一種利用麥穗魚檢測水中遺傳毒物的方法
【技術領域】
[0001]本發明提供了一種利用麥穗魚檢測水中遺傳毒物的方法，屬于化學品安全性評價和環境監測領域。
【背景技術】
[0002]遺傳毒性測試和評估方法已列入新藥研究、環境監測、農藥開發、化學物質與食品安全性評價、新型材料研制等涉及人體健康或環境風險評價的規定試驗檢測項目。由于生物物種具有地域性，使用國際標準模式物種進行環境監測和化學品安全性評價，并不能充分保護我國本土生物。因此，我國新化學物質登記法規中規定，進行新化學物質申報時必須提供在中國境內用中國的供試生物完成的生態毒理學測試數據。對于排水和環境水體進行毒性監測，也非常必要采用本土物種。麥穗魚(Pseudorasbora parva)屬鯉科，麥穗魚屬，在國內分布廣泛，是江河、湖泊、池塘等水體中常見的小型魚類，具有適應性廣、繁殖力強、易于培養等特點。目前利用麥穗魚進行毒性評價主要用于測試急性毒性，或利用麥穗魚微核實驗評價遺傳毒性。尚無利用麥穗魚彗星實驗評價遺傳毒性的方法。
[0003]彗星實驗，即單細胞凝膠電泳實驗，是一種檢測真核生物細胞DNA損傷的常用方法，可以對遺傳毒物引起的DNA損傷進行定性和半定量的測試，與傳統的遺傳毒性測試方法如微核試驗、Ames實驗等相比，具有靈敏、快速的優點。人用藥品注冊技術規定國際協調會議(ICH)2012年修訂的藥物評價指南中將組織彗星實驗納入遺傳毒性評價中。經濟合作與發展組織(OECD)已頒布體內堿性彗星試驗指南。因此利用彗星實驗進行遺傳毒性檢測具有良好的可行性和應用前景。
【發明內容】
[0004]本發明根據彗星實驗用于遺傳毒性評價的靈敏、快速、簡便的特點，以及化學品安全性評價對于使用本土生物的規定，提出了一種利用中國本土淡水生物麥穗魚檢測水中遺傳毒物的方法。
[0005]本發明的技術方案:
[0006]—種利用麥穗魚檢測水中遺傳毒物的方法，步驟如下:
[0007](I)試驗魚準備:將麥穗魚在溫度21_23°C、光暗比14h:1Oh曝氣水馴養7天;得到平均體長2.6-2.8cm和平均體重0.3-0.5g的麥穗魚；
[0008](2)設置空白對照組、陽性對照組和待測組水樣，暴露處理麥穗魚;每2L水中暴露5條麥穗魚，暴露處理前一天停止喂食，暴露期間不喂食；
[0009]所述的空白對照組水樣為曝氣水；
[0010]所述的陽性對照組水樣為用曝氣水配制的濃度為0_30mg/L的濃度梯度的重鉻酸鉀溶液，或用曝氣水配制的濃度為0-5yg/L的濃度梯度的4-硝基喹啉-1 -氧化物溶液；
[0011]所述的待測組水樣是用曝氣水配制的目標化學物溶液、經過過濾的環境水樣或其他可溶于水中的環境樣品；
[0012](3)將麥穗魚分別暴露在步驟(2)的三種水樣中96h，取出麥穗魚，冰上解剖取出肝臟組織，用于單細胞凝膠電泳；
[0013]所述的單細胞凝膠電泳步驟如下:
[0014]I)制備單細胞懸浮液:取麥穗魚肝臟組織，用PBS緩沖液沖洗肝臟組織，4°C條件下加入0.4mL解凍的胰蛋白酶，將肝臟組織分解為單細胞，加入0.SmL杜爾伯科改良伊格爾培養基(DMEM)終止消化，用200目的鋼絲網過濾，將濾液進行離心處理，去上清液，加入DMEM，調整懸浮液中細胞密度為16?17個/ml，制得麥穗魚肝細胞單細胞懸浮液；
[0015]2)制作單細胞電泳膠板:將加熱溶化后的0.準熔點瓊脂糖快速鋪在載玻片上，4°C下冷卻凝固，制成第一層膠板;按照體積比3:1將0.35wt %低熔點瓊脂糖和單細胞懸浮液混合鋪在第一層膠板上，4°C下冷卻凝固，制得雙層膠板；
[0016]3)裂解細胞:將雙層膠板浸入裂解液中，4°C下避光放置1.5h，結束后用蒸餾水沖洗殘留裂解液；
[0017]4)DNA解旋:將步驟3)得到的雙層膠板浸入堿性緩沖溶液，4°C下避光放置20min;
[0018]5)電泳:將步驟4)得到的雙層膠板水平放入電泳槽中，倒入電泳液，電壓25V，電流300mA，電泳20min。
[0019](4)染色:單細胞凝膠電泳結束后用蒸餾水沖洗雙層膠板，用Tris-HCl緩沖液浸泡雙層膠板15min，反復2次;避光瞭干，Gelred染色；
[0020](5)鏡檢和分析:用顯微鏡觀察經過步驟(4)處理后的細胞狀態并拍照；獲取圖像后，對細胞彗星尾長、DNA含量和尾矩進行統計分析。
[0021]所述的裂解液為2.511101/1^1(:1、0.111101/1^^0了厶、1011111101/1Tris-HCl 和 Iwt %十二烷基肌氨酸鈉，調整PH= 10，使用前加Iwt % Triton X-100和1wt % 二甲基亞砜(DMSO)。
[0022]所述的1^8-!1(:1緩沖液的濃度為0.411101/1，？!1為7.5。
[0023]本發明的有益效果:選擇中國本土淡水生物麥穗魚，通過彗星實驗對化學品或環境水體進行遺傳毒性檢測，相比于使用國際標準模式生物，使用本土物種能夠更充分評價中國本土生物健康風險；同時用于化學品和實際環境水體的遺傳毒性監測，可以更全面評價環境污染對于水生生物的健康風險；用麥穗魚進行彗星實驗評價遺傳毒性，相比于用麥穗魚進行微核試驗，更為靈敏、快速。
【附圖說明】
[0024]圖1為不同濃度K2Cr2O7對麥穗魚DNA損傷。
[0025]圖2為不同濃度4-NQ0對麥穗魚DNA損傷。
[0026]圖3為不同稀釋濃度水樣對麥穗魚DNA損傷。
【具體實施方式】
[0027]以下結合附圖和技術方案，進一步說明本發明的【具體實施方式】。
[0028]實施例
[0029]采集渾河某斷面水樣，用玻璃纖維濾膜過濾后，用于麥穗魚暴露；用重鉻酸鉀(K2Cr2O7)和4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQ0)作為陽性對照，評價該水樣對麥穗魚的遺傳毒性。
[0030]本具體實施例采用如下步驟:
[0031](I)麥穗魚在實驗室內馴養一周，馴養期間死亡率低于5%，暴露前一天停止喂食，選擇體長、體重接近的同一批麥穗魚用于實驗；
[0032](2)用曝氣一天以上自來水，配制麥穗魚暴露水樣:陽性對照化學物，K2Cr2O7濃度梯度為 2.5mg/L、5mg/L、10mg/L，4-NQ0 濃度梯度為 0.2yg/L、0.5yg/L、lyg/L ；待測環境水樣，用玻璃纖維濾膜過濾后，用曝氣自來水稀釋，濃度梯度60 %、80 %、100 % ;
[0033](3)用空白對照(曝氣自來水)、陽性對照和待測水樣暴露處理麥穗魚96h，2L水樣中暴露5條麥穗魚，光暗比14h:10h，溫度21-23°C;
[0034](4)暴露結束后，將麥穗魚置于冰上解剖取肝臟組織；
[0035](5)制作單細胞電泳膠板:取450yL加熱溶化后的0.5的％正常熔點瓊脂糖，快速鋪在載玻片上，4°C下冷卻凝固，制成第一層膠板;將450yL 0.35被％低熔點瓊脂糖和150yL單細胞懸浮液混合，取10yL混合液鋪在第一層膠板上，4°C下冷卻凝固，制得雙層膠板；
[0036](6)裂解細胞:將步驟(5)得到的雙層膠板浸入裂解液中，4°C下避光放置1.5h，結束后用蒸餾水沖洗殘留裂解液；
[0037](7)DNA解旋:步驟(6)得到的雙層膠板浸入堿性緩沖溶液，4°C下避光放置20min;
[0038](8)電泳:將步驟(7)得到的雙層膠板水平放入電泳槽中，倒入電泳液，電壓25V，電流300mA，電泳20min;
[0039](9)染色:電泳結束后用蒸餾水沖洗膠板，用T r i s - H CI緩沖液，浸泡雙層膠板15min，反復2次;避光瞭干，Gelred染色；
[0040](10)鏡檢和分析:用熒光倒置顯微鏡，觀察細胞狀態并拍照；獲取圖像后，對細胞彗星尾長、DNA含量和尾矩進行統計分析。
[0041 ] 結果說明:圖1和圖2分別是用麥穗魚彗星實驗評價1(2&207和4-NQ0的遺傳毒性，在K2Cr2O7濃度為5mg/L和4-NQ0濃度為0.5yg/L時檢測出顯著的遺傳毒性效應。圖3是用麥穗魚彗星實驗檢測渾河某斷面水樣遺傳毒性，該水樣在稀釋濃度為60 %時對麥穗魚產生了顯著的遺傳毒性。綜上，麥穗魚進行彗星實驗能快速、靈敏的評價化學品的遺傳毒性以及監測環境樣品的遺傳毒性。
【主權項】
1.一種利用麥穗魚檢測水中遺傳毒物的方法，其特征在于，步驟如下: (1)試驗魚準備:將麥穗魚在溫度21-23°c、光暗比14h:1Oh曝氣水馴養7天，得到平均體長2.6-2.8cm和平均體重0.3-0.5g的麥穗魚； (2)設置空白對照組水樣、陽性對照組水樣和待測組水樣，暴露處理麥穗魚；每2L水中暴露5條麥糖魚，暴露處理如一天停止喂食，暴露期間不喂食； 所述的空白對照組水樣為曝氣水； 所述的陽性對照組水樣為用曝氣水配制的濃度為0_30mg/L的濃度梯度的重鉻酸鉀溶液，或用曝氣水配制的濃度為0-5yg/L的濃度梯度的4-硝基喹啉-1 -氧化物溶液； 所述的待測組水樣是用曝氣水配制的目標化學物溶液、經過過濾的環境水樣或其他溶于水中的環境樣品； (3)將麥穗魚分別暴露在步驟(2)的三種水樣中96h，取出麥穗魚，冰上解剖取出肝臟組織，用于單細胞凝膠電泳； (4)染色:單細胞凝膠電泳結束后用蒸餾水沖洗雙層膠板，用Tris-HCl緩沖液浸泡雙層膠板15min，反復2次;避光瞭干，Gelred染色； (5)鏡檢和分析:用顯微鏡觀察經過步驟(4)處理后的細胞狀態并拍照；獲取圖像后，對細胞彗星尾長、DNA含量和尾矩統計分析。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的單細胞凝膠電泳步驟如下: 1)制備單細胞懸浮液:取麥穗魚肝臟組織，用PBS緩沖液沖洗肝臟組織，4°C條件下加入0.4mL解凍的胰蛋白酶，將肝臟組織分解為單細胞，加入0.SmL杜爾伯科改良伊格爾培養基終止消化，用200目的鋼絲網過濾，將濾液進行離心處理，去上清液，加入DMEM，調整懸浮液中細胞密度為16?17個/ml，制得麥穗魚肝細胞單細胞懸浮液； 2)制作單細胞電泳膠板:將加熱溶化后的0.準熔點瓊脂糖快速鋪在載玻片上，4°C下冷卻凝固，制成第一層膠板;按照體積比3:1將0.35wt %低熔點瓊脂糖和單細胞懸浮液混合鋪在第一層膠板上，4°C下冷卻凝固，制得雙層膠板； 3)裂解細胞:將雙層膠板浸入裂解液中，4°C下避光放置1.5h，結束后用蒸餾水沖洗殘留裂解液； 4 )DNA解旋:將步驟3)得到的雙層膠板浸入堿性緩沖溶液，4°C下避光放置20min; 5)電泳:將步驟4)得到的雙層膠板水平放入電泳槽中，倒入電泳液，電壓25V，電流300mA，電泳20min。3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的Tris-HCl緩沖液的濃度為0.4mol/L，pHS7.5。4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的裂解液為2.5moI/LNaCl、0.1mo I/LNa2EDTA、10mmol/L Tris_HCl和Iwt %十二燒基肌氨酸鈉，調整pH = 10，使用前加Iwt %Triton X_10(^P10wt%DMS0。
【專利摘要】本發明提供了一種利用麥穗魚檢測水中遺傳毒物的方法，屬于化學品安全性評價和環境監測領域。包括步驟如下：(1)用待測水樣暴露處理麥穗魚；(2)取暴露處理后的麥穗魚肝細胞進行單細胞凝膠電泳實驗，檢測并統計細胞彗星尾長、DNA含量和尾矩，并繪制劑量-效應曲線。通過與空白對照和陽性對照的比較，以及劑量-效應關系，判斷受試樣品的遺傳毒性。本發明的檢測方法可以靈敏、快速判斷化學物的遺傳毒性,并為化學品遺傳毒性評價和環境遺傳毒性監測提供了一種基于我國本土物種的檢測方法。
【IPC分類】G01N33/18, G01N21/84
【公開號】CN105510543
【申請號】CN201510847527
【發明人】劉薇, 張洲, 張新, 趙璐璐, 楊京亞
【申請人】大連理工大學
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年11月27日