UV 檢測 器；流動相：A% : B%= 0. 1%甲酸水溶液：乙臘；梯度洗脫條件見表2。柱溫：25°C ;流 速：1. 5ml/min ;檢測波長：220nm ;進樣量：5 μ 1。測得益屯、復脈顆粒中五味子醇甲的含量為 0. 4：M4mg/g。 陽167] 步驟4 :通過一測多評法，利用丹酪酸B與五味子醇甲之間的相對校正因子f與丹 酪酸B峰面積計算益屯、復脈顆粒中丹酪酸B的含量為1. 7023mg/g。
[0168] 在步驟3所述色譜條件下對益屯、復脈顆粒中丹酪酸B的含量進行實際檢測測得每 克益屯、復脈顆粒中丹酪酸B的含量為1. 7924mg/g，與依據校正因子測定的丹酪酸B含量相 比，兩種方法測定丹酪酸B含量的RAD值為2. 6%。 陽169] 實施例3
[0170] 取編號為試驗3的益屯、復脈顆粒，測定其丹酪酸B及五味子醇甲的含量。 陽171] 步驟1 :五味子醇甲對照品溶液的制備
[0172] 取五味子醇甲對照品適量，精密稱定，加70 %甲醇制成每1ml含五味子醇甲 0. 040mg的溶液，即得。 陽173] 步驟2 :供試品溶液的制備 陽174] 取益屯、復脈顆粒適量研細，取約l.Og，精密稱定，加20ml 70%甲醇超聲40min溶 解，取出，放置至室溫，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，離心過0. 45 μ m微孔濾膜過濾， 取濾液即得。
[01巧]步驟3 :將五味子醇甲對照品溶液及供試品溶液分別注入高效液相色譜儀，W 十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Agilent Z0RBAX SB-C18(4. 6X250mm，5ym)色譜柱；UV 檢測器；流動相：A% : B%= 0. 1%甲酸水溶液：乙臘；梯度洗脫條件見表2。柱溫：35°C ; 流速：0. 8ml/min ;檢測波長：280皿；進樣量：20 μ 1。測得益屯、復脈顆粒中五味子醇甲的含 量為 0. 3968mg/g。 陽176] 步驟4 :通過一測多評法，利用丹酪酸B與五味子醇甲之間的相對校正因子f與丹 酪酸B峰面積計算益屯、復脈顆粒中丹酪酸B的含量為1. 8510mg/g。
[0177] 在步驟3所述色譜條件下對益屯、復脈顆粒中丹酪酸B的含量進行實際檢測，測得 每克益屯、復脈顆粒中丹酪酸B的含量為1. 7955mg/g，與依據校正因子測定的丹酪酸B含量 相比，兩種方法測定丹酪酸B含量的RAD值為1. 6%。 陽17引 實施例4
[0179] 取編號為試驗3的益屯、復脈顆粒，測定其丹酪酸B及五味子醇甲的含量。
[0180] 步驟1 :五味子醇甲對照品溶液的制備
[0181] 取五味子醇甲對照品適量，精密稱定，加70 %甲醇制成每1ml含五味子醇甲 0. 045mg的溶液，即得。 陽182] 步驟2 :益屯、復脈顆粒供試品溶液的制備 陽183] 取益屯、復脈顆粒適量研細，取約1. Og，精密稱定，加15ml 70%甲醇超聲30min溶 解，取出，放置至室溫，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，離心過0. 45 μ m微孔濾膜過濾， 取濾液即得。
[0184] 步驟3 :將五味子醇甲對照品溶液及供試品溶液分別注入高效液相色譜儀，W高 純硅膠為填充劑，OmniBond HPLC Column HiAble C18(4. 6X250mm，5ym)色譜柱；UV 檢測 器；流動相：A% : B%= 0. 1%甲酸水溶液：乙臘；梯度洗脫條件見表2。柱溫：32°C ;流 速：1.0ml/min ;檢測波長：250nm ;進樣量：10 μ 1。測得益屯、復脈顆粒中五味子醇甲的含量 為 0.3825mg/g。 陽化5] 步驟4 :通過一測多評法，利用丹酪酸B與五味子醇甲之間的相對校正因子f與丹 酪酸B峰面積計算益屯、復脈顆粒中丹酪酸B的含量為1. 7682mg/g。
[0186] 在步驟3所述色譜條件下對益屯、復脈顆粒中丹酪酸B的含量進行實際檢測，測得 每克益屯、復脈顆粒中丹酪酸B的含量為1. 7334mg/g，與依據校正因子測定的丹酪酸B含量 相比，兩種方法測定丹酪酸B含量的RAD值為1. 0%。 陽187] 實施例5
[0188] 取編號為試驗3的益屯、復脈顆粒，測定其丹酪酸B及五味子醇甲的含量。
[0189] 步驟1 :五味子醇甲對照品溶液的制備
[0190] 取五味子醇甲對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1ml含五味子醇甲 0. 036mg的溶液，即得。 陽191] 步驟2 :供試品溶液的制備 陽192] 取益屯、復脈顆粒適量研細，取約l.Og，精密稱定，加10ml70%甲醇超聲30min溶 解，取出，放置至室溫，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，離屯、，過0. 45 μ m微孔濾膜過濾， 取濾液即得。
[0193] 步驟3 :將五味子醇甲對照品溶液及供試品溶液分別注入高效液相色譜儀，W 十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Agilent Z0RBAX SB-C18(4. 6X250mm，5ym)色譜柱；UV 檢測器；流動相：A% : B%= 0. 1%甲酸水溶液：乙臘；梯度洗脫條件見表2。柱溫：28°C ; 流速：1.0ml/min ;檢測波長：250nm ;進樣量：10 μ 1。ii得益屯、復脈顆粒中五味子醇甲的含 量為 0. 3846mg/g。
[0194] 步驟4 :通過一測多評法，利用丹酪酸B與五味子醇甲之間的相對校正因子f與丹 酪酸B峰面積計算益屯、復脈顆粒中丹酪酸B的含量為1. 781 Img/g。
[0195] 在步驟3所述色譜條件下對益屯、復脈顆粒中丹酪酸B的含量進行實際檢測，測得 每克益屯、復脈顆粒中丹酪酸B的含量為1. 7721mg/g，與依據校正因子測定的丹酪酸B含量 相比，兩種方法測定丹酪酸B含量的RAD值為0. 26%。
【主權項】
1. 一種一測多評法測定益心復脈顆粒中丹酚酸B和五味子醇甲含量的方法，具體包括 以下步驟： 步驟1 :五味子醇甲對照品溶液的制備； 步驟2 :益心復脈顆粒供試品溶液的制備； 步驟3 :將五味子醇甲對照品溶液及益心復脈顆粒供試品溶液分別注入高效液相色譜 儀，測定益心復脈顆粒供試品溶液中五味子醇甲的含量； 步驟4 :通過一測多評法，利用丹酚酸B與五味子醇甲之間的相對校正因子f與丹酚酸 B峰面積計算益心復脈顆粒中丹酚酸B的含量。2. 如權利要求1所述的方法，其中，步驟1五味子醇甲對照品溶液的制備方法如下：取 五味子醇甲對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每lml含五味子醇甲0. 030 -0. 045mg， 即得。3. 如權利要求1所述的方法，其中，步驟2益心復脈顆粒供試品溶液的制備方法如下： 取益心復脈顆粒適量研細，精密稱定，加5 -20倍量重量體積比的70%甲醇，超聲溶解，放冷 至室溫，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，離心，過濾，取續濾液即得。4. 如權利要求3所述的方法，其中，步驟2益心復脈顆粒供試品溶液的制備方法優 選如下：取益心復脈顆粒適量研細，精密稱定，加10倍量重量體積比的70%甲醇，超聲 20 - 40min溶解，放冷至室溫，用70%甲醇補足減失的重量，搖勾，離心，過0.45μπι微孔濾 膜，取續濾液即得。5. 如權利要求4所述的方法，其中，步驟2益心復脈顆粒供試品溶液的制備方法中，優 選超聲30min溶解。6. 如權利要求1所述的方法，其中，步驟3高效液相色譜色譜條件如下：采用C18 色譜柱；流動相：A% : B%= 0.1 %甲酸水溶液：乙腈；梯度洗脫條件如下所示；柱溫： 25°C - 35°C ;流速：0· 8 - 1. 5ml/min ;檢測波長：220 - 280nm ;進樣量：5 - 20 μ 1。7. 如權利要求6所述的方法，其中，步驟3高效液相色譜色譜條件優選如下：C18色譜 柱；流動相：A% : Β%= 0. 1%甲酸水溶液：乙腈；梯度洗脫條件如下所示；柱溫：30°C ;流 速：L Oml/min ;檢測波長：250nm ;進樣量：10 μ 1。8. 如權利要求1所述的方法，其中，步驟4,丹酚酸B與五味子醇甲之間的相對校正因 子是按照如下方法計算得到的： ① 配制丹酚酸B及五味子醇甲對照品溶液：取丹酚酸B對照品適量，精密稱定，加70% 甲醇分別制成每lml含丹酚酸B 0. 0655 - 0. 5244mg，即得；取五味子醇甲對照品適量，精密 稱定，加70%甲醇分別制成每lml含五味子醇甲0. 01827 - 0. 07308mg，即得； ② 配制益心復脈顆粒供試品溶液：取益心復脈顆粒適量研細，精密稱定，加10倍量重 量體積比的70%甲醇，超聲20 - 40min溶解，放冷至室溫，用70%甲醇補足減失的重量，搖 勻，離心，過0. 45 μ m微孔濾膜，取續濾液即得； ③ 將丹酚酸B及五味子醇甲對照品溶液以及益心復脈顆粒供試品溶液分別注入高效 液相色譜儀，測定益心復脈顆粒供試品溶液中丹酚酸B及五味子醇甲的含量，其中，高效液 相色譜色譜條件如下：采用C18色譜柱；流動相：A% : Β%= 0. 1 %甲酸水溶液：乙腈；梯 度洗脫條件如下所示；柱溫：25°C - 35°C ;流速：0. 8 - 1. 5ml/min ;檢測波長：220 - 280nm ; 進樣量：5 - 20μ1 ;-計算丹酚酸Β及五味子醇甲之間的相對校正因 子f，其中Α五味子醇￥為五味子醇甲對照品峰面積，C五味子醇￥為五味子醇甲對照品濃度；Α ΛΒΗ8β 為丹酚酸Β對照品峰面積，(^^為丹酚酸Β對照品濃度。9. 如權利要求1 -8任一所述的方法，其中所述益心復脈顆粒處方如下：生曬參75 -225 重量份、黃芪75 - 225重量份、麥冬75 - 225重量份、五味子50 - 150重量份、丹參100 - 300 重量份、川考50 - 150重量份以及適量輔料。10. 如權利要求9所述的方法，其中所述益心復脈顆粒制備方法如下：以上6味藥材， 加水煎煮2次，第一次加水10倍量，煎煮2小時，第二次加水8倍量，煎煮1小時，合并煎煮 液，靜置12小時，吸取上清液，濃縮至相對密度在80°C時為1. 20 -1. 30的清膏，加入1%的 甜葉菊甙，混合均勻，取清膏1份，加入糊精1份，干燥，粉碎，過60目篩，加入乳糖2份，混 勻，制成600g，分裝，即得。
【文檔編號】G01N30/06GK105823830SQ201510013254
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2015年1月9日
【發明人】侯春蓮, 劉海濤, 高展, 闞紅玉, 孫玉俠, 曹鳳蘭, 徐立元, 趙光燃, 楊建會, 張金巍, 楊雪梅
【申請人】天士力制藥集團股份有限公司, 天津天士力（遼寧）制藥有限責任公司