一種實時定量熒光監測分子印跡過程的方法和應用

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一種實時定量熒光監測分子印跡過程的方法和應用
【專利摘要】本發明公開了一種實時定量熒光監測分子印跡過程的方法和應用，目的在于提供一種可以對分子印跡反應過程進行實時定量熒光監控的方法、并用于制備高選擇性的分子印跡聚合物(MIP)。該方法不僅可以通過熒光信號的變化直接觀測到分子印跡反應的進行過程，而且能夠根據熒光曲線確定印跡反應的最佳終點，從而實現分子印跡過程的定量化。
【專利說明】
-種實時定量黃光監測分子印跡過程的方法和應用
技術領域
[0001] 本發明屬于材料制備技術領域，設及一種可W通過在線實時巧光監測從而定量制備高選擇性分子印跡聚合物的方法，W及將其應用于印跡各種目標分子。
【背景技術】
[0002] 分子印跡是一種通過人工合成獲得具有類似天然抗體和受體分子選擇性和親和力的聚合物材料的方法。與蛋白等生物識別分子相比，分子印跡聚合物有制備簡單、成本低廉、穩定性好、可重復使用、可用于多種目標物、易于修飾等優點。目前分子印跡聚合物在分離、傳感、催化等諸多領域都得到了廣泛應用，但在制備方法上尚缺乏定量的指導依據，大部分工作都是基于經驗進行簡單的條件優化，對于印跡的化學計量點難W掌控。
[0003] 葉磊教授研究組曾采用核磁共振(醒R)和動態光散射(DLS)等手段研究了沉淀聚合體系在不同反應時間得到的分子印跡聚合物對模板分子識別性能的變化化〇ng，Y.; Philip，J.Y.;Schilien，Κ.;Liu，F.;Ye，L.Insight into molecular imprinting in precipitation polymerization systems using solution NM民 and dynamic light scattering. Journal of Molecular Recognition，2011,24,619-630) D除此之外，其它研究小組先后采用焚光各向異性和焚光光譜（Chen, Y.C. ; Wang，Ζ· ;Yan，M. ;Prahl， S.A.Fluorescence anisotropy studies of molecularly imprinted polymers. Luminescence: The Journal of Biological and Chemical Luminescence 2006,21,7-14;Wandelt，B.;Mielniczak,A.;Cywinski，P.Monitoring of cAMP-imprinted polymer by fluorescence spectroscopy.Biosens Bioelectron 2004，20，1031-1039)、控曼光譜（Uibel，民.H. ;Harris，J.M. Templating of multiple ligand metal ion complexation sites in 8-hydroxyquinoline-modified silica sol-gel materials investigated by in situ Raman spectroscopy.Anal Chem 2005,77,991-1000.)、紅外光譜（Osmani，Q. ;Hughes，H. ;Flavin，K. ;Hedin-DahlStrom，J. ;A1 lender，C.J. ;Frisby, J. ;McLoughlin，P. The use of FTI民 and NM民 spectroscopies to study prepolymerisation interactions in nitrogen heterocycles . Analytical and bioanalytical chemistry 2008,391,1229-1236;Molinelli,A.;0'Mahony，J.;Nolan，K.; Smyth,M.民.；Jakusch，M.;Mizaikoff，B.Analyzing the mechanisms of selectivity in biomimetic self-assemblies via I民 and NM民 spectroscopy of prepolymerization solutions and molecular dynamics simulations.Anal Chem 2005，77，5196-5204.)和圓二色（CD)光譜（Fireman-Shoresh,S. ;Marx，S. ;Avnir，D. Induction and detection of chirality in doped so 1 ?ge 1 materia1s:NM民 and circular dichroism s 化 dies .Journal of Materials Qiemistry 2007,17,536)等方法對分子印跡的機理進行了研究。但上述方法都只能對分子印跡的起始反應溶液和產物進行離線分析，未能實現原位、實時跟蹤分子印跡的整個反應過程。
[0004] 多己胺(Dopamine,DA)自聚是一種非常溫和的聚合反應，在室溫、溶解氧^及堿性條件下，即可在多種表面快速發生(Xee ,Η. ;Dellatore ,S.M. ;Mille;r ,W.M. ;Messersmith, P.B.Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings . Science 2007，318，426-430.)。聚多己胺不僅能在所有的材料表面附著成膜，而且形成的薄膜表面含有大量的活性官能團，能夠發生一系列反應，為進一步修飾改性提供了條件。目前多己胺自聚反應已經被應用于多種蛋白質分子的印跡，如肌紅蛋白（myoglobin)、辣根過氧化物酶化RP)、溶菌酶（lysozyme)和人血清白蛋白化SA)等（Zhou，W.H. ;Lu，C.H. ;Guo，X.C.;化en, F.R.;Yang,Η.Η.;Wang,X.R.Mussel-inspired molecularly imprinted polymer coating superp曰r曰magnetic n曰nop曰rticles for protein recognition.Journal of Materials Qiemistry 2010,20,880-883;Zhang,M.;Zhang,X.;He,X.;Chen,L.;Zhang,Y.A self- assembled polydopamine film on the surface of magnetic nanoparticles for specific capture of protein.Nanoscale 2012,4,3141-3147；Nematollahzadeh,A.； Shojaei,A.；Abdekhodaie,M.J.；Sellergren,B.Molecularly imprinted polydopamine n曰no-1曰yer on the pore surface of porous particles for protein capture in HPLC column.Journal of colloid and interface science 2013,404,117-126.)。
[0005] 但是，上述工作都是在大體積（15-50mL)的反應溶液中進行印跡反應。由于只能在反應結束后才能對材料的吸附選擇性和吸附容量進行表征，使得材料制備條件的優化工作量巨大，聚合反應的時間長達3-48小時，并且發現聚合反應時間過長確實會發生印跡因子不升反降的情況。

【發明內容】

[0006] 針對W上問題，本發明提出一種實時定量巧光監測分子印跡過程的方法和應用，目的在于提供一種可W對分子印跡反應過程進行實時定量巧光監控的方法、并用于制備高選擇性的分子印跡聚合物(MIP)。該方法不僅可W通過巧光信號的變化直接觀測到分子印跡反應的進行過程，而且能夠根據巧光曲線確定印跡反應的最佳終點，從而實現分子印跡過程的定量化。
[0007] 根據
【申請人】在研究過程中的發現，聚多己胺可W高效巧滅異硫氯基巧光素標記蛋白（FITC-protein)和羅丹明B(化B)的巧光，而單體多己胺并無運一性質。據此，本發明設計在實時巧光PCR儀上進行分子印跡反應，利用多己胺聚合條件簡單、聚多己胺可W巧滅巧光的特性，通過利用模板分子自身巧光或外加巧光指示劑的方法，實時跟蹤監測聚合反應進行過程中溶液巧光強度的變化。該方法可W直觀地看到模板分子進入聚多己胺層并被巧滅的時間曲線，協助定量判斷分子印跡聚合反應的最佳終點，從而提供一種便捷、實用的實時定量進行分子印跡、獲得高特異性MIP的方法。
[0008] 為實現上述目的，本發明采用W下技術方案：
[0009] -種實時定量巧光監測分子印跡過程的方法，包括：
[0010] 1)在反應管中依次加入含有表面可生長聚多己胺的納米顆粒的緩沖液和帶巧光指示的模板分子，混合均勻后加入多己胺水溶液；
[0011] 在實時巧光PCR儀上實時監測反應溶液巧光值的變化，當巧光值下降到接近平臺時，終止反應。
[0012] 進一步地，步驟1)中所述表面可生長聚多己胺的納米顆粒包括Si化納米顆粒、金納米顆粒、磁納米顆粒等各種無機或有機固體顆粒材料;為了方便反應后與溶液分離，優選磁納米顆粒;更優選化3〇4@Si化磁納米顆粒。
[0013] 進一步地，步驟1)中，表面可生長聚多己胺的納米顆粒的濃度不超過0.2mg/mL，優選0.1-0.2mg/mM巧光模板分子濃度不超過0.1 mM，優選ΙΟηΜ-ΙΟμΜ之間；多己胺水溶液濃度應不超過0.1 mg/mL，優選0.05-0.1 mg/mL。
[0014] 進一步地，步驟1)中所述帶巧光指示的模板分子包括本身具有巧光性質的模板分子，通過共價標記巧光團的模板分子W及本身不具有巧光性質，外加了巧光指示劑的模板分子。
[0015] 進一步地，步驟2)中，對于本身具有巧光性質的模板分子，在實時巧光PCR儀上采用模板分子的激發、發射波長條件實時監測反應溶液巧光值的變化;對于帶有共價標記巧光團的模板分子，在實時巧光PCR儀上采用所標記巧光團的激發、發射波長條件實時監測反應溶液巧光值的變化;對于本身不具有巧光性質，外加了巧光指示劑的模板分子，在實時巧光PCR儀上采用巧光指示劑的激發、發射波長條件實時監測反應溶液巧光值的變化。
[0016] 進一步地，本方法還包括:終止反應后分離出表面吸附有分子印跡聚合物的納米顆粒，洗涂后干燥保存或進一步使用;其中磁納米顆粒用磁場分離。
[0017] 進一步地，為使巧光指示劑信號的變化更好地反映出模板分子進入聚合物的過程，應選用波長條件與實時巧光PCR儀匹配，且帶電或親疏水性質與模板分子相近或本身與模板分子之間具有一定相互作用的巧光分子作為巧光指示劑。
[0018] 另外，雖然不加磁納米顆粒的多己胺溶液也可W發生自聚而引起巧光下降，但為了方便印跡聚合物的后續分離保存和應用，本發明在聚合反應中均加入磁納米顆粒。同時，為了避免Fe3〇4磁核表面對巧光模板分子或巧光指示劑有嚴重的非特異性吸附而導致與聚合反應無關的巧光巧滅，本發明對Fe3〇4磁核進行了較厚的Si化包覆處理。如附圖1所示，獲得的化3^@Si〇2粒徑為105±5nm，其中Si化層的厚度約為50皿。
[0019] 本發明利用上述實時定量巧光監測分子印跡過程的方法，根據反應溶液巧光曲線的變化最大化印跡因子和選擇因子，制備高選擇性的分子印跡聚合物。
[0020] 本發明的有益效果為：
[0021] 提供了一種可實時巧光監測分子印跡聚合反應過程的方法。根據巧光曲線的變化可實現高選擇性分子印跡聚合物的制備，簡化了分子印跡聚合物的制備過程。本發明的方法操作簡單、可控性好，可為獲得高選擇性的MIP提供快速、高通量的條件優化平臺，并為進一步深入研究分子印跡機理提供實用、可靠的研究手段。
【附圖說明】
[00。]圖1是制備多己胺印跡MIP所用Fe3〇4@Si化磁納米顆粒的透射電鏡圖。
[0023] 圖2是初始濃度分別為10、5.0、2.0和1.0nM的DNase-FITC模板分子在37°C下、含 0.2mg/mL Fe3〇4@Si〇2的1 OmM Tr i S緩沖液(pH = 8.0)中用0.1 mg/血多己胺進行印跡的實時巧光變化曲線。圖中虛線為各初始模板分子濃度條件下用式(1)進行非線性擬合的結果。
[0024] 圖3是面ase-門TC印跡曲線中ti/2(min)與對應起始模板分子濃度(nM)的線性相關曲線。
[0025] 圖4是不同印跡聚合反應時間mfese-FITC模板分子從溶液進入MIP的轉化率及該條件下獲得的MIP對DNase-F口對莫板分子的選擇性和印跡因子。
[0026] 圖5是初始濃度分別為10、20、40和50nM的化B在37°C下、含0.2mg/mL化3〇4@Si〇2的 lOmM化is緩沖液(pH=8.0)中用O.lmg/mL多己胺進行印跡的實時巧光變化曲線。
[0027] 圖6是不同起始濃度的化B印跡曲線中ti/2(min)與濃度(nM)間的線性相關曲線。 [00%]圖7是不同印跡聚合反應時間化B從溶液進入MIP的轉化率及該條件下獲得的MIP 對化B的選擇性和印跡因子。
[0029] 圖8是lOnM的DNase I(或Exo III)與50nM的RhB混合后，在37°C下、含0.2mg/mL 化304@Si02的lOmM化is緩沖液(抑=8.0)中用O.lmg/mL多己胺進行印跡的實時巧光變化曲線。
[0030] 圖9是DNase 1+化B雙重印跡體系中不同反應時間化B從溶液進入MIP的轉化率及該條件下獲得的MIP對DNase I的選擇性和印跡因子。
[0031] 圖10是Exo III+化B雙重印跡體系中不同反應時間化B從溶液進入MIP的轉化率及該條件下獲得的MIP對Exo III的選擇性和印跡因子。
【具體實施方式】
[0032] 下面通過實施例對本發明做進一步描述，但本領域的技術人員應當理解，實施例不應解釋為對本發明的限制，在本發明的精神和實質范圍內，可W做各種修改和變動，本發明的保護范圍應視所附權利要求書而定。
[0033] 實施例一、實時巧光監測巧光標記蛋白的分子印跡過程。
[0034] 為了展示本方法對巧光模板分子的可行性，首先自行制備了脫氧核糖核酸酶I的異硫氯基巧光素標記物(歴ase-FITC)。將30mg DNase I溶解在10血PBS緩沖液中（Ο.ΙΜ,ρΗ 9.16)，向其中逐滴加入含有2mL 2.3mg/mL FITC的DMS0溶液。在室溫下避光振搖地。然后加入5血Tri S緩沖液(0.1M，抑=8.0)終止反應。繼續振搖0.化，然后用0.45μπι濾膜過濾，濾液用lOkDa Mi 11 ipore超濾管在4°C W及4500巧m下離屯、15min進行超濾。重復超濾6次保證未反應的FITC被完全洗去。通過W下公式計算DNase I的標記率:F/P = 3.1 XA49日/[A280-0.31 X A49已]。
[0035] 其中A280和A495分別為超濾后溶液在280nm和495nm處的吸光度值。經過計算得到F/ P為3.66,即相當于平均每個DNase I分子上標記了 3.66個FITC，數目較為合適。將所得 DNase I-門TC標記物定量至0. ΙμΜ用于下一步的印跡實驗。
[0036] 印跡反應在20化L八聯管內進行，在含有0.2mg/mL Fe3^@Si〇2的lOmM Tris緩沖液 (抑= 8.0)中，加入終濃度分別為10,5.0,2.0和1.0碰的面曰36-門1'(：，室溫下混合30111111。然后加入終濃度為0.1 mg/mL的DA水溶液（用新鮮去離子水配制，下同），用lOmM Tris緩沖液 (pH=8.0)將體系的最終體積定容為2(K)yL。將W上裝有反應溶液的八聯管置于實時巧光 PCR儀(S化atagene Mx3000P，USA)內，設定溫度為37°C，連續監測記錄FITC對應通道(激發波長為492nm，發射波長為516nm)的巧光強度直至到達平臺不再繼續變化，得到用多己胺印跡不同濃度麗ase-門TC的巧光下降曲線，如圖2所示。在相同條件下制備不加面ase-門TC的聚多己胺NIP磁納米顆粒作為參比。
[0037] 由圖2可見，隨著印跡反應的不斷進行，溶液的巧光強度隨之逐漸下降。起始溶液中加入的模板分子量越少，曲線下降到達平臺所需的時間越短。若用Fo表示反應溶液的起始巧光強度，Fb表示曲線下降到平臺后的巧光強度，Ft表示反應進行到t(min)時溶液的巧光強度，CRt表示t(min)時印跡反應的轉化率（即溶液中的模板分子進入到聚多己胺層的百分比），則CRt = (Fo-Ft) / (Fo-Fb)。當CRt = 0.5時，表明已有約50 %的模板分子進入聚多己胺層，此時對應的反應時間用ti/2(min)表示。將圖2中各條曲線的ti/2(min)與對應起始模板分子的濃度co(nM)作圖，結果示于圖3中。可見，二者之間存在非常好的線性關系，線性回歸方程為：
[003引 ti/2(min) =2.03c0(nM)+24.9(r2 = 0.995)
[0039] 進一步對圖2中的數據進行擬合，可得CRt隨時間的變化符合W下關系式（R2〉 0.999)
[0040]
(1)
[0041] 其中P為擬合得到的常數，p = 2.6±0.2。
[0042] 為進一步了解不同反應時間獲得的多己胺印跡D化se-FITC的磁納米顆粒的吸附特性，在含有0.2mg/mL Fe3〇4@Si〇2的lOmM Tris緩沖液(pH = 8.0)中，加入最終濃度為lOnM 的麗ase-FUC進行印跡。分別在反應30min，60min，90min，120min，150min及ISOmin時終止反應，分離出磁納米印跡顆粒并用乙醇洗涂Ξ次。
[0043] 在含有40yg上述不同反應時間得到的磁納米印跡顆粒的lOmM化is緩沖液(ρΗ = 8.0)中，分別加入lOOng的DNase I或外切酶Ι?ΠΕχο III，作為參考蛋白考察ΜΙΡ的選擇性），吸附30min后，測量上清液中剩余酶的活性，計算被吸附的酶的量。
[0044] DNase巧蛇XO III的活性分別采用W下DNA巧光探針進行測定。
[0045] 面ase I探針：5 ' -C*A*A*C*(dT-TAMRA)*ACATCACTCGGATG(dT_BHQ2)*A*G*T*T*G_ 3，
[0046] Exo III探針：5'-A*T*C*A*T*C*T*T*T*A*C*G*C*A*A*G*A*(dT-B冊 1)*G*A*T-FAM- 3，
[0047] 其中下劃線斜體表示互補序列，加星號表示硫代修飾的堿基，TAMRA和FAM分別為簇基四甲基羅丹明和簇基巧光素標記，B冊2和B冊1分別為其對應的巧滅基團。
[004引圖4對比了不同反應時間得到的初始模板分子濃度為lOnM的DNase-FITC印跡的 MIP的轉化率(CR)、印跡因子（IF)和選擇性(Selectivity)測定結果。其中印跡因子（IF)為 MIP與對應NIP對模板分子吸附容量的比值;選擇因子(Selectivity)為MIP對模板分子與作為參照的非模板分子的吸附容量的比值。可見，從反應時間30min到120min，MIP的選擇性和印跡因子均隨著反應時間的增加而增大。到反應120min時，模板分子的轉化率達到92.9%。而從120min到150min的反應過程中，模板分子的轉化率僅僅增加了3%，印跡因子和選擇性到達平臺，甚至開始下降，說明運段反應時間內合成的主要為NIP，且其覆蓋和阻礙了內部 MIP的印跡位點對模板分子的結合。因此，為了得到印跡效果最好、選擇性最高的MIP，最佳的印跡反應時間為120min。
[0049] 實施例二、實時巧光監測小分子巧光染料羅丹明B(化B)的分子印跡過程。
[(K)加]在含有0.2mg/mL化3〇4@Si〇2的lOmM Tris緩沖液(pH=8.0)中，加入終濃度為10， 20，40，5化Μ的化B，室溫下混合30min。加入終濃度為0.1 mg/mL的DA水溶液（用新鮮去離子水配制），體系的最終體積為2(K)yL。反應在2(K)yL八聯管中進行，在實時巧光PCR儀上設定溫度為37°C，監測化B對應通道(激發波長為556nm，發射波長為580nm)的巧光值變化化。巧光曲線如圖5所示。對得到的RhB巧光下降曲線進行擬合，得到與式（1)相同的非線性相關方程 (R2〉0.999)，其中p = 2.7±0.2，tl/2與加入RhB的起始濃度成線性關系（圖6)，tl/2(min) = 0.597c〇(nM)+36.4(R2 = 0.998)。
[0化1]與印跡EWase-FITC的結果相對比，RhB模板分子增加所需增加的印跡反應時間小于面ase-門TC，表明PDA與化B之間的相互作用相對較強。二者的P值非常接近，推測P值為聚多己胺印跡體系印跡單一模板分子時的特征常數。計算可得當t = 0.74ti/2時，轉化率隨反應時間的增加達到極大值，即模板分子進入聚多己胺層的速率最快。
[0052] 在含有〇.2mg/mL化3〇4@Si〇2的lOmM Tris緩沖液(抑=8.0)中，加入終濃度為50nM 化B，室溫下混合30min。加入終濃度為0.1 mg/mL的DA水溶液(用新鮮去離子水配制），體系的最終體積為2(K)yL。反應在20化L八聯管中進行，在實時巧光PCR儀上設定溫度為37°C，監測化8對應通道的巧光值變化，并且分別在反應30min，60min，90min，120min，150min及ISOmin 后終止反應，分離出得到的不同印跡時間的磁納米顆粒并用乙醇洗涂Ξ次。
[0053] 在含有40yg上述不同反應時間得到的化B印跡的磁納米顆粒的lOmM化is緩沖液 (pH = 8.0)中分別加入8pmol的RhB或FAM(FAM作為RhB的類似物用于表征MIP產物的選擇性），體系的最終體積為20化L。吸附30min后，測量上清液的巧光，計算被吸附的巧光染料的量。
[0054] 上述不同反應時間得到的化B印跡的磁納米顆粒的吸附實驗結果如圖7所示。在反應150min之內，MIP的選擇性和印跡因子隨著反應時間的增加而增大，反應的轉化率達 89.9%。之后，從150min到ISOmin，轉化率僅僅由89.9 %增大到93.4%，且MIP的選擇性和印跡因子不再繼續提高，表明該印跡體系合適的反應時間為150min。
[0055] 由W上實驗結果可知，通過監測多己胺印跡巧光模板分子過程中巧光值的變化，可W確定合適的終止聚合反應的時間。當CRt約為90%時，獲得的印跡材料印跡因子和選擇性最佳，計算可得對應的反應時間t = 2.3tl/2。由于tl/2與起始模板分子的濃度成線性關系，因此對于確定的起始模板分子的濃度，可W方便地估算出合適的印跡聚合反應時間。
[0056] 實施例羅丹明B為外加巧光指示劑，實時巧光監測多種蛋白的分子印跡過程。
[0057] 在前面的方法中，對于不具有巧光性質的蛋白分子DNase I預先進行了共價巧光標記。雖然巧光標記的方法并不復雜，但還是增加了額外的步驟，并存在降低模板蛋白分子活性的風險。W下進一步提出一種免巧光標記的雙重印跡方法，嘗試在印跡無巧光標記的普通目標蛋白分子的反應溶液中，直接加入小分子巧光染料作為巧光指示劑進行印跡。其中目標蛋白的作用是作為印跡體系的模板分子，而小分子巧光染料的作用是在印跡的過程中產生巧光信號變化，指示印跡反應的進程。
[0化引在含有0.2mg/mL化304@Si化的lOmM Tris緩沖液(pH = 8.0)中，同時加入終濃度為 50nM的RhB與lOnM的模板蛋白（面ase I或Exo III)，室溫下混合30min。加入最終濃度為 O.lmg/mL的DA水溶液，體系的最終體積為2(K)yL。反應在20化L八聯管中進行，在實時巧光 PCR儀上設定溫度為37°C，監測對應通道的巧光值變化，并且分別在反應30min，60min， 90min，120min，150min及ISOmin后終止反應，分離出得到的磁納米顆粒并用乙醇洗涂Ξ次。 [0化9] 實驗得到了與前面類似的巧光下降曲線（圖8)。對于lOnM面ase I，p = 2.6±0.1， ti/2 = 42.6min。對于lOnM Exo III，p = 2.7±0.1，ti/2 = 49.Omin。對照實施例二中，單獨 50nM化B的印跡體系，ti/2 = 66.3min。可見同時含有化B與模板蛋白的印跡反應溶液中，化B 與模板蛋白之間可能存在弱的相互作用，從而加速了化B進入PDA層的過程，導致巧光下降速率加快。面ase巧蛇XO III的分子量相近，但是面ase I的等電點（pl = 4.9)低于Exo III (pl = 5.9)。在抑= 8.0的化is緩沖液中，前者帶有更多的負電荷，因此與帶有正電荷的化B 具有更強的作用力，使得巧光下降速率更快，即tl/2值更低。為了驗證運一規律，進一步印跡了其他幾種常見的蛋白：脫氧核糖核酸酶I、牛血清蛋白、核酸外切酶III、膜蛋白酶、溶菌酶，在相同的起始模板分子濃度條件下，測得tl/2值如表1所列。
[0060] 表1.50nM化B分別與lOnMW下各蛋白進行雙重印跡對應的tl/2值
[0061]
[0062] 其中用EWase I印跡的MIP吸附Exo III或者Exo III印跡的MIP吸附EWase I來表征對應的MIP的選擇性，用對應的NIP吸附的目標酶的結果作為參照來表征MIP的印跡因子，在含有40yg上述不同反應時間得到的雙模板印跡磁納米顆粒的lOmM Tris緩沖液(pH = 8.0)中分別加入10化g的面ase I或Exo III，吸附30min后，測量剩余上清液中的對應酶的活性，從而計算被吸附的酶的量。
[0063] 作為MIP的參比，制備了與其反應時間相同的NIP磁納米顆粒，即聚合時沒有加入模板蛋白分子和巧光染料制備的磁納米顆粒。
[0064] 結果如圖9和圖10所示。總體變化規律與實施例一和實施例二的結果非常相似，從反應時間30min到120min之間，MIP的選擇性和印跡因子均隨著反應時間的增加而增大。面ase I的MIP在反應時間接近120min時，MIP的選擇性和印跡因子達到最大值，而Exo III 的MIP在反應時間120min后也很快達到最大值。二者最佳印跡反應時間之間的差別與表1中二者tl/2之間的差別非常接近。
[0065] 特別值得一提的是，對面ase I的MIP，免巧光標記的雙重印跡方法得到的最佳反應時間與實施例一中共價巧光標記D化se I得到的結果基本一致，可見外加巧光指示劑的雙重印跡方法可W替代共價巧光標記蛋白的印跡方法，從而成為一種簡便、實用的實時巧光指示制備印跡因子和選擇因子最大化的分子印跡聚合物的方法。
【主權項】
1. 一種實時定量熒光監測分子印跡過程的方法，包括： 1) 在反應管中依次加入含有表面可生長聚多巴胺的納米顆粒的緩沖液和帶熒光指示的模板分子，混合均勻后加入多巴胺水溶液； 2) 在實時熒光PCR儀上實時監測反應溶液熒光值的變化，當熒光值下降到接近平臺時，終止反應。2. 如權利要求1所述的實時定量熒光監測分子印跡過程的方法，其特征在于，步驟1)中所述表面可生長聚多巴胺的納米顆粒包括Si0 2納米顆粒、金納米顆粒、磁納米顆粒。3. 如權利要求1所述的實時定量熒光監測分子印跡過程的方法，其特征在于，步驟1)中所述表面可生長聚多巴胺的納米顆粒為Fe 3〇4@Si02磁納米顆粒。4. 如權利要求1所述的實時定量熒光監測分子印跡過程的方法，其特征在于，步驟1) 中，表面可生長聚多巴胺的納米顆粒的濃度不超過〇.2mg/mL，熒光模板分子濃度不超過 0 · ImM，多巴胺水溶液濃度應不超過0 · lmg/mL。5. 如權利要求1所述的實時定量熒光監測分子印跡過程的方法，其特征在于，步驟1)中所述帶熒光指示的模板分子包括本身具有熒光性質的模板分子，通過共價標記熒光團的模板分子以及本身不具有焚光性質，外加了焚光指不劑的模板分子。6. 如權利要求5所述的實時定量熒光監測分子印跡過程的方法，其特征在于，步驟2) 中，對于本身具有熒光性質的模板分子，在實時熒光PCR儀上采用模板分子的激發、發射波長條件實時監測反應溶液熒光值的變化;對于帶有共價標記熒光團的模板分子，在實時熒光PCR儀上采用所標記熒光團的激發、發射波長條件實時監測反應溶液熒光值的變化;對于本身不具有熒光性質，外加了熒光指示劑的模板分子，在實時熒光PCR儀上采用熒光指示劑的激發、發射波長條件實時監測反應溶液熒光值的變化。7. 如權利要求5所述的實時定量熒光監測分子印跡過程的方法，其特征在于，選用波長條件與實時焚光PCR儀匹配，且帶電或親疏水性質與模板分子相近或本身與模板分子之間具有相互作用的熒光分子作為熒光指示劑。8. 如權利要求1所述的實時定量熒光監測分子印跡過程的方法，其特征在于，還包括：終止反應后分離出表面吸附有分子印跡聚合物的納米顆粒，洗滌后干燥保存或進一步使用。9. 如權利要求8所述的實時定量熒光監測分子印跡過程的方法，其特征在于，表面可生長聚多巴胺的納米顆粒為磁納米顆粒時，采用磁場分離出表面吸附有分子印跡聚合物的磁納米顆粒。10. 如權利要求1所述的實時定量熒光監測分子印跡過程的方法，其特征在于，還包括：根據反應溶液熒光曲線的變化最大化印跡因子和選擇因子，制備高選擇性分子印跡聚合物。
【文檔編號】G01N21/64GK105823766SQ201610165181
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年3月22日
【發明人】趙美萍, 劉藝斌, 翟筠秋
【申請人】北京大學

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