微藻蛋白質的納米金測試方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用納米金測試微藻蛋白質的蛋白質分析檢測領域。
【背景技術】
[0002]近年來，納米金粒子具有制備簡單、化學性質穩定、可實現重復，，因此得到了國內外廣泛關注。金納米材料的光學性質與顆粒的形狀和尺寸有非常大的關系，是研究的最早的金屬納米材料之一。納米金性質穩定，在紫外一可見光區出現強而穩定的表面等離子體共振吸收峰，最大吸收峰的位置和半峰寬對粒子形狀、粒子間距離、溶液介電常數和溫度等因素反應敏感，廣泛用于分析識別檢測。其中，金納米棒(GNRs)具有兩個共振峰帶，橫帶約520-600 nm，在近紅外區域的縱向條帶，通過控制納米棒的縱橫比可精確的調諧波長。
[0003]目前，納米金為作用基的生物探針研究已經很多，由于其具有量子效應、宏觀量子隧道效應、表面效應、良好的生物相容性和獨特的光學性能，能與多種生物大分子結合如核酸、重金屬離子、特別是蛋白質等且不影響其生物活性，具有優良的生物相容性。納米金與蛋白質的相互結合，是由于納米金表面帶有較多的電荷，當蛋白質在PH值等于或稍大于蛋白質等電點時，蛋白質呈電中性，此時蛋白質與金納米相互之間的靜電作用較小，但蛋白質分子的表面張力卻很大，處于微弱的水化狀態，較易吸附于納米金顆粒的表面。由于蛋白質分子牢固地結合在金顆粒表面，形成一個蛋白層，阻止了納米金顆粒的相互接觸，使納米金處于穩定狀態。納米金對蛋白質等生物大分子有很強的吸附作用，并且這種吸附作用不會使其變性，因此有很好的應用前景。
[0004]蛋白質作為一種生物大分子，是生命的物質基礎，是構成細胞的基本有機物，是生命活動的主要承擔者，因此，蛋白質的檢測在臨床醫學及生物化學中具有十分重要的意義。傳統的蛋白質分析檢測方法主要有凱式定氮法、考馬斯亮藍法、分光光度法、化學發光法、近紅外反射光譜法、雙縮脲法等，但這些分析方法大都存在靈敏度較低、選擇性差、穩定性弱及操作繁瑣費時等局限。文獻調查中，我們發現熒光光譜法是最常用的。幾乎所有的蛋白質都有熒光的氨基酸，色氨酸和酪氨酸，當熒光色氨酸或酪氨酸與金納米粒子相互作用時，色氨酸或酪氨酸的熒光特性將會改變。這些變化可能發生發射波長紅移或藍移，熒光猝滅或增強。這種變化已被用來確定金納米粒子與蛋白質定量的結合親和力和結合常數。蛋白質與金納米粒子通過靜電引力和疏水作用力等形成締合納米微粒，使得體系中出現特征熒光散射峰，從而使締合納米微粒體系的熒光散射信號大大增強。眾所周知，在600-1500nm的范圍中，金納米棒有著強烈的等離子體增強效應。根據熒光散射強度和蛋白質濃度間存在一定的線性關系，本發明以金納米棒與微藻蛋白質的生物結合，研究了金納米棒與微藻蛋白質的結合反應，建立了一種簡便、靈敏、穩定的微藻蛋白質的檢測方法。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種新型的微藻蛋白質的納米金測試方法。為達到上述目的，本發明采用如下技術方案: 一種新型的微藻蛋白質的納米金測試方法，其特征在于該方法的具體步驟為:
a、在無菌條件下，采用TCA-丙酮結合法將對數生長期(16個/ml)微藻進行蛋白質提取，得到含有純微藻蛋白質的溶液。
[0006]b、將含有純微藻蛋白的溶液配制成不同梯度濃度的溶液，與所制得的金納米棒進行反應，測定不同的熒光強度。
[0007]C、作各個條件因素對熒光散射強度的影響及其優化的試驗，包括(1)、PH值的優化:應用pH范圍為2.0-5.5的待測溶液，通過不同pH條件下的焚光散射強度，得到最佳pH條件為4.5; (2)共存物質的影響:通過6組不同Na+濃度(0.1-0.6mol/L)下的熒光散射強度，得到最佳無機鹽離子Na+為0.5mol/L； (3)反應穩定時間的優化:反應時間在1min以內，分別測定光散射強度，時間間隔為2min。
【附圖說明】
[0008]圖1為本發明中不同藻蛋白含量與金納米棒反應后的熒光強度變化圖。
[0009]圖2為本發明中不同pH下藻蛋白與金納米棒反應后的熒光強度變化圖。
[0010]圖3為本發明中不同時間下的藻蛋白與金納米棒反應的熒光強度變化圖。
[0011]圖4為本發明中不同濃度Na+離子對藻蛋白溶液與金納米棒結合的熒光強度變化圖。
【具體實施方式】
[0012]現將本發明的具體實施例敘述如下。
實施例
[0013]a、實驗所采用藻種為銅綠微囊藻1298號標準藻種，購自中國科學院水生生物研究所。采用BG-11培養基，pH=7.1，溫度28 ± I° C，光照時間16h/d，光照強度為IΟΟμπιοI.m_2.s-1，光源為白熾燈。
[0014]b、待銅綠微囊藻細胞進入對數生長期(16個/ml)，取適量藻液，6000r/min離心獲取藻泥，將藻泥用液氮研磨成粉末，懸浮于四倍體積的_20°C的含10%TCA(三氯乙酸)、2mmol/LDTT的丙酮中，-20°C中沉淀2個小時，在9000r/min 4°C離心15min，棄上清液，將沉淀再懸浮于-20°C含2mmol/LDTT的丙酮中，沉淀2個小時，9000r/min 4°C離心15min，棄上清液，重復步驟2、3三次，將沉淀真空冷凍干燥，得粗蛋白質，得到微囊藻蛋白質溶液。
[0015]C、分別配制含不同濃度的藻蛋白的溶液，在7個1ml容量瓶中分別加入2ml、
2.5ml、3ml、3.5ml、4ml、4.5ml、5ml藻蛋白溶液，再分別加入5ml的納米金溶液，將蒸餾水補足到10ml，將溶液放在磁力攪拌器上進行攪拌，靜置約lOmin。離心一次，除掉未參加反應的納米棒和蛋白質，待掃描測量體系的熒光散射強度。
[0016]d、作各個條件因素對熒光散射強度的影響及其優化的試驗
(1)、ρΗ值的優化
在含有藻蛋白的測定液中，應用HCl (0.lmol/L)緩沖溶液，分別配制pH范圍為1.0-6.0的待測溶液，測定不同PH條件下的熒光散射強度
(2)、共存物質的影響在含有藻蛋白的測定液中，考察研究不同濃度的無機鹽離子Na+對納米金探針光散射強度的影響。分別配制了6組不同Na+濃度(0.l-0.6mol/L)，藻蛋白測定液。
[0017](3)、反應穩定時間的優化
按照上述實驗方法進行測定，反應時間在1min以內，分別測定光散射強度，時間間隔為2min。
[0018]對實施例中的試驗過程或處理過程的分析和評價:
不同藻蛋白含量與金納米棒反應后的熒光強度變化:隨著體系中蛋白質濃度的增加，可以看到熒光強度明顯增強(見附圖1中1-7)，熒光強度的峰值在560nm處。
[0019]不同pH下藻蛋白與金納米棒反應后的熒光強度變化:當pH在2.0?4.0之間時，焚光強度隨著pH的升高逐漸降低；當pH從4.0升高至4.5時，熒光強度突然增加；當pH從4.5升到
5.5時，熒光強度持續下降直至最低；當pH=4.5時，響應最靈敏，熒光強度達到最大值。
[0020]不同時間下的藻蛋白與金納米棒反應的熒光強度變化:在0_2min內，體系的熒光強度相差無幾且達到最大值，金納米棒與蛋白質的結合程度最高。隨著體系反應時間的不斷增加，從2-12min之間，體系熒光強度逐漸降低，藻蛋白與金納米棒結合的熒光強度具有相當的遞減效應。
[0021 ]不同濃度Na+離子對藻蛋白溶液與金納米棒結合的熒光強度變化:當Na+的濃度為
0.1-0.3mol/L時，熒光強度變化不大；當Na+的濃度在0.3-0.5mol/L時，熒光強度明顯增強，且在0.5mol/L時，響應最靈敏。當Na+的濃度>0.5mol/L時，熒光強度大幅度降低。在
0.5mol/L時，響應最靈敏。
[0022]本發明方法其結果表明:隨著蛋白質濃度的增加，熒光散射的強度增強;體系的最適pH值為4.5，無機鹽離子Na+最佳濃度在0.511101凡，反應體系的穩定時間是21]1；[11以內，金納米棒與藻類蛋白的結合之后，可以大大的增強體系的熒光強度，可以更加靈敏、便捷、穩定的檢測藻類蛋白。
[0023]本方法適用于所有含有并可提取蛋白質的微藻。
【主權項】
1.一種微藻蛋白質的納米金測試方法，其特征在于該方法的具體步驟為:a在無菌條件下，采用TCA-丙酮結合法將對數生長期(16個/ml)微藻進行蛋白質提取，得到含有純微藻蛋白質的溶液； b將含有純微藻蛋白的溶液配制成不同梯度濃度的溶液，與所制得的金納米棒進行反應，測定不同的熒光強度； c作各個條件因素對熒光散射強度的影響及其優化的試驗，包括(1)、ρΗ值的優化:應用PH范圍為2.0-5.5的待測溶液，通過不同pH條件下的熒光散射強度，得到最佳pH條件為.4.5; (2)共存物質的影響:通過6組不同Na+濃度(0.1-0.6mo 1/L)下的熒光散射強度，得到最佳無機鹽離子Na+為0.5mol/L ； (3)反應穩定時間的優化:反應時間在1min以內，分別測定光散射強度，時間間隔為2m i η。
【專利摘要】本發明涉及一種用納米金棒測試微藻蛋白質的方法。是蛋白質分析檢測領域。本發明是通過將藻類蛋白質與金納米棒結合，提高其體系的熒光強度，便于檢測。實驗過程證實：在一定條件下，即銅綠微囊藻生長溫度28℃，達到對數生長期后，從培養液中提取銅綠微囊藻的胞內蛋白質，配制不同濃度微藻蛋白質溶液，測定其熒光強度，并進行實驗條件的優化，不同的pH對于實驗結果的影響，不同的反應時間中，體系熒光強度的變化，不同Na+離子濃度對于實驗的影響。結果表明：隨著蛋白質濃度的增加，熒光散射的強度增強；體系的最適pH值為6，無機鹽離子Na+最佳濃度在0.5mol/L,反應體系的穩定時間是2min。本發明可作為納米金方法測試藻類蛋白質的參考因素。
【IPC分類】G01N21/552, G01N21/49
【公開號】CN105548086
【申請號】CN201510902336
【發明人】劉書宇, 胡曉慧, 趙月平, 徐敬玲
【申請人】上海大學
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2015年12月9日