一種精子質量評估的試劑盒及其使用方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫療檢測技術領域，具體涉及一種精子質量評估的試劑盒及其使用方 法。
【背景技術】
[0002] 隨著社會工業的不斷發展，不育夫婦的總發病率明顯升高。2004年歐洲生殖學會 統計:育齡夫婦1年內不能懷孕者占25%，其中15%尋求治療，男方因素引起不育占50%。男性 不育的病因有性功能障礙(1.7% )，精索靜脈曲張（12. 3% )，生殖道感染(6.6%)，先天性發 育異常(2.1%)后天獲得性疾病(2.6% )，內分泌紊亂(0.6%)，免疫性因素(3.1%)，其他異常 (3%)，但是高達60%~75%的患者找不到原因，稱為特發性男性不育，他們只表現為少精、弱精 或畸形精子癥等精子質量異常。不明原因的男性不育可能由于多種因素造成，如長期應激 環境因素引起內分泌紊亂、活性氧和基因缺陷等。
[0003] 多年來，傳統的精液常規分析一直是用于判斷男性生育力的最基本臨床指標。臨 床上對絕大部分的男性不育患者的真正不育原因仍然不清楚。尤其是臨床上大約有三分之 一不育患者，男性的常規精液分析結果均正常和接近正常。臨床上把這類患者劃為不明原 因不育癥。因此，長期以來，臨床對男性不育的診斷存在很大的困難。最主要的原因是常規 精液分析只測定精子的數量，存活力，活動率和形態。這些指標只能反映最基本的精液質 量，不能反映所有的精子功能，比如，精子核的成熟和DNA損傷，精子與人卵透明帶結合反應 與穿透，頂體狀況和反應及與卵黃膜結合能力等。因此，需要建立特殊的精子功能試驗才能 測定以上這些功能。精子獲能是精卵結合形成受精卵的必要條件，雖然精子獲能的相關研 究已有一些進展，但仍然存在很多尚未闡明的問題。
[0004] 臨床工作中，一部分原發或繼發的不育男性病人利用現有的常規精液質量檢查項 目提示精子及精液質量無異常。目前常用的精子檢測手段為CASA(計算機輔助精子分析 Computer aided of semen analysis)，以及抗精子抗體等。當今最為廣泛使用的CASA技術 和一些形態學的相關檢測，主要能評價精子的活動能力和活精子比率，從而推測其進入女 性生殖道的受精能力，而依賴目前的精子功能評價體系，對精子質量及功能的評價存在一 定的缺陷，以及難于給病人提供相應的臨床咨詢。事實上，這僅僅是評價精子功能的一個方 面，我們應該考慮到可能還有影響精子生殖能力的更多沒有被揭示的因素。
[0005] 在先專利201310431847.0,提出了一種影響精子功能的唾液酸酶檢測方法。第一 步，通過單精子熒光強度分析直觀的量化唾液酸酶在精子中的表達，或者利用顯微鏡下熒 光成像直觀的觀察唾液酸酶在精子中的表達;若唾液酸酶在精子中高表達，則進行第二步， 利用體外獲能液使精子影響精子功能的唾液酸酶檢測方法獲能，并用熒光法檢測唾液酸酶 活性。該專利雖然公開了唾液酸酶蛋白分子在精子中的表達和基本活性的檢測。但在檢測 對象上，是對獲能液進行的酶活測定，檢測的是對精子進行獲能處理后，精子向獲能液中脫 落的唾液酸酶，目的是評估獲能后的精子質量。由于精子本身的唾液酸酶活性與獲能液的 酶活不存在必然關聯，該方法無法檢測精子本身所含的唾液酸酶，無法對精子本身質量進 行評估。同時，在方法上還存在以下缺點：1)技術流程復雜;2)對實驗設備和操作人員技能 和經驗要求高；3)不適于應用于臨床實驗室和常規技術人員使用;4)使用abeam公司的試劑 盒，價格昂貴。
[0006]
【發明內容】
： 針對上述技術問題，本發明提供了一種精子質量評估的試劑盒及其使用方法。對精子 提取蛋白的精子功能進行測定，采用新鮮及時的精液測定精子唾液酸酶的總活性，用于評 價男性不育的可能潛在原因，尤其是針對臨床上不明原因性不育是否與唾液酸酶活性有關 的情況。
[0007] 為了實現上述發明目的，本發明采用如下的技術方案： 一種精子質量評估的試劑盒，其特征在于:所述的試劑盒包括不含酶活抑制劑的細胞 裂解液、檢測緩沖液1、蛋白酶抑制劑cocktai 1、試劑A液、試劑B液、牛血清白蛋白、焚光試 劑、唾液酸酶標準原液和檢測緩沖液2。
[0008] 本發明所述的細胞裂解液不含酶活抑制劑，抑制劑會破壞唾液酸酶的活性，會影 響后面的酶活測定。
[0009] 所述的檢測緩沖液1為PBS (磷酸緩沖液)或者BWW培養液。
[0010] 所述的試劑A液為：1 %BCA二鈉鹽，2 %無水碳酸鈉，0.16%酒石酸鈉，0.4%氫氧化 鈉，0.95 %碳酸氫鈉，混合調pH值至11.2-11.3。
[0011] 所述的試劑B液為:4%硫酸銅。
[0012] 試劑A液用于提供反應原料BCA(即二喹啉甲酸)和堿性環境，試劑B液提供反應原 料二價銅離子。具體而言，B液顏色為天藍色，當與A液混合后，顏色顯示為蘋果綠色，在這種 堿性條件下，加入的蛋白質可將原先的二價銅離子還原為一價銅離子，而一個一價銅離子 可螯合兩個BCA分子，由此溶液顏色由蘋果綠色轉變為紫色。
[0013] 所述的唾液酸酶標準原液為產氣莢膜梭菌唾液酸酶(AUS)，濃度為5U/ml，能方便 的稀釋為5/2.5/1.25/0.625/0.312/0 mU/ml這些濃度梯度。采用產氣莢膜梭菌唾液酸酶適 用于本發明少量精子的檢測方法。
[0014]所述的熒光試劑是2'-4-甲基傘形酮基-a-D-N-乙酰神經氨酸鈉，具有較高的靈敏 度。
[0015] 所述Y -4-甲基傘形酮基-a-D-N-乙酰神經氨酸鈉的具體結構如下：
[0016]優選地，所述熒光試劑的濃度為10mM，提供熒光試劑的濃縮液，可保證其穩定性， 不易分解和淬滅，另可減少體積，便于裝盒。
[0017] 所述的檢測緩沖液2為含0.05 mm〇L/L乙酸鈉和0.25yg/yl牛血清白蛋白的PBS。檢 測緩沖液2的緩沖體系，是針對唾液酸酶活性檢測特定配制的。
[0018] 優選地，所述乙酸鈉的pH值為5-6,是針對唾液酶活性最佳的工作環境。
[0019] 本發明所述精子質量評估的試劑盒的使用方法:具體步驟如下： A、精子的洗滌 收集新鮮液化精液標本，檢測緩沖液1洗滌精子，充分除去殘留的精漿成分，再離心分 尚出精子。
[0020] 本發明先向精液標本中加入檢測緩沖液1進行洗滌，再離心分離得到精子沉淀。這 是由于精漿本身黏稠，直接對其離心不能使精液中所有精子充分沉淀，加入檢測緩沖液1對 其進行稀釋后，離心操作效果更好。
[0021] 優選地，對精液進行3次離心，保證檢測沒有精漿干擾的情況下，盡可能減少離心 精子的次數，保證精子活力。
[0022] B、提取精子蛋白 向A步驟分離出的精子中加入細胞裂解液和蛋白酶抑制劑cocktai 1，混勾，待無明顯的 細胞沉淀即充分裂解，在4°C下高速離心，上清液即蛋白提取物； 蛋白酶抑制劑cocktai 1的加入是用來抑制蛋白酶的作用，蛋白酶的作用是降解蛋白 質，而本發明的待檢物唾液酸酶就是一種蛋白質，加入蛋白酶抑制劑可以防止唾液酸酶被 降解。
[0023]優選地，所述裂解液的加入體積為精子體積的2-3倍，這樣可保證檢測的靈敏度。 [0024]優選地，所述的高速離心是指以12000r/min的速度離心5min，盡可能去掉細胞(精 子)碎片，否則這些碎片會影響檢測的特異性。
[0025] C、測定精子蛋白提取物的蛋白濃度 (1)用細胞裂解液配制牛血清白蛋白的蛋白標準原液，再用裂解液按2/1.0/0.5/0.25/ 0.125/0mg/ml的濃度梯度將蛋白標準原液稀釋為蛋白標準溶液，向檢測板內依次加入各蛋 白標準溶液;加入待測樣本于檢測板內，再加入裂解液稀釋。
[0026]優選地，用細胞裂解液配制牛血清白蛋白的蛋白標準原液的濃度為20mg/ml，可 于-20°C長期儲存，便于后面2/1.0/0.5/0.25/0.125/0mg/ml這些蛋白濃度梯度的配制。蛋 白標準溶液梯度根據精子提取物的蛋白濃度的表達量和本方法所能檢測到的靈敏度而設 定的。
[0027] (2)按A: B=50:1的體積比配制試劑A液和B液的混合液，將其加入上述各蛋白標準 溶液和待測樣本的孔內，輕輕混勻，將檢測板置于37°C反應30min，然后用酶標儀讀取各孔 吸光度，根據蛋白標準曲線計算出待測樣本的蛋白濃度。
[0028]優選地，所述的檢測板為96孔透明板。
[0029]優選地，所述的酶標儀在562nm波長下讀取各孔吸光度。
[0030] 檢測的孔內樣本蛋白濃度應在0.1-2mg/ml范圍內，如果超出，則應將孔內待測樣 本的蛋白濃度調整在此線性范圍之內。
[0031] D.測定精子唾液酸酶活性 (1)用檢測緩沖液2將唾液酸酶