一種同時測定山楂中蘆丁和槲皮素含量的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于檢測分析技術領域，涉及化學物質的高效液相色譜法，特別涉及一種 同時測定山楂中蘆丁和槲皮素含量的方法。
【背景技術】
[0002] 山楂為薔薇科植物山里紅（Crateguspinnatif idaBge · var ·ma jorN·E · Br ·)或山楂 (CrateguspinnatifidaBge.)的干燥成熟果實。味酸、甘，性微溫，歸脾、胃、肝經;具有消食 健胃、行氣散瘀、化濁降脂的功效，用于肉食積滯、胃脘脹滿、瀉痢腹痛、瘀血經閉、產后瘀 阻、心腹刺痛、胸痹心痛、疝氣疼痛、高脂血癥（國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一 部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010:29-30)。山楂中主要含有黃酮類、有機酸類化學 成分，其中黃酮類化合物含量較高，包括牡荊素、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、槲皮素、蘆丁 等。現代藥理活性研究表明山楂中黃酮類成分具有降壓、降血脂、治療高脂血癥急性壞死性 胰腺炎以及抗氧化的作用，并且廣泛應用于臨床(李敏，霍燕燕，劉梅，等.山楂總黃酮提取 及其抗氧化作用[J].光譜實驗室，2013，30(6) :3145-3148)。臨床研究驗證山楂黃酮提取物 具有抗癌作用(柳嘉，DavidGlenPOPOVICH，景浩.山楂黃酮提取物的抗氧化活性和對癌細胞 生長抑制作用[J].食品科學，2010,31(3) :220-223)，對預防心肌缺血也有較好作用(周玲， 鄧琳，趙浞.山楂總黃酮抗心肌缺血作用及機制[J].中國生化藥物雜志，2011，32(6):475-477)。
[0003] 鑒于山楂中蘆丁和槲皮素的藥用范圍非常廣泛，為了有效地評價山楂及其相應制 劑的質量，有必要研究并開發一種同時測定山楂中蘆丁和槲皮素含量的方法。
【發明內容】
[0004] 本發明人通過大量試驗研究并摸索，最終建立了一種可同時測定山楂中蘆丁和槲 皮素含量的高效液相色譜法，該法測定快速、簡單，準確性高、重現性好，填補了現有技術的 空白。
[0005] 因此，本發明的目的在于提供一種同時測定山楂中蘆丁和槲皮素含量的方法。具 體地，本發明的目的是這樣實現的：
[0006] -種同時測定山楂中蘆丁和槲皮素含量的方法，采用高效液相色譜法，以流動相A 和流動相B進行梯度洗脫，按體積比計流動相的梯度設置如下：
L0008J 所述的流動相A為甲醇，所述的流動相B為磷酸水浴液，所述的磷酸水浴液的質量 分數為0.4%~0.8%。
[0009]進一步地優選地，如上所述同時測定山楂中蘆丁和槲皮素含量的方法，按體積比 計流動相的梯度設置如下：
L0011J 所述的磷酸水浴液的質量分數為〇. 5%。
[0012] 進一步地優選地，如上所述同時測定山楂中蘆丁和槲皮素含量的方法，其中所述 高效液相色譜法的色譜柱選用AgiLentEcLipseXDB_C18柱(250mm X 4.6mm，5μηι)。
[0013] 進一步地優選地，如上所述同時測定山楂中蘆丁和槲皮素含量的方法，其中所述 高效液相色譜法的檢測波長為330-350nm。
[0014] 進一步地優選地，如上所述同時測定山楂中蘆丁和槲皮素含量的方法，其中所述 高效液相色譜法的檢測波長為340nm。
[0015] 進一步地優選地，如上所述同時測定山楂中蘆丁和槲皮素含量的方法，其中所述 高效液相色譜法的的流速為1. OmL/min，柱溫為30°C。
[0016] 在本發明的一個最優選的實施例中，如上所述同時測定山楂中蘆丁和槲皮素含量 的方法，其中所述高效液相色譜法的色譜柱選用AgiLentEcLipseXDB-C18柱（250mmX 4.6mm，5μηι)，檢測波長為340nm，流速為1. OmL/min，柱溫為30°C，按體積比計流動相的梯度 設置如下：
[0018] 所述的流動相A為甲醇，所述的流動相B為0.5%質量分數的磷酸水溶液。
[0019] 與現有技術相比，本發明方法簡單、準確性高、重復性好，可用于同時測定山楂中 蘆丁和槲皮素的含量，為山楂飲片及其相關制劑的質量評價和含量檢測提供了快速、準確 的方法。
【具體實施方式】
[0020] 以下通過實施例形式，對本發明涉及的檢測方法作進一步的詳細說明，但不應將 此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例，凡基于本發明上述內容所實現的技術 均屬于本發明的范圍。
[0021] 山楂飲片主要含有黃酮及其苷類成分，本文選擇黃酮類活性成分蘆丁和槲皮素進 行試驗，建立用HPLC同時測定山楂中蘆丁和槲皮素含量的方法。采用甲醇-0.5%磷酸水溶 液梯度洗脫，出峰較快，精密度、準確度及重復性均良好，為山楂中蘆丁和槲皮素的質量評 價提供了 一個可行方法。具體實施如下：
[0022] (1)蘆丁對照品溶液的制備
[0023]稱取蘆丁對照品6. Omg，精密稱定6 . lmg，置2mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻 度，搖勻，即得每lmL含3.05mg的蘆丁對照品溶液。
[0024] (2)槲皮素對照品溶液的制備
[0025]稱取槲皮素對照品5 . Omg，精密稱定4.8mg，置2mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至 刻度，搖勻，即得每lmL含2.4mg的槲皮素對照品溶液。
[0026] (3)混合對照品溶液的制備
[0027] 精密吸取蘆丁對照品溶液lmL、槲皮素對照品溶液lmL于10mL容量瓶中，用甲醇溶 液稀釋至刻度，即得2種組分的混合對照品溶液(含蘆丁濃度為305yg/mL，槲皮素濃度為240 yg/mL)，5°C冷藏保存備用。
[0028] (4)供試品溶液的制備
[0029]取山楂粗粉（過3號篩）約2. Og，置于錐形瓶中，加入50mL甲醇，稱重。超聲提取 40min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。取續濾液，0.45μπι微孔濾膜 過濾，即得供試品溶液。
[0030] (5)色譜條件
[0031 ]色譜柱為AgiLentEcLipseXDB-C18柱（250mmX4·6mm，5μm);流動相:A相為甲醇， Β相為0.5 %磷酸水溶液，洗脫梯度:0~15min，甲醇-0.5 %磷酸水(20:80); 16~25min甲醇-0 · 5%磷酸水(40:60);檢測波長:340nm;流速1 · Oml/min;柱溫:30°C;進樣量:20yL。
[0032]以供試品溶液為樣品，按照上述色譜條件進行分析，取20yL進樣，結果蘆丁在 5.2min時達到最大洗脫峰，槲皮素在15.6min時達到最大洗脫峰，出峰時間在25min內，且兩 峰出峰時間分布均勻，分離度好。
[0033] (6)線性關系考察
[0034] 精密吸取混合對照品溶液0 · 1、0 · 2、0 · 4、0 · 6、0 · 8、1 · OmL，分別置于20mL容量瓶中 以甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成不同濃度的對照品溶液，按照步驟(5)的色譜條件進行分析， 分別取20yL進樣，記錄蘆丁和槲皮素的色譜峰面積，結果見表1。以對照品溶液濃度(X)為橫 坐標，峰面積為縱坐標(Y)，進行線性回歸，得回歸方程，結果見表2。
[0035] 表1線性關系考察試驗
[0036]
[0037] 表2標準曲線和線性范圍
[0038]
[0039] (7)精密度試驗
[0040] 精密吸取混合對照品溶液20yL，按步驟(5)的色譜條件平行測定6次，測得蘆丁和 槲皮素的峰面積，見表3，結果表明，儀器進樣精密度良好。
[0041] 表3精密度試驗(n = 6)
[0042]
[0043] (8)重復性試驗
[0044] 精密稱取同一批次的供試品6份，分別按上述步驟(4)供試品溶液制備方法制備， 測定蘆丁和槲皮素的峰面積，見表4,結果證明，此方法重復性良好。
[0045] 表4重復性試驗(n = 6)
[0046]
[0047] (9)穩定性試驗
[0048]精密吸取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、121!進樣測定峰面積。測得蘆丁和槲 皮素的峰面積，見表5,結果表明，供試品溶液在室溫下12h內穩定。
[0049] 表5穩定性試驗(n = 6)
[0050]
[0051] (10)加樣回收率試驗
[0052]分別精密稱定已知含量的山楂飲片粉末（含蘆丁 0.139mg/g，槲皮素0.078mg/g) (過3號篩)6份，各加入適量的對照品，按步驟(4)方法制備供試品溶液，按步驟(5)的色譜條 件分別進樣分析，測定峰面積，計算平均加樣回收率和RSD，結果見表6、表7。
[0053] 表6蘆丁加樣回收率試驗(n = 6)
[0054]
[0055] 表7槲皮素加樣回收率試驗(η = 6)
[0056]
[0057] (11)樣品含量測定
[0058]精密稱取山楂飲片樣品6批，按步驟(4)方法制備供試品溶液，按照步驟(5)的色譜 條件進行測定。記錄蘆丁和槲皮素的色譜峰面積，根據峰面積積分值，采用外標法計算出各 組分的含量，結果見表8。
[0059] 表8山楂飲片中蘆丁和槲皮素的含量測定(η = 6)
[0060]
[0061]
[0062]需要說明的是，本發明在前期的試驗中考察流動相系統及比例（甲醇-水、甲醇-0.5 %磷酸水、甲醇-0.1 %磷酸水系統），結果表明甲醇-水(30:70)、甲醇-0.1 %磷酸水(40: 60)等度洗脫效果均不好，出峰時間均大于30min。另外，流動相梯度的選擇試驗中，發明人 曾考察了0~2011^11甲醇-0.5%磷酸水（25:75)，20~3011^11甲醇-0.5%磷酸水（30:70) ;0-20min甲醇-0.5%磷酸水（22:78)，20~3011^11甲醇-磷酸水（35:65);0-1511^11甲醇-0.5%磷 酸水(20:80)，15-25min甲醇-0.5 %磷酸水(40:60);結果表明以甲醇-0.5 %磷酸水進行梯 度洗脫，0~15min，甲醇-0 · 5 %磷酸水(20:80); 16~25min甲醇-0 · 5 %磷酸水(40:60)，在流 速1 .OmL/min的情況下，梯度洗脫，出峰時間在25min內，且兩峰出峰時間分布均勻，分離度 好。
【主權項】
1. 一種同時測定山植中蘆下和搬皮素含量的方法，其特征在于，采用高效液相色譜法， W流動相A和流動相B進行梯度洗脫，按體積比計流動相的梯度設置如下：'^所述的流動相為甲醇，所述的流動相B為憐酸水溶液，所述的憐酸水溶液的質量分數為I 0.4% ~0.8%。2. 根據權利要求1所述同時測定山植中蘆下和搬皮素含量的方法，其特征在于，按體積 比計流動相的梯度設置如下：所述的憐酸水溶液的質量分數為0.5 %。3. 根據權利要求1所述同時測定山植中蘆下和搬皮素含量的方法，其特征在于，所述高 效液相色譜法的色譜柱選用AgiLent EcLipse XDB-C18柱(250mmX4.6mm，5皿）。4. 根據權利要求1所述同時測定山植中蘆下和搬皮素含量的方法，其特征在于，所述高 效液相色譜法的檢測波長為330-350nm。5. 根據權利要求4所述同時測定山植中蘆下和搬皮素含量的方法，其特征在于，所述高 效液相色譜法的檢測波長為340nm。6. 根據權利要求1所述同時測定山植中蘆下和搬皮素含量的方法，其特征在于，所述高 效液相色譜法的的流速為1. OmL/min，柱溫為30°C。
【專利摘要】本發明提供了一種同時測定山楂中蘆丁和槲皮素含量的方法，采用高效液相色譜法，以流動相A和流動相B進行梯度洗脫，所述的流動相A為甲醇，所述的流動相B為磷酸水溶液，所述的磷酸水溶液的質量分數為0.4％～0.8％。本發明方法簡單、準確性高、重復性好，可用于同時測定山楂中蘆丁和槲皮素的含量，為山楂飲片及其相關制劑的質量評價和含量檢測提供了快速、準確的方法。
【IPC分類】G01N30/02
【公開號】CN105548380
【申請號】CN201510902345
【發明人】段占娥, 趙雪梅
【申請人】段占娥
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2015年12月8日