除草劑草甘磷的免疫膠體金檢測卡及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及環境激素檢測技術領域，特別是涉及草甘磷的免疫膠體金檢測卡及其制備方法。
【背景技術】
[0002]隨著農業科技的不斷發展，我國很多制藥廠能生產出高效、廣譜、低毒的除草劑，草甘膦便是其中的I種。草甘膦為內吸傳導型廣譜滅生性草甘膦，主要通過抑制植物體內烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶，從而抑制莽草素向苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的轉化，使蛋白質的合成受到干擾導致植物死亡。
[0003]草甘膦以內吸傳導性強而著稱，不僅能通過莖葉傳導到地下部分，而且在同一植株的不同分蘗間也能進行傳導，對多年生深根雜草的地下組織破壞力很強，能達到一般農業機械無法達到的深度。因此，能除去田間400多種雜草，為農村的每個家庭節省了很多勞動力，為我國的農業生產作出了很大貢獻。但在我國農業生產發展中，由于只研究了草甘膦的除草作用，卻沒有研究中毒后的解救方法，所以草甘膦也給我國的畜牧業發展和人類帶來一定的危害。
[0004]目前，環境激素污染物的分析方法主要分為以GC_MS、HPLC與LC-MS技術為代表的儀器分析方法以及基于抗原抗體反應的免疫分析技術，這些常規的殘留分析技術通常操作程序復雜，效率較低，分析成本較高，不利于推廣使用，難以適應大量樣本和現場檢測的要求。基于環境激素污染物的危害性、代表性及目前的研究熱點，本發明涉及一種除草劑草甘磷檢測卡及其制備方法。本發明的檢測卡具有簡便快捷、易于操作、成本低廉等優點，并且能同時檢測水樣中這二種環境激素污染物質，產生了良好的社會效益和經濟效益。
[0005]
【發明內容】
本發明的草甘磷膠體金檢測卡，包括包被了單克隆抗體膠體金標記物的膠體金結合墊、包被了草甘磷-BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纖維素膜、樣品墊、吸水墊、PVC膠板和塑料模具組成，在PVC膠板的一端依次粘附樣品墊、結合墊，中間黏貼硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊。
[0006]本發明的草甘磷膠體金檢測卡的制備方法，是由以下步驟實現:
(1)膠體金溶液制備:取IL三角燒瓶I個,加入超純水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4.3H20) 5 mL，配制成500 mL 0.01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7.2H20)溶液5_7 mL，繼續攪拌加熱，當溶液的顏色完全變為透明的紫紅色時，維持5 min后停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存備用；
(2)抗體的預處理:將要標記的草甘磷抗體在1000r/min, 4°C條件下,離心20 min,取上清，用0.01 mol/L PBS稀釋成I mg/mL ;或者用0.01 mol/L PBS稀釋成I mg/ml,過
0.22 Pm 濾膜；
(3)膠體金標記物的制備:取步驟⑴中的膠體金溶液40mL，用0.25 mol/L K2C03調節膠體金溶液pH至8.5,電磁攪拌器250 r/min攪拌,逐滴加入4 mL含0.3 mg抗體蛋白的蛋白溶液，反應10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA,繼續攪拌反應10 min ;金標抗體溶液常溫低速(1500 r/min)離心10 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4°C,12000 r/min離心20 min,棄上清,收集沉淀,將沉淀用金標抗體稀釋液定容至I mL,制備成草甘磷單克隆抗體膠體金標記物；
(4)膠體金膜的制備:將步驟(3)草甘磷蛋白質偶聯物單克隆抗體膠體金標記物用劃膜儀以5 PL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含草甘磷蛋白質偶聯物單克隆抗體膠體金標記物的膠體金膜；
(5)包被膜制備:將羊抗鼠IgG抗體、草甘磷蛋白質偶聯物稀釋成Img/mL，用劃膜儀依次以I PL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上,制備成包被膜,370C包被2 h后，室溫自然晾干或者37°C烘干；
(6)樣品墊前處理:將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干；
(7)檢測卡的組裝:PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水棉，組裝成試紙條，切割成一定寬度的長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。
[0007]所述步驟(5)中所包被的檢測線T設在質控線C的下方；
所述步驟(6)中的樣品墊處理液是由I g小牛血清蛋白(BSA)和0.8 g氯化鈉(NaCl),用含有 0.5%TRIT0N-100 的 0.01 mol/L PBS 定容至 100 mL ；
本發明可有效用于測定草甘磷，方法簡單，方便、快捷，結果準確。
【附圖說明】
[0008]圖1為本發明草甘磷的免疫膠體金檢測卡的結構圖:圖中1.加樣孔2.檢測線
3.質控線4.檢測孔5.試紙條6.檢測卡外殼。
[0009]圖2為本發明草甘磷的免疫膠體金檢測卡內的試紙條的剖視結構圖，圖中7.樣品墊8.膠體金結合墊9.PVC膠板10.硝酸纖維素膜11.吸水墊。
【具體實施方式】
[0010]實施例1
圖1、圖2所示的實施例:圖中9為PVC膠板；7為樣品墊；8為膠體金結合墊，該膠體金結合墊上包被了單克隆抗體膠體金標記物；10為包被膜，即硝酸纖維素膜，該硝酸纖維素膜上包被了草甘磷-BSA和羊抗鼠IgG ；11為吸水墊，由吸水材料如濾紙制成。
[0011]在PVC膠板9的一端上(樣品端)粘附樣品墊7、結合墊8，樣品墊7和結合墊8為并排結構。
[0012]在PVC膠板9的中間粘附硝酸纖維素膜10。在硝酸纖維素膜10上設置有羊抗鼠IgG質控線3和草甘磷-BSA檢測線2。
[0013]在PVC膠板9的另一端粘附吸水墊11。硝酸纖維素膜10的一端與結合墊8略交叉，另一端與吸水墊11略交叉。該試紙條5可裝入有塑料模具制成的檢測卡外殼6中，制成檢測卡，在檢測卡外殼6的上蓋上設有加樣孔I和檢測孔4，樣品墊7正對加樣孔1，硝酸纖維素膜10正對檢測孔4。
[0014]實施例2 草甘磷膠體金檢測卡制備，是由以下步驟具體實現:
膠體金溶液制備:取I L三角燒瓶I個,加入超純水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4.3H20) 5 mL，配制成500 mL 0.01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7.2H20)溶液5_7 mL，繼續攪拌加熱，當溶液的顏色完全變為透明的紫紅色時，維持5 min后停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存備用；抗體的預處理:將要標記的草甘磷抗體在1000 r/min, 4°C條件下,離心20 min,取上清，用 0.01 mol/L PBS 稀釋成 I mg/mL ;或者用 0.01 mol/L PBS 稀釋成 I mg/ml,過 0.22濾膜；
膠體金標記物的制備:取步驟(I)中的膠體金溶液40 mL，用0.25 mol/L K2C03調節膠體金溶液pH至8.5,電磁攪拌器250 r/min攪拌,逐滴加入4 mL含0.3 mg抗體蛋白的蛋白溶液，反應10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA，繼續攪拌反應10 min ;金標抗體溶液常溫低速(1500 r/min)離心10 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4°C, 12000r/min離心20 min,棄上清,收集沉淀,將沉淀用金標抗體稀釋液定容至I mL,制備成草甘磷單克隆抗體膠體金標記物；
膠體金膜的制備:將步驟(3)草甘磷蛋白質偶聯物單克隆抗體膠體金標記物用劃膜儀以5 PL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含草甘磷蛋白質偶聯物單克隆抗體膠體金標記物的膠體金膜；
包被膜制備:將羊抗鼠IgG抗體、草甘磷蛋白質偶聯物稀釋成I mg/mL，用劃膜儀依次以I KL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37°C包被2 h后，室溫自然晾干或者37°C烘干；
樣品墊前處理:將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干；
檢測卡的組裝:PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水棉，組裝成試紙條，切割成一定寬度長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。
【主權項】
1.草甘磷膠體金檢測卡，其特征在于按照下述步驟制備得到: (1)膠體金溶液制備:取IL三角燒瓶I個,加入超純水495 mL，而后加入1%氯金酸HAuCl4.3H20) 5 mL，配制成500 mL 0.01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉Na3C6H5O7.2H20溶液5_7 mL,繼續攪拌加熱，當溶液的顏色完全變為透明的紫紅色時，維持5 min后停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存備用； (2)抗體的預處理:將要標記的草甘磷抗體在1000r/min,4°C條件下,離心20 min,取上清，用 0.01 mol/L PBS稀釋成 I mg/mL ;或者用 0.01 mol/L PBS稀釋成 I mg/ml,過0.22 濾膜； (3)膠體金標記物的制備:取步驟(I)中的膠體金溶液40mL，用0.25 mol/L K2CO3調節膠體金溶液pH至8.5,電磁攪拌器250 r/min攪拌,逐滴加入4 mL含0.3 mg抗體蛋白的蛋白溶液，反應10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA,繼續攪拌反應10 min ;金標抗體溶液常溫1500 r/min離心10 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4°C, 12000 r/min離心20 min,棄上清,收集沉淀,將沉淀用金標抗體稀釋液定容至I mL,制備成草甘磷單克隆抗體膠體金標記物； (4)膠體金膜的制備:將步驟(3)草甘磷蛋白質偶聯物單克隆抗體膠體金標記物用劃膜儀以5 PL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含草甘磷蛋白質偶聯物單克隆抗體膠體金標記物的膠體金膜； (5)包被膜制備:將羊抗鼠IgG抗體、草甘磷蛋白質偶聯物稀釋成Img/mL，用劃膜儀依次以I PL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上,制備成包被膜,370C包被2 h后，室溫自然晾干或者37°C烘干； (6)樣品墊前處理:將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干； (7)檢測卡的組裝:PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水棉，組裝成試紙條，切割成一定寬度的長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。2.根據權利要求1所述的草甘磷膠體金檢測卡，其特征在于所述步驟(5)中所包被的檢測線T設在質控線C的下方； 所述步驟(6)中的樣品墊處理液是由I g小牛血清蛋白(BSA)和0.8 g氯化鈉(NaCl),用含有 0.5%TRIT0N-100 的 0.01 mol/L PBS 定容至 100 mL。
【專利摘要】本發明草甘磷的免疫膠體金檢測卡及其制備方法，涉及動物源食品獸藥殘留檢測技術領域。本發明的檢測卡外殼中的試紙條，由PVC膠板、樣品墊、膠體金結合墊、包被膜和吸水墊組成；膠體金膜為含草甘磷單克隆抗體的玻璃纖維素膜，包被膜是硝酸纖維素膜，其上設有T線和C線，T線包被有草甘磷蛋白質偶聯物，C線包被有羊抗鼠IgG抗體。本發明有效用于快速檢測草甘磷，方便、快捷、結果準確。
【IPC分類】G01N33/74
【公開號】CN105572392
【申請號】CN201410547557
【發明人】洪霞, 劉靜, 張淑雅
【申請人】丹陽億太生物科技發展有限公司
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2014年10月16日