H-nmr指紋圖譜的構建方法和應用
【專利摘要】本發明公開了一種山西老陳醋1H?NMR指紋圖譜的構建方法和應用，屬于指紋圖譜的構建技術領域。本發明采用核磁共振技術獲得山西老陳醋的指紋圖譜特征峰，該指紋圖譜能全面反映山西老陳醋的化學成分和品質特性，可用于山西老陳醋的質量控制，同時也可為山西老陳醋原產地域和地理標志的保護提供技術支撐。
【專利說明】
山西老陳醋iH-NMR指紋圖譜的構建方法和應用
技術領域
[0001] 本發明設及指紋圖譜的構建，具體是一種基于iH-醒R核磁共振技術的山西老陳醋 指紋圖譜的構建方法，W及在山西老陳醋質量控制方面的應用。
【背景技術】
[0002] 食醋是深受人們喜愛的調味品之一，我國的食醋釀造歷史悠久，各地食醋釀造方 法不同，其成分也有所差異。食醋中已報道所含成分有糖類、氨基酸、酸類、醇類、醒類、醋 類、多酪類等。山西老陳醋因"選料上乘、工藝獨特、營養豐富、養身健體、風味獨特、品質優 良、色香味俱佳"而被譽為"天下第一醋"。山西老陳醋的釀造體現在"蒸、酵、熏、淋、曬"五 字，其風味則體現在"酸、綿、香、甜"。現行的山西老陳醋的國家標準中W川號嗦和總黃酬的 含量作為特征指標。然而，山西老陳醋所含成分復雜，僅僅通過川號嗦或總黃酬等有限的指 標難W反應山西老陳醋的品質特征。指紋圖譜可W獲得樣品的整體化學信息，可作為山西 老陳醋質量控制的有效手段。現有的山西老陳醋指紋圖譜主要是揮發性指紋(氣相色譜/質 譜法聯用分析山西老陳醋香氣成分.袁仲等.中國調味品，第36卷第5期，2011.)和有機酸類 指紋（山西老陳醋中有機酸的HPLC測定分析.呂利華等.食品科學，第28卷第11期，2007.)。 然而，揮發性成分在食醋中的含量很低，水溶性成分中除了有機酸外，還含有氨基酸、有機 酸、糖類等多種物質。核磁共振技術可W檢測大多數的有機化合物，從整體上對山西老陳醋 進行全面的表征。本發明的目的在于采用核磁共振指紋技術建立一種方便、有效并能全面 整體地對山西老陳醋進行質量控制的方法。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在于針對現有技術存在的問題，提供一種能較全面地表征山西老陳 醋化學組成的iH-NMR指紋圖譜及其構建方法，W及在山西老陳醋質量控制中的應用。
[0004] 為實現上述目的，本發明的技術方案如下：
[0005] -種山西老陳醋iH-NMR指紋圖譜的構建方法，具體包括W下步驟：
[0006] (1)取山西老陳醋，W飽和氨氧化鋼溶液調抑至7.0;
[0007] (2)取上述醋液60化L，加入1000-150化L甲醇，滿旋，置于-20°c冰箱中沉淀蛋白， 離屯、;吸取1200化上清液，用氮吹儀吹干；
[000引 （3)在吹干的醋樣中加入濃度為15μΜ-150μΜ的TSP重水溶液700-1000化溶解，移取 上清液550-60化L至核磁管中，用核磁共振儀測試，采用核磁數據處理軟件對圖譜進行數據 處理，獲得山西老陳醋iH-NMR指紋圖譜；
[0009] (4)對山西老陳醋iH-醒R圖譜進行指認鑒別，利用標準品對照結合核磁共振峰的 化學位移及偶合常數分析，確定山西老陳醋指紋圖譜的特征峰包括:下酸(δ = 0.90±0.02， t，J = 6.6Hz)、異亮氨酸（δ = 0.94±0.02，t，J = 7.8Hz;δ = 1.01±0.02，d，J = 6.6Hz)、亮氨 酸（5 = 0.95±0.02八，1 = 7.2化）、鄉氨酸（5 = 1.00±0.02，(1，1 = 7.2化；5 = 1.05±0.02，(1， J = 6.6Ηζ )、丙酸（S = 1.06±0.02,t,J = 7.2Ηζ)、3-徑基下酸（S = 1.15±0.02,d,J = 6.0化）、乙醇（5 = 1.19±0.02八，1 = 7.2化）、乙酸乙醋（5 = 1.23±0.02，1，1 = 7.2化）、乳酸 (S = l.：M±0.02，d，J = 6.6Hz)、蘇氨酸（5 = 1.39±0.02，(1，1 = 7.2化）、丙氨酸（5 = 1.49± 0.02，d，J = 7.2Hz)、精氨酸（δ = 3.25±0.02，dd，J = 9.0Hz，1.8Hz)、乙酸（δ = 1.93±0.02， 8)、谷氨酸(8 = 2.13±0.02，111;6 = 2.31±0.02，111)、丙酬酸(6 = 2.37±0.02,3)、蘋果酸(6 = 2.65±0.02，(1(1，1=15.2化，3.2化）、脯氨酸（5 = 3.32±0.02，111;5 = 4.12±0.02，111)、班巧酸 (δ = 2.41±0.02，s)、膽堿(δ = 3.20±0.02，s)、甘油（δ = 3.55±0.02，dd，J = 4.2Hz，9.細z; δ = 3.66±0.02，dd，J = 4.2Hz，11.4Hz)、β-葡萄糖（δ = 4.66±0.02，d，J = 7.細z)、乳糖（δ = 5.19±0.02，(1，1 = 3.6化）、日-葡萄糖（5 = 5.25±0.02，(1，1 = 4.2化）、薦糖（5 = 5.41±0.02， d，J = 7.2Hz)、甲酸（S = 8.46±0.02，s)、a-酬戊二酸（S = 2.45±0.02，t，J = 6.0Hz;S = 3.02 ±0.02，t，J = 6.0Hz)。
[0010] 所述的滿旋時間為Imin，蛋白沉淀時間為20min，離屯、時間為30min，離屯、轉速為 13000rpm〇
[0011] 本發明的有益效果：
[0012]本發明所構建的山西老陳醋的iH-醒R指紋圖譜，能同時表征26種化學成分，包括 氨基酸、有機酸、糖類等多種代謝產物，能全面反映山西老陳醋的化學成分和品質特性，可 用于山西老陳醋的質量控制，也可為山西老陳醋原產地域和地理標志的保護提供技術支 撐。
【附圖說明】
[OOK] 圖1山西老陳醋iH-NMR指紋圖譜
[0014]圖2不同廠家山西老陳醋PCA散點圖
[001引圖3不同批次山西陳醋、米醋、鎮江香醋PLS-DA散點圖
[0016] 圖4不同批次山西陳醋、山西老陳醋0PLS-DA散點圖
【具體實施方式】
[0017 ] 實施例1山西老陳醋Ih-NMR指紋圖譜的建立
[001引樣本制備；
[0019] ①取山西老陳醋15mL，W飽和氨氧化鋼溶液調抑至7.0。
[0020] ②取上述醋液60化L，加入1200化甲醇，滿旋，置于-20°C冰箱中去蛋白，13000巧m 離屯、20min，取1200化上清液，用氮吹儀吹干。
[0021] ③在吹干的醋樣中加入濃度為16.92μΜ的TSP重水溶液70化L溶解，移取上清液600 yL至核磁管中，用于山西老陳醋iH-NMR指紋圖譜分析。
[0022] 譜圖采集:樣品在25°(：下于6001化醒1?儀上測定，測定頻率4-醒1? 600.131化，脈 沖序列為noesygpprld，掃描次數64次，譜寬12345.7Hz，脈沖時間14s，采樣時間2.654s，弛 豫時間3. Os，采樣數據點65536，FID分辨率0.18細Z，采樣間隔40.5s。
[0023] 譜圖預處理：譜圖導入MestReNova( version 8.0.1 ,Mestrelab Research , Santiago de Compostella,Spain)，WTSP定標，進行基線調整和相位校正后對圖譜進行指 認。山西老陳醋的核磁共振氨譜見圖1，信號歸屬見表1。
[0024] 表 1
[0027]實施例2本方法用于山西老陳醋的質量比較
[002引收集市售4個不同生產廠家(記為:A、B、C、D)的山西老陳醋共8個批次(A廠家:3批； B廠家:2批;C廠家:2批;D廠家：1批），按照本
【發明內容】
所述方法對上述不同批次的山西老陳 醋進行測試和圖譜處理，得到不同廠家山西老陳醋的iH-NMR指紋圖譜，每批樣本平行備樣 兩次。W步長SO.Olppm對山西老陳醋核磁圖譜進行分段積分，積分段為δΟ.70~9.50,其中δ 4.65~4.85(殘余水峰)不進行積分，將積分后的數據導入SIMCA-P 13.0軟件中進行PCA(主 成分分析）。
[0029] 由山西老陳醋PCA散點圖（圖2)可見，不同批次的山西老陳醋可W明顯區分開來，D 廠家的山西老陳醋與其他廠家的在圖上相距較遠，說明Α、ΒΧΞ個廠家的山西老陳醋化學 成分含量較為相似，與D廠家的有一定差異性。此外，從圖上可W明顯看出A廠家有一批樣本 位于圖的右下方，與其他批次的山西老陳醋有較大差距。
[0030] 實施例3本方法用于山西老陳醋和其他種類食醋的比較
[0031] 收集市售山西老陳醋、米醋、鎮江香醋Ξ種食醋共22個批次，按照本
【發明內容】
所述 方法對上述不同批次的食醋進行iH-NMR測試和圖譜處理，W步長δΟ. 〇4ppm對食醋核磁圖譜 進行分段積分，積分段為SO.50~10.02,其中δ4.70~5.02(殘余水峰)不進行積分，將積分 后的數據導入SIMCA-P 13.0軟件中進行化S-DA(偏最小二乘法判別分析）。
[0032] 由不同食醋化S-DA散點圖（圖3)可見，不同種類的食醋可W明顯分開，運表明本方 法可W把山西老陳醋、米醋及鎮江香醋區分開來。
[0033] 實施例4本方法用于山西陳醋和山西老陳醋的比較
[0034] 收集市售山西老陳醋7個批次和陳醋10個批次，按照本
【發明內容】
所述方法對上述 不同批次的食醋進行iH-NMR測試和圖譜處理，每批樣本平行備樣兩次。W步長SO.Olppm對 食醋核磁圖譜進行分段積分，積分段為δΟ.70~9.50,其中δ4.65~4.85(殘余水峰)不進行 積分，將積分后的數據導入SIMCA-P 13.0軟件中進行PCA(主成分分析)和0PLS-DA(正交偏 最小二乘法判別分析），并通過相應的S-plot圖結合VIP值和相關系數進行差異代謝物的尋 找。
[0035] 由不同批次山西陳醋、山西老陳醋的分析圖譜（圖4)可知，山西陳醋跟山西老陳醋 可W很明顯地區分開，經VIP值結合S-plot載荷和相關系數分析得，除乙醇外，老陳醋中的 其他成分都較陳醋中含量高，其中對差異貢獻較大的成分有蘇氨酸、丙氨酸、亮氨酸、鄉氨 酸、異亮氨酸等氨基酸W及乳酸、乙酸等有機酸。
【主權項】
1. 一種山西老陳醋1H-NMR指紋圖譜的構建方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 取山西老陳醋，以飽和氫氧化鈉溶液調pH至7.0; (2) 取上述醋液600yL，加入1000-1500yL甲醇，渦旋，置于-20 °C冰箱中沉淀蛋白，離心； 吸取1200yL上清液，用氮吹儀吹干； (3) 在吹干的醋樣中加入濃度為15μΜ-150μΜ的TSP重水溶液700-1000yL溶解，移取上清 液550-600yL至核磁管中，用核磁共振儀測試，采用核磁數據處理軟件對圖譜進行數據處 理，獲得山西老陳醋 1H-NMR指紋圖譜； (4) 對山西老陳醋h-NMR圖譜進行指認鑒別，利用標準品對照結合核磁共振峰的化學位 移及偶合常數分析，確定山西老陳醋指紋圖譜的特征峰包括:異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、丙 酸、3-羥基丁酸、乙醇、乙酸乙酯、乳酸、蘇氨酸、丙氨酸、精氨酸、乙酸、谷氨酸、丙酮酸、蘋果 酸、脯氨酸、琥珀酸、膽堿、甘油、葡萄糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、甲酸和α-酮戊二酸。2. 如權利要求1所述的一種山西老陳醋1H-NMR核磁指紋圖譜的構建方法，其特征在于， 所述步驟(2)中甲醇的加入量為1200yL。3. 如權利要求1所述的一種山西老陳醋1H-NMR核磁指紋圖譜的構建方法，其特征在于， 所述步驟(2)中渦旋時間為lmin。4. 如權利要求1所述的一種山西老陳醋1H-NMR核磁指紋圖譜的構建方法，其特征在于， 所述步驟(2)中蛋白沉淀時間為20min。5. 如權利要求1所述的一種山西老陳醋1H-NMR核磁指紋圖譜的構建方法，其特征在于， 所述步驟(2)中離心時間為30min，離心轉速為13000rpm。6. 如權利要求1、2、3、4或5所述構建方法構建的山西老陳醋1H-NMR核磁指紋圖譜在山西 老陳醋質量控制中的應用。
【文檔編號】G01N24/08GK105823788SQ201610317142
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年5月12日
【發明人】李震宇, 李藝, 秦雪梅
【申請人】山西大學