一種毛細管電泳檢測凝血酶濃度的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物分析領域，具體涉及一種毛細管電泳檢測凝血酶濃度的方法。
【背景技術】
[0002]檢測凝血酶濃度的常用方法有發色底物法、熒光法和Raleigh光散射法等，但這些方法操作繁瑣、耗費樣品多，在微量樣品的檢測方面有很大的局限性。
[0003]熒光染料是一種可吸收紫外線或可見光并將其由短波長轉化為較長波長的可見光并反射出來，可用肉眼看見其反射出來的明亮色彩。熒光染料由于其靈敏度高，操作方便，逐漸取代了放射性同位素作為檢測標記，其廣泛應用于熒光探針，細胞染色，特異性DNA染色等。
[0004]近年來，一些研究小組已經開展了基于凝血酶的生物檢測分析。Mc-Grown等將YOYO染料嵌入到15個堿基的凝血酶核酸適配體中，并考察其在凝血酶作用下熒光性質的改變。
[0005]另一方面，毛細管電泳作為一種高分辨率、高靈敏、高通量及低樣品消耗的微分離技術，在生物分析領域具有廣闊的應用前景。同時，通過將熒光檢測與毛細管電泳相結合，大大提高了檢測限，拓展了毛細管電泳的應用。
【發明內容】
[0006]本發明要解決的技術問題是:現有技術中尚無良好簡單便捷檢測凝血酶濃度的方法，提供了一種毛細管電泳檢測凝血酶濃度的方法。
[0007]為解決上述技術問題，本方法利用帶有熒光染料的DNA序列FAM-F29形成G-四鏈體與凝血酶結合，通過毛細管電泳分析檢測，并計算復合物的峰面積在毛細管電泳中所占的電泳峰面積之比，繪制峰面積之比與凝血酶濃度的曲線，從而實現凝血酶濃度的檢測。
[0008]本發明所采用的技術方案為，一種毛細管電泳檢測凝血酶濃度的方法，其步驟如下:
[0009](I)選取帶有熒光染料的DNA序列FAM-F29 ；
[0010](2)將步驟(I)所述的FAM-F29在一定濃度的Na+、K+鹽溶液中反應24小時，得到G-四鏈體結構的DNA熒光探針溶液；
[0011](3)將粉末狀的凝血酶溶解于Tris-HCl緩沖溶液中，稀釋成不同濃度的凝血酶溶液；
[0012](4)將步驟(2)所述的G-四鏈體結構的DNA熒光探針溶液與步驟(3)所述的凝血酶溶液混合，得到凝血酶與G-四鏈體結構的DNA熒光探針復合物；
[0013](5)熒光毛細管電泳檢測:將步驟(4)所述的復合物用熒光毛細管電泳檢測，測定復合物通過檢測通道的峰面積與總的DNA通過檢測通道的峰面積之比，進行線性擬合，繪制峰面積比一濃度的標準曲線，對照標準曲線確定待測樣品中凝血酶濃度。
[0014]進一步地，步驟(I)所述的熒光染料為6-FAM，5-FAM，TMRA，ATT0-590中的一種。
[0015]更進一步地，步驟(I)所述熒光染料中DNA序列為5’-AGT CCG TGG TAG GGC AGGTTA GGG TGA CT-3’
[0016]作為優選，步驟(2)所述的在形成G-四鏈體結構中所用的Na+、K+的濃度均為5mM。
[0017]采用上述的技術方案后，本發明所取得的有益效果是:本發明提供的一種毛細管電泳檢測凝血酶濃度的方法，操作簡單，可重復性高，能方便快捷的檢測出樣品中凝血酶濃度，進一步拓展了熒光探針在生物分析領域的應用。
【附圖說明】
[0018]圖1:G_四鏈體結構的DNA熒光探針與不同濃度凝血酶電泳圖(A:G_四鏈體結構的DNA熒光探針的峰、B:G-四鏈體結構的DNA熒光探針與凝血酶復合物的峰;a: G-四鏈體結構的DNA熒光探針、b-e:不同濃度比的G-四鏈體結構的DNA熒光探針與凝血酶的復合物)。
[0019]圖2:G_四鏈體結構的DNA熒光探針與不同濃度的凝血酶在毛細管電泳檢測通道的峰面積比的擬合曲線。
【具體實施方式】
[0020]本發明將就以下實施例作進一步說明，但應了解的是，這些實施例僅為例示說明之用，而不應被解釋為本發明實施的限制。
[0021]實施例1
[0022]1、G-四鏈體結構的形成
[0023]將FAM-F29先用8000rpm離心機離心2-3min，加入pH為7.4，濃度50mMTris-HCl緩沖溶液35yL，使其最終濃度為ΙΟΟμΜ，然后用TBE緩沖溶液稀釋到所需的濃度，取2yL稀釋后的FAM-F29溶液，加入等體積的NaCl溶液，反應12小時。隨后在上述混合溶液中加入4yL的KCl溶液，反應12小時，確保G-四鏈體結構的DNA熒光探針的最終濃度為2μΜ，NaC I的最終濃度為5mM，KCl的最終濃度為5mM。
[0024]2、稱取粉末狀的凝血酶1.2mg，溶解于32yL，濃度為50mM Tris-HCl(pH 7.4)緩沖溶液中，得到濃度為ΙΟμΜ的凝血酶溶液，然后根據需要稀釋成不同濃度。
[0025]3、取一定體積的上述G-四鏈體結構的DNA熒光探針溶液與等體積的不同濃度凝血酶混合，在37°C恒溫水浴下混合不同時間，得到凝血酶與G-四鏈體結構的DNA熒光探針復合物。
[0026]4、熒光毛細管電泳檢測
[0027]將上述不同濃度比的復合物用熒光毛細管電泳檢測。在一定時間范圍內，隨著凝血酶濃度的增加，復合物的峰逐漸增加(圖1)。計算復合物與總峰面積(Sc^plex與STcltaI )，計算峰面積比(Scompiex/STotai)(圖2)，進行擬合，得出標準曲線y = 0.468-0.488/(1+exp ((X-3.05)/0.929)0
[0028]方程式中^為凝血酶濃度，7為5。。_1(?/31'。1；￡11;
[0029]5、將待測樣品進行毛細管電泳檢測，計算5。_1(^/5^31的值為0.316，代入標準曲線，計算出凝血酶的濃度為3.787μΜ。
[0030]實施例2
[0031]將FAM-F29用TMRA標記，其他步驟同實施例1。
[0032]計算3。_(?/3^1的值為0.309，代入標準曲線，計算出凝血酶的濃度為3.726μΜ。
[0033]以上述依據本發明的理想實施例為啟示，通過上述的說明內容，相關工作人員完全可以在不偏離本項發明技術思想的范圍內，進行多樣的變更及修改。本項發明的技術性范圍并不局限于說明書上的內容，必須要根據權利要求范圍來確定其技術范圍。
【主權項】
1.一種毛細管電泳檢測凝血酶濃度的方法，其特征在于，所述檢測步驟如下: (1)選取帶有熒光染料的DNA序列FAM-F29; (2)將步驟(I)所述的FAM-F29在5mM濃度的Na+、K+鹽溶液下反應24小時，得到G-四鏈體結構的DNA熒光探針溶液； (3)將粉末狀的凝血酶溶解于Tris-HCl緩沖溶液中，稀釋成不同濃度的凝血酶溶液； (4)將步驟(2)所述的G-四鏈體結構的DNA熒光探針溶液與步驟(3)所述的凝血酶溶液混合，得到凝血酶與G-四鏈體結構的DNA熒光探針復合物； (5)熒光毛細管電泳檢測:將步驟(4)所述的復合物用熒光毛細管電泳檢測，測定復合物通過檢測通道峰面積與總的DNA通過檢測通道的峰值面積之比，進行線性擬合，繪制峰面積比一濃度的標準曲線，對照標準曲線確定待測樣品中凝血酶濃度。2.如權利要求1所述的一種毛細管電泳檢測凝血酶濃度的方法，其特征在于，步驟(I)所述的熒光染料為6-FAM，5-FAM，TAMRA，ΑΤΤ0-590中的一種。3.如權利要求1所述的一種毛細管電泳檢測凝血酶濃度的方法，其特征在于，步驟(I)所述熒光探針中DNA序列為5’-AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTA GGG TGA CT-3’。
【專利摘要】本發明屬于生物分析領域，涉及一種毛細管電泳檢測凝血酶濃度的方法，步驟如下，(1)設計5’端偶聯熒光染料的DNA，形成含有G‐四鏈體結構的DNA熒光探針；(2)將含G‐四鏈體結構的DNA熒光探針與凝血酶混合，經熒光毛細管電泳檢測，計算峰面積比(Scomplex/STotal)，擬合得到峰面積比—濃度標準曲線，對照標準曲線計算待測樣品中凝血酶濃度。采用上述技術方案提供的毛細管電泳檢測凝血酶濃度的方法，操作簡單，可重復性高，能方便快捷的檢測出樣品中凝血酶的濃度，進一步拓展了DNA熒光探針在生物分析領域的應用。
【IPC分類】G01N27/447, G01N21/64
【公開號】CN105548323
【申請號】CN201610060354
【發明人】王建浩, 顧亞琴, 柳麗, 丁淑敏, 付敏麗, 吳昊, 邱琳, 蔣鵬舉
【申請人】常州大學
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2016年1月28日