吡蟲啉的免疫膠體金檢測卡及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及谷物食品中農藥殘留檢測技術領域，特別是涉及吡蟲啉的免疫膠體金檢測卡及其制備方法。
【背景技術】
[0002]卩比蟲啉(imidacloprid),化學名稱1-(6_氯_3_卩比唆基甲基)-N-硝基亞咪唑烷-2-基胺。吡蟲啉具有廣譜殺蟲活性，對飛虱、蚜蟲、葉蟬等刺吸式口器害蟲有特效，對其他種類的害蟲也有良好的防治效果。吡蟲啉是蔬菜種植過程中常用的農藥，對吡蟲啉殘留檢測成為國家對蔬菜類植物中農藥殘留監控的必要手段。日本規定吡蟲啉在蔬菜中的最高殘留限量(MRL)為0.5mg/kg。
[0003]現有技術對于吡蟲啉的檢測主要是高效液相色譜法等檢測方法，但這些技術的缺陷明顯:設備昂貴、操作復雜、難以推廣。所以，建立一種簡單、有效、適合基層使用的測定方法是極其必要的。本發明的目的是研制一種更適合企業進行現場檢測且快捷簡便、成本低廉的定性檢測方法。
【發明內容】
[0004]針對以上情況，本發明的目的就是為了克服現有技術存在的缺陷而提供一種吡蟲啉的免疫膠體金檢測卡及其制備方法，可有效解決能快速、簡便地檢測出吡蟲啉的問題。
[0005]本發明的吡蟲啉膠體金檢測卡，包括包被了單克隆抗體膠體金標記物的膠體金結合墊、包被了吡蟲啉-BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纖維素膜、樣品墊、吸水墊、PVC膠板和塑料模具組成，在PVC膠板的一端依次粘附樣品墊、結合墊，中間黏貼硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊。
[0006]本發明的吡蟲啉膠體金檢測卡的制備方法，是由以下步驟實現:
(1)膠體金溶液制備:取IL三角燒瓶I個,加入超純水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4.3H20) 5 mL，配制成500 mL 0.01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7.2H20)溶液5_7 mL，繼續攪拌加熱，當溶液的顏色完全變為透明的紫紅色時，維持5 min后停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存備用；
(2)抗體的預處理:將要標記的卩比蟲啉抗體在1000r/min, 4°C條件下,離心20 min,取上清，用0.01 mol/L PBS稀釋成I mg/mL ;或者用0.01 mol/L PBS稀釋成I mg/ml,過
0.22 Pm 濾膜；
(3)膠體金標記物的制備:取步驟⑴中的膠體金溶液40mL，用0.25 mol/L K2C03調節膠體金溶液pH至8.5,電磁攪拌器250 r/min攪拌,逐滴加入4 mL含0.3 mg抗體蛋白的蛋白溶液，反應10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA,繼續攪拌反應10 min ;金標抗體溶液常溫低速(1500 r/min)離心10 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4°C,12000 r/min離心20 min,棄上清,收集沉淀,將沉淀用金標抗體稀釋液定容至I mL,制備成吡蟲啉單克隆抗體膠體金標記物； (4)膠體金膜的制備:將步驟(3)吡蟲啉蛋白質偶聯物單克隆抗體膠體金標記物用劃膜儀以5 PL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含吡蟲啉蛋白質偶聯物單克隆抗體膠體金標記物的膠體金膜；
(5)包被膜制備:將羊抗鼠IgG抗體、吡蟲啉蛋白質偶聯物稀釋成Img/mL，用劃膜儀依次以I PL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上,制備成包被膜,370C包被2 h后，室溫自然晾干或者37°C烘干；
(6)樣品墊前處理:將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干；
(7)檢測卡的組裝:PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水棉，組裝成試紙條，切割成一定寬度的長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。
[0007]所述步驟(5)中所包被的檢測線T設在質控線C的下方；
所述步驟(6)中的樣品墊處理液是由I g小牛血清蛋白(BSA)和0.8 g氯化鈉(NaCl),用含有 0.5%TRIT0N-100 的 0.01 mol/L PBS 定容至 100 mL ；
本發明可有效用于測定吡蟲啉，方法簡單，方便、快捷，結果準確。
【附圖說明】
[0008]圖1為本發明吡蟲啉的免疫膠體金檢測卡的結構圖:圖中1.加樣孔 2.檢測線
3.質控線4.檢測孔5.試紙條6.檢測卡外殼。
[0009]圖2為本發明吡蟲啉的免疫膠體金檢測卡內的試紙條的剖視結構圖，圖中7.樣品墊8.膠體金結合墊9.PVC膠板10.硝酸纖維素膜11.吸水墊。
【具體實施方式】
[0010]實施例1
圖1、圖2所示的實施例:圖中9為PVC膠板；7為樣品墊；8為膠體金結合墊，該膠體金結合墊上包被了單克隆抗體膠體金標記物；10為包被膜，即硝酸纖維素膜，該硝酸纖維素膜上包被了吡蟲啉-BSA和羊抗鼠IgG ；11為吸水墊，由吸水材料如濾紙制成。
[0011]在PVC膠板9的一端上(樣品端)粘附樣品墊7、結合墊8，樣品墊7和結合墊8為并排結構。
[0012]在PVC膠板9的中間粘附硝酸纖維素膜10。在硝酸纖維素膜10上設置有羊抗鼠IgG質控線3和吡蟲啉-BSA檢測線2。
[0013]在PVC膠板9的另一端粘附吸水墊11。硝酸纖維素膜10的一端與結合墊8略交叉，另一端與吸水墊11略交叉。該試紙條5可裝入有塑料模具制成的檢測卡外殼6中，制成檢測卡，在檢測卡外殼6的上蓋上設有加樣孔I和檢測孔4，樣品墊7正對加樣孔1，硝酸纖維素膜10正對檢測孔4。
[0014]實施例2
吡蟲啉膠體金檢測卡制備，是由以下步驟具體實現:
膠體金溶液制備:取I L三角燒瓶I個,加入超純水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4.3H20) 5 mL，配制成500 mL 0.01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7.2H20)溶液5_7 mL，繼續攪拌加熱，當溶液的顏色完全變為透明的紫紅色時，維持5 min后停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存備用；抗體的預處理:將要標記的卩比蟲啉抗體在1000 r/min, 4°C條件下,離心20 min,取上清，用 0.01 mol/L PBS 稀釋成 I mg/mL ;或者用 0.01 mol/L PBS 稀釋成 I mg/ml,過 0.22濾膜；
膠體金標記物的制備:取步驟(I)中的膠體金溶液40 mL，用0.25 mol/L K2C03調節膠體金溶液pH至8.5,電磁攪拌器250 r/min攪拌,逐滴加入4 mL含0.3 mg抗體蛋白的蛋白溶液，反應10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA，繼續攪拌反應10 min ;金標抗體溶液常溫低速(1500 r/min)離心10 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4°C, 12000r/min離心20 min,棄上清,收集沉淀,將沉淀用金標抗體稀釋液定容至I mL,制備成卩比蟲啉單克隆抗體膠體金標記物；
膠體金膜的制備:將步驟(3)吡蟲啉蛋白質偶聯物單克隆抗體膠體金標記物用劃膜儀以5 PL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含吡蟲啉蛋白質偶聯物單克隆抗體膠體金標記物的膠體金膜；
包被膜制備:將羊抗鼠IgG抗體、吡蟲啉蛋白質偶聯物稀釋成I mg/mL，用劃膜儀依次以I KL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37°C包被2 h后，室溫自然晾干或者37°C烘干；
樣品墊前處理:將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干；
檢測卡的組裝:PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水棉，組裝成試紙條，切割成一定寬度長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。
【主權項】
1.吡蟲啉膠體金檢測卡，其特征在于按照下述步驟制備得到: (1)膠體金溶液制備:取IL三角燒瓶I個,加入超純水495 mL，而后加入1%氯金酸HAuCl4.3H20) 5 mL，配制成500 mL 0.01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉Na3C6H5O7.2H20溶液5_7 mL,繼續攪拌加熱，當溶液的顏色完全變為透明的紫紅色時，維持5 min后停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存備用； (2)抗體的預處理:將要標記的卩比蟲啉抗體在1000r/min, 4°C條件下,離心20 min,取上清，用 0.01 mol/L PBS稀釋成 I mg/mL ;或者用 0.01 mol/L PBS稀釋成 I mg/ml,過0.22 濾膜； (3)膠體金標記物的制備:取步驟(I)中的膠體金溶液40mL，用0.25 mol/L K2CO3調節膠體金溶液pH至8.5,電磁攪拌器250 r/min攪拌,逐滴加入4 mL含0.3 mg抗體蛋白的蛋白溶液，反應10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA,繼續攪拌反應10 min ;金標抗體溶液常溫1500 r/min離心10 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4°C, 12000 r/min離心20 min,棄上清,收集沉淀,將沉淀用金標抗體稀釋液定容至I mL,制備成批蟲啉單克隆抗體膠體金標記物； (4)膠體金膜的制備:將步驟(3)吡蟲啉蛋白質偶聯物單克隆抗體膠體金標記物用劃膜儀以5 PL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含吡蟲啉蛋白質偶聯物單克隆抗體膠體金標記物的膠體金膜； (5)包被膜制備:將羊抗鼠IgG抗體、吡蟲啉蛋白質偶聯物稀釋成Img/mL，用劃膜儀依次以I PL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上,制備成包被膜,370C包被2 h后，室溫自然晾干或者37°C烘干； (6)樣品墊前處理:將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干； (7)檢測卡的組裝:PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水棉，組裝成試紙條，切割成一定寬度的長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。2.根據權利要求1所述的吡蟲啉膠體金檢測卡，其特征在于所述步驟(5)中所包被的檢測線T設在質控線C的下方； 所述步驟(6)中的樣品墊處理液是由I g小牛血清蛋白(BSA)和0.8 g氯化鈉(NaCl),用含有 0.5%TRIT0N-100 的 0.01 mol/L PBS 定容至 100 mL。
【專利摘要】本發明吡蟲啉的免疫膠體金檢測卡及其制備方法，涉及動物源食品獸藥殘留檢測技術領域。本發明的檢測卡外殼中的試紙條，由PVC膠板、樣品墊、膠體金結合墊、包被膜和吸水墊組成；膠體金膜為含吡蟲啉單克隆抗體的玻璃纖維素膜，包被膜是硝酸纖維素膜，其上設有T線和C線，T線包被有吡蟲啉蛋白質偶聯物，C線包被有羊抗鼠IgG抗體。本發明有效用于快速檢測吡蟲啉，方便、快捷、結果準確。
【IPC分類】G01N33/577
【公開號】CN105572372
【申請號】CN201410551751
【發明人】洪霞, 杜霞, 劉靜
【申請人】南京億特生物科技有限公司
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2014年10月17日