一種無光學干擾的拉曼標記探針及其制備方法和應用
【專利摘要】本發明以對巰基苯乙炔為主體結構設計了一系列拉曼散射峰位在1800?2400 cm?1波數區信號分子，選擇金、銀納米粒子作為拉曼信號的增強基底，將帶巰基的炔烴信號分子自組裝于增強基底表面并使用巰基乙酸對SERS信號進行優化，然后選擇透光、親水并富含活性反應基團的包裹材料進行探針封裝，最后在包裹材料外層嫁接特定的生物靶向功能分子。此探針拉曼散射的光學響應強、窄帶單峰發射、無光學背景干擾，在多組分同時標記的生物成像領域意義重大。該技術可延伸至以帶通濾光片為分光器件，以光電倍增管（PMT）或雪崩光電二極管（APD）為檢測器件的無光柵超快拉曼成像儀的設計與開發，克服了拉曼成像逐點掃描、成像慢的技術瓶頸，將填補光學成像類儀器的市場空白。
【專利說明】
-種無光學干擾的拉曼標巧探針及其制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物成像技術領域，設及一種新型烘控編碼、生物祀向的表面增強拉 曼散射（Surface-enhanced Raman scattering,沈RS)活性納米標記探針的制備方法。更重 要的是，設及W帶通濾光片為分光器件，W光電倍增管(PMT)或雪崩光電二極管(APD)為檢 測器件的無光柵超快拉曼成像儀的設計與開發。
【背景技術】
[0002] 生物成像(如活細胞成像)技術使得科學家可W實時和動態觀察生物體內部結構 和生理過程，徹底革新了生物學家研究生物體活動機制的方式。在眾多的生物成像技術中， 巧光標記成像應用最為廣泛和成熟。它利用可吸收特定波長的光并發射出波長更長的光 (巧光）的信號探針，比如小分子有機染料或者巧光蛋白來特異性地標記生物體系中的特定 組分，并通過其巧光信號的定位來獲取目標生物物質的分布情況，極大地提升了人們探索 生物體內部結構和過程的能力。然而，運種成像技術明顯受制于巧光光譜法的固有缺陷，即 傳統的巧光染料發射峰寬（約50nm)過寬會造成多色(或多組分)標記時信號重疊而難W區 分、辨析。量子點技術近年來的進展克服了上述傳統有機巧光染料和巧光蛋白的固有缺陷， 其發射峰窄且對稱，相互重疊小W及其發射峰波長可由其組成材料和粒徑進行精細調節等 優良特性倍受細胞標記和成像研究的青睞，但其潛在的生物毒性使其應用于活體成像的一 些深入研究難有新的進展。
[0003] 表面增強拉曼散射（Surface-enhanced Raman scattering,S邸S)技術除具有非 破壞性、高光譜特異性和不受水干擾等普通拉曼光譜的優點外，還具有更低的檢測限和更 高的靈敏度(具備單分子檢測的能力），特別是在納米技術強勢介入生物醫學領域的情形 下，各種具有表面增強拉曼散射效應的金(銀)納米顆粒廣泛應用于生物樣品的分析檢測與 生物成像研究。為了提高拉曼檢測的靈敏度，人們對SERS基底材料的選擇和制備進行了大 量的研究。然而，作為另一個決定探針優劣的重要因素，信號分子的選擇和設計卻并未引起 人們足夠的重視。新穎的信號分子的提出通常需要經過合理的設計，仔細的篩選和系統的 表征，相較于選擇"現成"的SERS探針而言則無疑顯得過于繁瑣，從而造成了現如今關于信 號分子設計的工作少之又少。但是在復雜的研究體系當中，SERS探針分子的隨意選用卻可 能會成為研究進一步發展的障礙，因為干擾分子或檢測分子與傳統的SERS信號分子極易發 生光譜重疊的現象，運將會嚴重影響結果的精確性。隨著多目標同時檢測概念的提出，運一 困擾甚至會延伸至各類SERS探針分子之間，運時傳統信號分子選擇的困難性將會進一步被 放大。面對如此困境，人們迫切需要大量相互無重疊的新穎信號分子用于復雜體系的抗干 擾、多目標分析檢測。
[0004] 烘基的拉曼特征峰在2120cnfi附近，在運一光譜區域細胞內常見的干擾物質是沒 有拉曼響應的，所W近些年在不少研究中人們將烘控標記的生物代謝分子，如DNA、RNA、蛋 白質、脂類等用于生物標記成像并取得了不錯的效果;此外，烘基的拉曼位移和強度會因為 與之相連的取代基的不同而發生明顯偏移，甚至僅僅是將烘基的碳原子1化更換為它的同位 素 i3c，拉曼位移就會產生100個波數的偏移，運兩點預示了烘控的衍生物極其適合抗干擾的 多目標分析檢測。但是，烘控類信號分子的廣泛應用卻依然被自發拉曼散射信號強度很弱 的問題嚴重限制，為了檢測到極度微弱的烘基拉曼散射信號，人們不得不提高曝光時間或 使用高強度激光，由此卻又可能引起樣品的損傷；近些年也有人嘗試使用受激拉曼散射 (stimulated Raman scattering, SRS)技術進行相關研究，但昂貴的儀器價格讓人們望而 生畏的同時，其在多目標同時成像上的捉襟見肘也使其無法成為生物成像領域的通用儀 器。結合近些年研究較多的SERS技術，它提供106~1〇12倍的信號增強，理論上將是一個改善 烘基自發拉曼散射信號較弱的理想途徑。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種新型烘控編碼、生物祀向的表面增強拉曼散射 (Surface-enhanced Raman scattering,SERS)活性納米標記探針的制備方法，更重要的 是，發展一種亮度高、多色輸出、光學穩定且無干擾的新型SERS成像技術。該技術(包括探針 產品）可在常規的商品化共聚焦拉曼譜儀上實現廣泛的生物成像應用；同時，亦能用于W帶 通濾光片為分光器件，W光電倍增管(PMT)或雪崩光電二極管(APD)為檢測器件的無光柵超 快拉曼成像儀的設計與開發。
[0006] 本發明提供的技術方案如下：
[0007] -種無光學干擾的拉曼標記探針的制備方法，包括W下步驟:將拉曼散射峰位在 1800-2400cnfi波數區、帶寬為1 -2nm的窄帶單峰信號分子通過Au-S鍵或Ag-S鍵自組裝到增 強基底的表面，然后采用透光親水的殼體材料進行探針封裝，即得到無光學干擾的拉曼標 記探針；
[0008] 所述的窄帶單峰拉曼信號分子，具有通式I所示的結構：
[0009]
[0010]
[0011] 其中，Ri、R2、R3、R4為-N化、-C曲或Η，Rs為Η或-Si (C出）3、-C2也、-C此C此C出細、苯基或 烘基；
[0012] 所述的增強基底為粒徑30-60nm的納米粒子，所述的納米粒子為（i)納米金、（ii) 納米銀或（i i i) W納米金或納米銀為殼的核殼結構納米粒子；
[0013] 所述的殼體材料為生物分子、聚合物、二氧化娃中的一種。
[0014] 進一步地，Rs為Η的窄帶單峰信號分子自組裝到增強基底的表面后，用琉基簇酸對 窄帶單峰信號分子與增強基底的連接方式進行優化，接著采用透光親水的殼體材料進行探 針封裝。
[0015] 再進一步地，將探針封裝后在殼體材料上嫁接生物祀向分子。
[0016] 所述的窄帶單峰拉曼信號分子為
[0017]
[001 引
[0019] 所述的琉基簇酸為琉基乙酸、琉基丙酸、琉基下酸中的一種或幾種;所述的生物祀 向分子為抗體、配體、多膚中的一種。
[0020] 所述的抗體為促黃體激素釋放激素，所述的配體為葉酸，所述的多膚為細胞穿透 膚或核定位膚。
[0021] 所述的生物祀向分子通過與邸C-N服或戊二醒交聯反應嫁接到探針表面。
[0022] -種無光學干擾的拉曼標記探針，由所述的無光學干擾的拉曼標記探針的制備方 法制備得到。
[0023] 所述的無光學干擾的拉曼標記探針在生物成像中的應用。
[0024] -種高靈敏超快拉曼成像儀，W所述的無光學干擾的拉曼標記探針為檢測對象， 在常規的光學顯微鏡基礎上，W激光作為激發光源，配置高精度的快速掃描樣品臺，W超窄 帶帶通濾光片提取探針的窄帶單峰超強拉曼散射信號，W超靈敏的雪崩光電二極管為檢測 元件，通過樣品臺的二維掃描逐點采集探針的光子信號并作偽彩色處理。
[0025] 此快速、靈敏和高空間分辨拉曼成像儀器W帶通濾光片的波長標定色差，W光子 信號的強度標定色度。
[0026] 將所述的無光學干擾的拉曼標記探針對多個祀標進行標記，使用帶二維自動掃描 平臺的拉曼光譜儀，快速地逐點采集光譜，進而對探針窄帶單峰的超強拉曼散射信號作偽 彩色圖像處理，其散射峰的位移用于標定色差，散射峰的強度用于標定色度;所述快速采集 光譜的條件為:曝光時間為Is,波長范圍為ASOcnfi;所述的祀標為細胞、組織或生物體。
[0027] 本發明的原理為：
[0028] 1. W對琉基苯乙烘為主體結構，通過替換烘基末端取代基團來改變烘基拉曼散射 信號的位移，可根據密度泛函理論計算對烘控類信號分子的結構-拉曼位移的關系進行一 系列預測及理論研究，篩選出不同窄帶單峰的分子結構。
[0029] 2.合成不同形狀、尺寸的金、銀及其核殼結構納米粒子，篩選出高增強活性的納米 粒子作為SERS增強基底，將烘控信號分子通過Au-S或Ag-S鍵自組裝單層于增強基底表面。
[0030] 3.信號分子的自組裝過程中可使用琉基乙酸等對信號分子與增強基底的連接方 式進行優化，W消除由于空間取向不同導致的干擾峰，保證在1800~2400cnfi光譜區間內的 窄帶單峰輸出模式。
[0031] 4. W生物大分子、聚合物或二氧化娃料作為保護殼層，封裝自組裝有信號分子貴 金屬納米粒子等探針母體，其外表面提供富含反應活性基團利于后續生物功能分子的嫁 接。
[0032] 5. W配體(如葉酸）、抗體(如促黃體激素釋放激素）、多膚類(如細胞穿透膚、核定 位膚等)等生物功能分子通過抓C-NHS或戊二醒等交聯反應至探針表面，即可得具有特異生 物祀向功能的SERS成像探針。
[0033] 相對于現有SERS成像探針，本發明具有W下優點和有益效果：
[0034] 1.該探針在1800-2400cnfi光譜區發射窄帶（l-2nm)單峰的超強拉曼散射信號，能 夠有效避免細胞內源物質在低波數區域(<1800cnfi)的本征拉曼信號和巧光信號的干擾;該 探針所使用信號分子的烘基拉曼位移可W通過改變對琉基苯乙烘主體結構中烘基末端的 取代基團來調節，在多色成像應用中能有效避免標記信號之間互相重疊的問題;該探針信 號強度大、光學穩定，使用常規拉曼光譜儀能有效縮短生物成像時間，其窄帶單峰的輸出模 式可用于無光柵超快拉曼成像儀的設計與開發。
[0035] 2.該探針拉曼散射的光學響應強、窄帶單峰發射、無光學背景干擾，在多組分同時 標記的生物成像領域意義重大。該技術可延伸至W帶通濾光片為分光器件，W光電倍增管 (PMT)或雪崩光電二極管(APD)為檢測器件的無光柵超快拉曼成像儀的設計與開發，克服了 拉曼成像逐點掃描、成像慢的技術瓶頸，將填補光學成像類儀器的市場空白。
【附圖說明】
[0036] 圖1為琉基乙酸對信號分子與增強基底的連接方式進行改善的原理示意圖。
[0037] 圖2為Β1、Β2、Β3Ξ種信號分子的拉曼位移光譜對比圖。
[0038] 圖3為琉基乙酸對信號分子與增強基底的連接方式進行改善的光譜強度對比圖。
[0039] 圖4為Β3信號分子制備的SERS探針與花粉細胞內源物質在不同波數處的細胞成像 對比圖；其中，圖4(A)為1580cm-i的細胞成像圖，圖4(B)為2212cm-i的細胞成像圖。
[0040]圖5為Β1、Β2、Β3Ξ種信號分子制備的SERS探針的貼壁細胞成像圖。
[0041 ] 圖6為B1、Β2、Β3Ξ種SERS探針在同一細胞中的光譜圖。
[0042] 圖7為Β1、Β2、Β3Ξ種SERS探針在同一細胞中的細胞成像圖。
【具體實施方式】
[0043] 下面結合實例對本發明作進一步詳細的描述，并W實例證明本方法的優勢，但本 方法的實施方式不限于此。
[0044] 實施例1:窄帶單峰拉曼信號分子的制備
[0045] 烘控類窄帶單峰拉曼信號分子設計:本發明W對琉基苯乙烘為主體結構，通過替 換烘基末端取代基團來改變烘基拉曼散射信號的位移，并利用密度泛函理論計算對信號分 子的結構-拉曼位移的關系進行一系列預測及理論研究，得到了下表中的化學結構及其拉 曼位移，證明了當在對琉基苯乙烘的烘基末端改變基團時能有效的調節窄帶單峰信號分子 拉曼信號的位移。
[0046]
[0047] 信號分子光譜優化：W-定尺寸的銀包金納米粒子為增強基底，使用532nm對對琉 基苯乙烘分子的拉曼光譜進行優化，發現當金納米粒子加入對琉基苯乙烘時，會在1972畑1一1 和2105cnfi處分別產生一個拉曼信號，經過密度泛函理論計算證實運是由于信號分子與增 強基底的空間取向不同導致的，經過研究發現加入琉基乙酸時能夠對信號分子與增強基底 的連接方式進行改善，結果示意圖如圖1所示。
[0048] 信號分子SERS光譜:根據信號分子光譜優化結果，選擇Ξ種窄帶單峰信號分子B1、 B2、B3為例，得到的實際SERS光譜如圖2所示，Ξ者的烘基拉曼位移分別位于2105cm-i、 2158cnfi、2212cnf 1處，能有效地避免相互之間的干擾。
[0049] 實施例2
[0050] (1 )AuNPs-標記分子：取lOmL銀包金納米溶膠Ξ份，分別向其中加入10化濃度為 ImM的窄帶單峰信號分子B1、B2、B3的四氨巧喃溶液。
[0051] (2)琉基乙酸優化:上述溶液靜置化后加入10化L濃度為lOmmol/L的琉基乙酸的水 溶液。（此步驟僅在信號分子的烘基末端沒有取代時需要，譬如WB1為信號分子）。
[0052] (3)保護殼層:再靜置化后繼續加入ImL濃度為O.lwt%。的多環芳控(PAH)水溶液。
[0化3] (4)生物功能分子連接：1化后同時加入10化濃度為lOmM的1-(3-二甲氨基丙基)- 3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽化DC · HC1)水溶液和20化濃度為ImM的N-徑基班巧酷亞胺(NHS)水 溶液，靜置活化簇基，化后分別向Ξ份溶液中加入20化濃度為ImM的葉酸(FA)、促黃體激素 釋放激素(LH畑)、細胞穿透膚(CALNNR8)溶液。
[0054] (5)靜置一夜后離屯、收集并重懸至粒子濃度約為1〇12個/mL，放入冰箱中保存備用。 其中FA和LH畑修飾的SERS探針具有細胞膜祀向能力，CALNNR8修飾的SERS探針具有內質網 祀向能力。
[00對 WB1為信號分子，使用不同量的琉基乙酸進行優化:取立份101^的Bl-AuNPs納米 粒子，向其中分別加入0、1、10、100化濃度為1 Ommo 1 /L的琉基乙酸的水溶液，靜置Ξ小時后 測得的SERS光譜，如圖3所示。
[0056] 實施例3
[0057] 取lOmL粒子濃度約為10"個/mL的銀包金納米溶膠，向其中加入20化濃度為ImM的 B3信號分子，靜置化后繼續加入ImL濃度為O.lwt%。的多環芳控(PAH)水溶液，繼續靜置12h 后制得SERS探針。
[0058] 取lOmL均勻分散有百合花粉的水溶液，并向其中加入ImLSERS探針，在搖床上混勻 后將花粉溶液凍干W除去水分。
[0059] 配制高濃度的薦糖溶液并滴加少量至載玻片上，驚干后表層形成均勻透明的薦糖 層。取少量花粉顆粒灑落在薦糖層上并輕輕吹氣W施加壓力，使花粉牢固地粘附在薦糖表 面后可進行拉曼成像實驗。
[0060] W花粉中的類黃酬類物質在1580cnfi的拉曼信號為干擾峰進行驗證實驗。可W發 現，烘基信號分子在1580cnfi低波數區域的拉曼信號很容易與花粉中的干擾峰發生光譜重 疊現象(見圖4(A))，運對最終結果會產生極大干擾，而使用2212cnfi的標記峰則能有效避免 此類問題(見圖4(B))。證實了烘基SERS探針在細胞成像研究中對細胞內源物質的抗干擾能 力。
[0061 ] 實施例4
[0062] 取10血粒子濃度約為1〇12個/mL的銀包金納米溶膠Ξ份，分別向其中加入20化濃度 為ImM的窄帶單峰信號分子B1、B2、B3的四氨巧喃溶液。靜置化后繼續加入ImL濃度為 0.1 wt%。的琉基聚乙二醇化S-PEG)水溶液，靜置化后即可制得相應的SERS探針。
[0063] 在一次性培養皿(35mm)中放入直徑為20mm的玻璃蓋玻片(均經過高溫消毒），取細 胞傳代的最后一步稀釋后分散均勻的細胞懸浮液(300~50化L)均勻滴加至蓋玻片表面。在 培養箱中靜置2-4h后，細胞基本貼壁，補加2.5mL新鮮細胞培養液，等待4h。
[0064] 取Ξ份上述方法準備的貼壁細胞，并向其中分別加入Ξ種SERS探針，在培養箱中 繼續共培養12h后取出，使用PBS緩沖溶液輕輕沖洗蓋玻片，清除吸附于細胞膜表面而未進 入細胞中的SERS探針，之后可進行成像實驗。
[0065] 如圖5所示，Ξ種SERS探針均在細胞內呈現出了良好的分布狀況，并且各個通道之 間完全無影響，證明了 Ξ種烘控SERS探針相互之間不會發生干擾。
[0066] 實施例5
[0067] 取10血粒子濃度約為1〇12個/mL的銀包金納米溶膠Ξ份，分別向其中加入20化濃度 為ImM的窄帶單峰信號分子B1、B2、B3的四氨巧喃溶液。靜置化后繼續加入ImL濃度為 O.lwt%。的聚丙締胺水溶液。1化后同時加入10化濃度為lOmM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙 基碳二亞胺鹽酸鹽化DC ·肥1)水溶液和20化濃度為ImM的N-徑基班巧酷亞胺(NHS)水溶液。 靜置活化簇基Ih后分別向Ξ份探針中加入20化濃度為ImM的葉酸(FA)、促黃體激素釋放激 素（LHRH)、細胞穿透膚（CALNNR8)溶液。靜置一夜后離屯、收集即可制得Ξ種相應的SERS探 針。
[006引在一次性培養皿(35mm)中放入直徑為20mm的玻璃蓋玻片(均經過高溫消毒），取細 胞傳代最后一步稀釋后分散均勻的細胞懸浮液(300~5(Κ)μυ均勻滴加至蓋玻片表面。在培 養箱中靜置2-4h后，細胞基本貼壁，補加2.5mL新鮮細胞培養液，等待4h。
[0069] 細胞完全貼壁后加入具有內質網祀向能力的SERS探針(B3-CLANNR8-NPS) 200化并 輕輕混勻。在培養箱中繼續共培養12h后取出，使用PBS緩沖溶液輕輕沖洗蓋玻片，清除吸附 于細胞膜表面而未進入細胞中的內質網祀向探針，然后補加3mL新鮮培養基至小培養皿中， 并加入兩種細胞膜祀向SERS探針(Bl-FA-NPs和OPEl-LHRH-NPs)各200yL。繼續培養2-4h后 可進行SERS成像研究。
[0070] 圖6是在細胞中測得的較為典型的SERS光譜，可W發現Ξ種標記分子的信號能夠 非常清楚地區分開，并且完全不會被細胞內源物質所干擾。圖7是Ξ種探針在同一細胞中經 過檢測實際得到的成像結果，Ξ種SERS探針均按照生物功能分子的作用實現了特異性祀向 結果。
【主權項】
1. 一種無光學干擾的拉曼標記探針的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:將拉曼散 射峰位在1800-24000^ 1波數區、帶寬為l-2nm的窄帶單峰信號分子通過Au-s鍵或Ag-s鍵自 組裝到增強基底的表面，然后采用透光親水的殼體材料進行探針封裝，即得到無光學干擾 的拉曼標記探針； 所述的窄帶單峰拉曼信號分子，具有通式I所示的結構：其中，Ri、R2、R3、R4為-N〇2、-CH3 或Η，1?5為!1 或-S i (CH3) 3、-C2H5、-CH2CH2CH 2OH、苯基或炔基； 所述的增強基底為粒徑30_60nm的納米粒子，所述的納米粒子為（i)納米金、（ii)納米 銀或（i i i)以納米金或納米銀為殼的核殼結構納米粒子； 所述的殼體材料為生物分子、聚合物、二氧化硅中的一種。2. 根據權利要求1所述的無光學干擾的拉曼標記探針的制備方法，其特征在于:抱為!1的 窄帶單峰信號分子自組裝到增強基底的表面后，用巰基羧酸對窄帶單峰信號分子與增強基 底的連接方式進行優化，接著采用透光親水的殼體材料進行探針封裝。3. 根據權利要求1或2所述的無光學干擾的拉曼標記探針的制備方法，其特征在于:將 探針封裝后在殼體材料上嫁接生物靶向分子。4. 根據權利要求3所述的無光學干擾的拉曼標記探針的制備方法，其特征在于:所述的 窄帶單峰拉曼信號分子為5. 根據權利要求3所述的無光學干擾的拉曼標記探針的制備方法，其特征在于:所述的 巰基羧酸為巰基乙酸、巰基丙酸、巰基丁酸中的一種或幾種;所述的生物靶向分子為抗體、 配體、多肽中的一種。6. 根據權利要求5所述的無光學干擾的拉曼標記探針的制備方法，其特征在于:所述的 抗體為促黃體激素釋放激素，所述的配體為葉酸，所述的多肽為細胞穿透肽或核定位肽。7. 根據權利要求5所述的無光學干擾的拉曼標記探針的制備方法，其特征在于:所述的 生物靶向分子通過與H)C-NHS或戊二醛交聯反應嫁接到探針表面。8. -種無光學干擾的拉曼標記探針，其特征在于：由權利要求1-7任一項所述的無光學 干擾的拉曼標記探針的制備方法制備得到。9. 權利要求8所述的無光學干擾的拉曼標記探針在生物成像中的應用。10. -種高靈敏超快拉曼成像儀，其特征在于：以權利要求8所述的無光學干擾的拉曼 標記探針為檢測對象，在常規的光學顯微鏡基礎上，以激光作為激發光源，配置高精度的快 速掃描樣品臺，以超窄帶帶通濾光片提取探針的窄帶單峰超強拉曼散射信號，以超靈敏的 雪崩光電二極管為檢測元件，通過樣品臺的二維掃描逐點采集探針的光子信號并作偽彩色 處理。
【文檔編號】G01N21/65GK105823770SQ201610351941
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年5月25日
【發明人】沈愛國, 陳勇, 任家強, 胡繼明
【申請人】武漢大學