一種檢測雞肉組織中的氯霉素的熒光分析法
【技術領域】
[0001]一種檢測氯霉素(CAP)的試劑盒及其檢測方法，屬于時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)技術領域，用于雞肉組織樣品中氯霉素的含量檢測。
【背景技術】
[0002]氯霉素是一種廣譜抗生素，常用于動物各種傳染病的治療，對于多種病原菌有較強的抑制作用。氯霉素存在嚴重的副作用，能抑制人體骨髓造血功能，引起人類的再生障礙性貧血等疾病，因此動物食品中的氯霉素殘留對人類的健康構成巨大威脅。
[0003]目前有關動物源性食品中氯霉素及其代謝物的測定方法主要為理化檢測法，如用化學分析法測定雞肉組織中的氯霉素殘留量，檢出限為0.01 ug/kg，用高效液相色譜法測定雞肉中的氯霉素殘留量，檢出限為0.01 ug/kg。但這些方法儀器設備昂貴，操作復雜，靈敏度低，且不適用于大批量樣品的檢測，無法滿足國內食品安全檢測市場的迫切需要。而時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)由于其特異性強、靈敏度高、操作簡便、廉價，且特別適于大批量樣品的檢測等優點而越來越被人們所重視和采用。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種檢測CAP的試劑盒及其檢測方法，用于水產品樣品中氯霉素含量的檢測。本發明主要采用時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)檢測CAP。技術方案:該檢測CAP的試劑盒是由:⑴96或48孔包被板；⑵緩沖液；(3)氯霉素標準；(4)氯霉素的抗體凍干品；(5)銪標記的羊抗鼠抗體；(6)洗滌液；(7)增強液所組成。
[0005]本發明測定方法:測定的基礎是標記免疫反應。包被有CAP-OVA的微孔板，加入CAP標準或已處理好的樣品到各自的微孔中，再加入CAP抗體，振蕩反應，游離的CAP與微孔板上的CAP-OVA競爭CAP抗體，洗滌液洗滌，沒有連接的CAP抗體在洗滌步驟中被除去。加入Eu3 + -羊抗鼠抗體，進行標記免疫反應，再用洗滌液洗滌，反應后沒有連接的Eu3 + -羊抗鼠抗體在洗滌步驟中被除去。加增強液振蕩后，在紫外光的激發下發射很強的熒光，用時間分辨熒光儀測定其熒光強度cps，熒光強度與樣品中的濃度成反比，對照標準曲線即可確定樣品中抗原的量。
【附圖說明】
[0006]圖1 CAP-TRFIA反應示意圖。
[0007]圖2 CAP-TRFIA標準曲線圖。
[0008]圖3檢測氯霉素的試劑盒示意圖:(1)96或48孔包被板，⑵緩沖液，(3)氯霉素標準，(4))氯霉素的抗體凍干品，(5)銪標記的羊抗鼠抗體，(6)洗滌液，(7)增強液。
具體實施方案
[0009]實施例1 按下列步驟制備試劑盒和檢測雞肉組織樣品:
(I)Eu3 + -羊抗鼠抗體的制備:
取溶解于50mmol/LPBS pH7.0的5g/L羊抗鼠抗體1.2ml，經TO-1O柱轉換緩沖條件，洗脫液為含0.155mol/LNaCl的50mmol/LNa2C03-NaHC03pH8.5緩沖液。收集蛋白峰，經紫外吸收分析定量(1.46A280-0.74A260)，用上述洗脫液稀釋羊抗鼠抗體至2g/L。取500-1000 μ I稀釋后的羊抗鼠抗體加入含0.2-0.4mg的Eu3 + -N2_[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3 + -DTTA)的小瓶中，30°C磁力攪拌反應20小時。反應液經用80mmol/L Tris-HCl ρΗ7.8緩沖液平衡的S印harose CL-6B柱(I X 40cm)層析，A280監測收集蛋白峰，稀釋分裝備用。
[0010](2)包被板固相抗原制備:
將 CAP-OVA 用 50mmol/L Na2C03-NaHC03 pH9.6 緩沖液稀釋至 5mg/L 的包被液，96 (或48)孔微孔板各孔加100μ 1，4°C放置過夜。棄去包被液，沖洗兩次，加150μ I含3g/LBSA的上述緩沖液封閉，4°C放置過夜。棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置_20°C冷凍保存。
[0011](3)試劑的配制:
A.標準氣霉素(CAP): (Ong/ml,0.025ng/ml,0.05ng/ml,0.lng/ml,0.3ng/ml,0.6ng/ml)，從CAP純品中稀釋得到，稀釋液為甲醇:水=7: 3 ；
B.緩沖液:8mmol/LNaCl、0.1 % BSA、0.2 % 牛 IgG、50 μ mol/L 二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、0.lml/LTween-80 和 0.1% NaN3 的 Tris-HCl ρΗ7.8 ；
C.洗滌液:14.5mmol/L NaCl.0.2ml/LTween_80 和 0.2% NaN3 的 50mmol/L Tris-HClρΗ7.8 ；
D.增強液的配制:1升PH3.2鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液含15μπι01β-萘甲酰三氟丙酮(β -ΝΤΑ), 50 μ mo I 三正辛基氧化膦(Τ0Ρ0)，Iml 曲拉通 X-100 (Triton X-100)。
[0012](4)試劑盒提供的試劑:
每一個盒中的試劑足夠進行96個測量，盒中的材料如下:
A.1X96孔板(8條X 12孔，可以拆分為單孔)包被有CAP-OVA ；
B.6XCAP 標準液，1.0ml/ 瓶，標準液濃度為:(0ng/ml,0.025ng/ml,0.05ng/ml,0.lng/ml,0.3ng/ml,0.6ng/ml)；
C.1 X CAP抗體凍干品，用時0.5ml蒸餾水溶解；
D.1XEu3 + -羊抗鼠抗體凍干品，用時0.5ml蒸餾水溶解；
E.1X 增強液:15ml ；
F.1X洗滌液:30ml，用時以蒸餾水1: 25稀釋；
G.1X 緩沖液:30mlο
[0013](5)測定之前注意事項:
A.使用之前將所有試劑回升至室溫(18-30°C)；
B.使用之后立即將所有試劑放回2-8°C；
C.如果樣品量大建議使用多通道移液器；
D.在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋子蓋住微孔；
E.取出需用數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放進原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于2-8°C。
[0014](6)具體檢測步驟如下:
取CAP-OVA板條，加入50 μ I的CAP標準或處理好的樣品到各自的微孔中，每個標準和樣品必須使用新的吸頭，加緩沖液1: 5000稀釋的CAP抗體50 μ 1，移液器管尖千萬不要接觸到放進孔中的液體，37 °C振蕩I小時，洗滌液洗四次，加緩沖液1: 400稀釋的Eu3 + -羊抗鼠抗體100 μ 1，37°C振蕩45分鐘，用洗滌液洗六次，加200 μ I增強液振蕩5分鐘后測量。從標準曲線計算樣品中的CAP含量，和圖2，該例的樣品濃度0.15ng/ml。
[0015]實施例2
按下列步驟制備試劑盒和檢測豬肉樣品:
(1)制備試劑盒同實施例1的(1Γ(5)；
(2)具體檢測步驟如下:
取備好的雞肉樣品5.0Og,經勻漿機破碎，依次加入1mL乙酸乙酯和1.0mL 1.0mol/LNaOH 溶液，以 12000r/min 均質 Imin,靜置 0.5h 后 3000r/min 離心 5min,取 5mL 上清液，用1.0mol/LHCl調pH至7.0后備用。
[0016]取CAP-OVA板條，加入50 μ I的CAP標準或處理好的樣品到各自的微孔中，每個標準和樣品必須使用新的吸頭，加緩沖液1: 5000稀釋的CAP抗體50 μ 1，移液器管尖千萬不要接觸到放進孔中的液體，37 °C振蕩I小時，洗滌液洗四次，加緩沖液1: 400稀釋的Eu3 + -羊抗鼠抗體100μ 1，37°C振蕩45分鐘，用洗滌液洗4次，加200 μ I增強液振蕩5分鐘后測量。從標準曲線計算樣品中的CAP含量，如圖2為CAP標準曲線圖。
【主權項】
1.一種檢測氯霉素(CAP)的時間分辨熒光免疫分析法試劑盒，其特征是:(1)96或48孔包被板；(2)緩沖液；(3)氯霉素標準；(4)氯霉素的抗體凍干品；(5)銪標記的羊抗鼠抗體;(6)洗滌液；(7)增強液所組成。2.一種用權利要求1所述的試劑盒氯霉素的方法，其特征是取包被有CAP-OVA的微孔包被板，加入CAP標準或處理好的樣品到各自的微孔中，再加入CAP抗體，振蕩反應，洗滌液洗滌，加銪標記的羊抗鼠抗體，進行標記免疫反應，洗滌液洗滌，加增強液振蕩后測量熒光強度cps，對照標準曲線計算樣品中的CAP含量。3.根據權利要求2所述的檢測氯霉素的方法，其操作為:取包被有CAP-OVA的微孔包被板，加入50 μ L的CAP標準或處理好的樣品到各自的微孔中，加50 μ I以緩沖液⑵稀釋的CAP抗體，25°C振蕩I小時，洗滌液洗三次，加以緩沖液(2)稀釋的100 μ L Eu3 + -羊抗鼠抗體，25°C振蕩0.5小時，用洗滌液洗六次，加200 μ I增強液振蕩5分鐘后測量熒光強度cps，從標準曲線計算樣品中的CAP含量。
【專利摘要】一種檢測氯霉素的試劑盒及其檢測方法，屬于時間分辨熒光免疫分析（TRFIR）技術領域。本發明配制的試劑盒，采用TRFIR檢測氯霉素，測定的基礎是標記免疫反應。微孔板包被有CAP－OVA，加入CAP標準或樣品，再加入CAP抗體。游離的CAP與微孔板上的CAP－OVA競爭CAP抗體，沒有連接的CAP抗體被洗滌除去，加入Eu3＋－羊抗鼠抗體，標記免疫反應后沒有連接的Eu3＋－羊抗鼠抗體被洗滌除去。加增強液后，用時間分辨熒光儀測定其熒光強度cps，熒光強度與樣品中的CAP濃度成反比，對照標準曲線即可確定被測樣品中CAP的含量。本發明提供的檢測CAP試劑盒結構簡單，使用方便、廉價、靈敏度高，操作時間大幅度減少；可用作檢測雞肉組織中氯霉素殘留檢測。
【IPC分類】G01N33/533
【公開號】CN105572338
【申請號】CN201410536948
【發明人】洪霞, 薛永來, 江振飛
【申請人】江蘇維賽科技生物發展有限公司
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2014年10月13日