脂蛋白a(Lp(a))測定試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明是屬于醫學免疫領域，涉及一種免疫檢測試劑，進一步說，本發明涉及脂蛋 白a (Lp (a))測定試劑盒檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 脂蛋白a測定試劑盒，該產品用于體外定量測定人血清中脂蛋白（a)(Lp(a))含量， 作輔助診斷用。脂蛋白（a)是一種獨特的脂蛋白，脂質組成結構與LDL極其相似，因含有特殊 的載脂蛋白（a)而得名。1987年發現脂蛋白（a)的一級結構與纖溶酶原具有顯著同源性，其 增高有導致血栓形成的傾向。Lp(a)體內水平高低與血脂、載脂蛋白不相關，是動脈粥樣硬 化性心腦疾病的重要的獨立危險因素。對冠心病、急性心梗的發病、病程變化以及轉歸極具 診斷價值。
[0003] 診斷方法:Lp(a)的測定一般采用RIA法、ELISA法與CL1A法、乳膠免疫比濁法等，但 在臨床上多采用乳膠免疫比濁法 血清(含Lp (a))+試劑(乳膠抗人Lp (a)抗體)-抗原抗體復合物 產生濁度變化，在一定的波長下檢測，其濁度的變化與其含量成正相關。
[0004] 目前抗體與乳膠的連接通常使用化學偶聯法，其作為R2試劑，非常容易發生聚結， 使得試劑質量隨著存放時間的延長而下降。使試劑的穩定性差。
【發明內容】
[0005] 本發明根據R2試劑穩定性不佳，提供了一種方法來克服現有技術的不足，使得其 保持質量穩定，提供了一種靈敏度高，穩定性好的脂蛋白a(Lp(a))檢測試劑盒。
[0006] 為實現上述目的，本發明提供了如下技術方案： 一種脂蛋白a(Lp(a))測定試劑盒，所述的試劑盒包括試劑R1、試劑R2,所述的試劑R1為 適當的緩沖液； 所述的試劑R2是用Lp(a)抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒置于緩沖液中，所述試劑R2的制 備步驟包括： 步驟（1):在帶有羧基的聚苯乙烯膠乳顆粒(膠乳）中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亞 胺(EDAC)，得到激活的膠乳顆粒； 步驟(2):將步驟(1)激活的膠乳顆粒和Lp(a)抗體混合，待反應結束后再加入葡萄糖封 閉膠乳微球上未反應的基團，得到偶聯抗體的膠乳微球即Lp(a)抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆 粒，置于緩沖液中。
[0007] 作為進一步優選:步驟(2)中Lp(a)抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒在試劑R2中的濃度 為0.08~0.28克/100ml。
[0008] 作為進一步優選:所述試劑R1中的緩沖液為PBS緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸鹽緩 沖液、醋酸鹽緩沖液、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液、2-嗎啉乙磺酸(MES) 緩沖液緩沖液中至少一種。
[0009]作為進一步優選:所述試劑R2中的緩沖液為PBS緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸鹽緩 沖液、醋酸鹽緩沖液、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液、2-嗎啉乙磺酸(MES) 緩沖液緩沖液中至少一種。
[0010]作為進一步優選:步驟（1)中乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺:聚苯乙烯膠乳顆粒的 重量比為0.2~5:100。
[0011] 作為進一步優選:所述Lp(a)抗體包括多克隆抗體或單克隆抗體。
[0012] 作為進一步優選:所述步驟（1)中的聚苯乙烯膠乳顆粒其平均粒徑在0.01~0.2mm 之間。
[0013] 本發明所述試劑盒所采用的檢測原理為膠乳增強免疫透射比濁法，其原理是Lp (a)抗體的膠乳顆粒，與Lp(a)發生免疫反應后，形成聚集顆粒，在一定波長下，通過測定聚 集物形成所產生的濁度，即可測出Lp(a)的含量。
[0014] 本發明的優點和有益效果： 1.本發明的試劑盒具有檢測簡單而快速、靈敏度高、準確性好、抗干擾能力強及生產成 本低的優點。
[0015] 2.本發明采用的Lp(a)檢測方法為膠乳增強免疫比濁法，該方法使得Lp(a)的檢測 更為經濟、方便和快速，適用于絕大多數醫院的自動生化分析儀，特別是對急診能實現快速 定量檢測。
【具體實施方式】
[0016] 下面通過實施例進一步詳細描述本發明，但本發明不僅僅局限于以下實施例。
[0017]
[0018]實施例l:Lp(a)檢測試劑盒的制備 本發明的試劑盒涉及試劑的主要原材料如下： 1.1^(3)抗體:單克隆抗體(市售）。
[0019] 2.膠乳:本發明僅示例性的采用直徑為80~200nm帶羧基基團的聚苯乙烯膠乳顆 粒(市售)進行實驗。
[0020] 本實施例的主要試劑的配制如下： 試劑R1:含1.5%PEG6000(聚乙二醇6000)、95mmol/LNaCl的磷酸鹽緩沖液，該試劑為無 色透明溶液。
[0021] 試劑R2:用抗人Lp(a)抗體致敏粒徑為80nm的聚苯乙烯膠乳顆粒。該試劑為乳白色溶 液。具體步驟如下： 1. 取lml (100mg/ml)膠乳，用0.02M(mo 1 /L)，pH5.0的MES溶液(2-嗎啉乙磺酸緩沖液)洗 滌3次，超聲分散； 2. 然后加入0.22ml用0.02M，pH5.0的MES溶液新鮮配制的EDAC(配制的溶液中EDAC的濃 度為10mg/ml)混合完全，室溫混和15min; 3. 然后用0.05M，pH5.0的MES溶液洗滌2次，0.1Μ，ρΗ7.5的磷酸鹽溶液洗滌1次，超聲分 散備用； 4. 取2ml抗體（5mg/ml)溶液，加入0.3ml用0.02M，pH7.5的磷酸鹽溶液配制，室溫混合 15min， 5. 然后加入0.32ml 10 % BSA (小牛血清白蛋白）溶液，4 °C混合4h; 6. 再加入0.4ml 10 %葡萄糖溶液，4 °C混合過夜； 7. 然后用0.015M，pH7.5的甘氨酸溶液洗滌3次，再加入0.015M，pH7.5的甘氨酸溶液(含 1 % BSA，0 · 2 % NaN3，15% 庶糖，0 · 01%EDTA-Na2，0 · 0 l%trtonX-l 00 的甘氨酸緩沖液)至膠乳(結 合抗體以后的膠乳重量)終濃度為〇. 18 % (質量體積比即0.18克/100ml)。
[0022]實施例2:Lp(a)的測定 檢測工具：日立7060型自動分析儀。
[0023] 分析方法：兩點終點法；主波長：570nm，副波長：700nm:樣品量：2ul (微升）；R1: 200ul; R2:50ul;反應方向：上升；測定溫度：37°C ;樣品與R1混勻后，于第10秒讀取吸光度 A1;于3~5min時加入R2,于5min后讀取吸光度A2。反應吸光度的計算為A2與A1的差值。
[0024] 計算方法:多點定標，根據吸光度與參考血清的值作劑量/響應曲線，樣品含量可 根據其吸光度值在劑量/響應曲線上算出。
[0025] 實施例3: Lp(a)檢測試劑盒性能評價 1. 分析靈敏度評估 采用5 %牛血清白蛋白溶液作為空白樣本，空白樣本應不含被測物。在生化分析儀上連 續檢測20次，計算20次結果的均值與標準差SD。以空白均值加兩倍標準差(+2SD)作為報告 方法的檢測限。從表1可見，靈敏度為6.42mg/L。
[0026] 表 1
2. 尚值線性評估 將 1份低值血清（l〇mg/L)和 1份高值血清（1000mg/L)按 9:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1: 4、1:9(樣本順序編號為1~6號），制備出6個不同濃度樣本，每個樣本重復測定2次，從表2可 見， 本發明檢測試劑盒的最高檢測范圍可達到901mg/L，判定依據r2 2 0.990。
[0027] 表 2 3. 精密度評估
使用2個不同Lp(a)含量的人血清樣品，測定本發明檢測試劑盒的批內精密度。使用3個 批號試劑盒分別測定1個人血清樣品20次，計算本發明檢測試劑盒的批間相對極差。結果表 明，本發明檢測試劑盒的批內精密度為3.2 %和2.8 % (見表3)，而批間相對極差為3.04 % (見表4)。
[0028] 表 3
4. 準確性(回收實驗)評估 選擇合適濃度的常規檢測樣本，分為體積相同的3份。在其中2份樣本中加入不同量的 待測物標準，制成2個不同加入濃度的回收樣本，計算加入的待測物的濃度。在另一份樣本 中加入同樣量的無被測物的溶劑，制成基礎樣本。對回收樣本和基礎樣本進行3次重復測定 分析，取其均值進行計算。（見表5) 表5
5. 干擾試驗 在同一份人血清樣品中分別加入不同含量的干擾物質后進行測定。加入干擾物質后的 測定值除以加入干擾物質前的測定值即為回收率，試驗結果表明膽紅素、血紅蛋白、甘油三 酯以及類風濕性因子的不同濃度以下時，對檢測結果無顯著干擾（以Lp(a)的回收率在90% ~110%之間為準）。（見表6)。
[0029] 表6
本發明的優點和有益效果： 1.本發明的試劑盒具有檢測簡單而快速、靈敏度高、準確性好、抗干擾能力強及生產成 本低的優點。
[0030] 2.本發明采用的Lp(a)檢測方法為膠乳增強免疫比濁法，該方法使得Lp(a)的檢測 更為經濟、方便和快速，適用于絕大多數醫院的自動生化分析儀，特別是對急診能實現快速 定量檢測。
[0031] 以上所述僅是本發明的優選實施方式，本發明的保護范圍并不僅局限于上述實施 例，凡屬于本發明思路下的技術方案均屬于本發明的保護范圍。應當指出，對于本技術領域 的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理前提下的若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也 應視為本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種脂蛋白a(Lp(a))測定試劑盒，所述的試劑盒包括試劑R1、試劑R2,所述的試劑R1 為適當的緩沖液； 所述的試劑R2是用Lp(a)抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒置于緩沖液中，所述試劑R2的制 備步驟包括： 步驟（1):在帶有羧基的聚苯乙烯膠乳顆粒(膠乳）中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亞 胺(EDAC)，得到激活的膠乳顆粒； 步驟(2):將步驟（1)激活的膠乳顆粒和Lp(a)抗體混合，待反應結束后再加入葡萄糖封 閉膠乳微球上未反應的基團，得到偶聯抗體的膠乳微球即Lp(a)抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆 粒，置于緩沖液中。2. 根據權利要求1所述的脂蛋白a(Lp(a))檢測試劑盒，其特征在于:步驟(2)中Lp(a)抗 體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒在試劑R2中的濃度為0.08~0.28克/100ml。3. 根據權利要求1所述的脂蛋白a(Lp(a))檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑R1中的緩 沖液為PBS緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液、碳 酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液、2-嗎啉乙磺酸(MES)緩沖液緩沖液中至少一種。4. 根據權利要求1所述的脂蛋白a(Lp(a))檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑R2中的緩 沖液為PBS緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液、碳 酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液、2-嗎啉乙磺酸(MES)緩沖液緩沖液中至少一種。5. 根據權利要求1所述的脂蛋白a(Lp(a))檢測試劑盒，其特征在于:步驟（1)中乙基二 甲基胺丙基碳化二亞胺:聚苯乙烯膠乳顆粒的重量比為〇. 2~5:100。6. 根據權利要求1所述的脂蛋白a(Lp(a))檢測試劑盒，其特征在于:所述Lp(a)抗體包 括多克隆抗體或單克隆抗體。7. 根據權利要求1所述的脂蛋白a(Lp(a))檢測試劑盒，其特征在于:所述步驟（1)中的 聚苯乙烯膠乳顆粒其平均粒徑在0.01~0.2mm之間。
【專利摘要】本發明公開了一種脂蛋白a(Lp(a))檢測試劑盒，所述的試劑盒包括試劑R1、試劑R2，所述的試劑R1為的緩沖液；所述的試劑R2為脂蛋白a(Lp(a))抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒與緩沖液的混合物。1.本發明的試劑盒具有檢測簡單而快速、靈敏度高、準確性好、抗干擾能力強及生產成本低的優點。2.本發明采用的脂蛋白a(Lp(a))檢測方法為膠乳增強免疫比濁法，該方法使得脂蛋白a(Lp(a))的檢測更為經濟、方便和快速，適用于絕大多數醫院的自動生化分析儀，特別是對急診能實現快速定量檢測。
【IPC分類】G01N33/92
【公開號】CN105675891
【申請號】CN201610050618
【發明人】陸雪龍, 宋高峰, 李清華, 周裕國
【申請人】寧波天康生物科技有限公司
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年1月26日