光子重組的非線性超分辨顯微方法及裝置的制造方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于共聚焦顯微領域，特別涉及一種光子重組的非線性超分辨顯微方法及 裝置。
【背景技術】
[0002] -直以來，傳統的遠場焚光顯微技術由于衍射極限的存在，因此在納米技術、材 料、生物以及醫學領域等的應用受到很大的限制。為了解決這一問題，自從上個世紀90年代 開始，人們提出了很多超分辨顯微方法。在這些所提出的方法中，熒光差分顯微技術(FED) 成為新近提出的方法中可以在不使用熒光標記的情況下分析生物樣品。熒光差分顯微術基 于的是共聚焦顯微成像技術，它是利用兩個通過特定激發的光斑掃描得到的兩張圖像之差 來獲得分辨率的提高的。即待分析的樣品是分別被一個實心光斑接著被一個空心光斑照 明，將兩者以不同的比重進行相減運算即可重構出超分辨圖像。實驗結果顯示，熒光差分顯 微在遠場可以獲取小于四分之波長的分辨率并且具有較高的信噪比。
[0003] 然而，這種熒光差分顯微術存在圖像變形以及信息丟失的問題。在之前的系統中， 空心光斑是通過采用一個〇到2π的渦旋位相板調制一個與之同向的圓偏光實現的。由于空 心照明光斑的輪廓比實心光斑的要大得多，兩者相減后將導致獲得的有效點擴散函數出現 負值旁瓣，而某些正值的強度可以通過負值強度來補償，因此在圖像重構的過程中，去除的 負值強度將導致信息的丟失。這個問題的關鍵解決方法便是找到某種方法使產生的實心和 空心光斑具有大致相等的尺寸。
【發明內容】
[0004] 本發明提供了一種光子重組的非線性超分辨顯微方法和裝置，相對于其他超分辨 成像顯微鏡，該裝置是基于共聚焦顯微鏡，其結構簡單，成像速度快，為生命科學和納米技 術提供了良好的研究手段。
[0005] 本發明通過光子重組以消除圖像變形而實現超分辨成像的方法，這種方法被稱為 飽和光照明虛擬熒光差分超分辨顯微術(svFED)。本顯微術通過高功率激光照明以達到熒 光的非線性效應，采用針孔探測器陣列取代傳統共焦顯微成像中放置于像面上的單個針孔 探測器，利用光子重組技術，結合類似于熒光差分顯微術(FED)的方法，僅僅掃描所獲取的 空心光斑而無需獲取實心光斑，從而大大簡化了實驗裝置并進一步提高了成像速度；同時 由于不存在負值旁瓣，使系統消除了成像變形這一困擾。仿真結果顯示光子重組的非線性 超分辨率顯微術相對于傳統共聚焦顯微術可提高至少39%。
[0006] 本發明的具體技術方案如下：
[0007] 本發明提供了一種光子重組的非線性超分辨顯微方法，針對熒光樣品包括以下步 驟：
[0008] (1)激光器發出高功率照明光束，經第一透鏡準直和擴束后得到準直擴束光束;所 述準直擴束后的照明光束經第一偏振片后，得到線偏振光；
[0009] (2)所述線偏振光經第一反射鏡反射后進入0~231渦旋位相板調制入射光的相位； 所述被調制位相后的線偏光經第一四分之一波片后補償了后面的二色鏡和第二反射鏡造 成的位相差，使其在經第二反射鏡反射后的出射光為準確的線偏光;所述位相差得到補償 的偏振光經半波片后得到改變了線偏振方向的出射光;所述出射光經二色鏡反射后進入第 二反射鏡;所述經第二反射鏡反射的反射光再經過第二四分之一波片后變成位相受到調制 的圓偏振光;所述位相受到調制的圓偏光經過物鏡后聚焦到位于所述物鏡焦面處樣品平面 上形成空心光斑照明熒光樣品；
[0010] (3)所述熒光樣品被高功率的空心光斑照明后，在非線性的作用下，產生飽和效 應，激發出飽和熒光;所述達到飽和效應的熒光被所述物鏡收集，經所述第二四分之一波片 后由所述第二反射鏡反射后進入所述二色鏡;所述熒光經所述二色鏡透射后進入濾光片濾 光后進入第二透鏡;所述經濾光片濾光后的熒光由第二透鏡會聚到由多個光電探測器組成 的探測器陣列上參與成像；
[0011] (4)所述探測器陣列將光信號轉換為電信號并傳送給計算機;所述計算機將每個 探測器探測到的空心光斑做相應的平移后疊加，得到實心光斑的圖像，完成了對樣品一個 點的信息讀入和處理；
[0012] (5)所述熒光樣品放置于納米移動平臺上;所述樣品平臺與所述計算機相連，通過 所述計算機的控制軟件實現納米移動平臺的在二維平面的移動完成對所述熒光樣品的二 維掃描。
[0013] 本發明還提供了一種光子重組的非線性超分辨顯微裝置，針對熒光樣品包括：
[0014] (1)高功率激光器，用于發出短波長高功率激光，實現對熒光樣品的照明，利用熒 光的非線性效應，以使其達到飽和從而激發飽和熒光；
[0015] (2)第一透鏡，用于對激光器發出的激光進行準直和擴束；
[0016] (3)偏振片，用于使準直并擴束后的激光變成線偏振光；
[0017] (4)第一反射鏡、第二反射鏡，用于反射光路，使光路變得緊湊；
[0018] (5)0~2π渦旋位相板，用于調制入射光的相位，從而使所述激光在樣品面聚焦時 形成空心光斑；
[0019] (6)第一四分之一波片，用于補償入射光經后面的二色鏡和第二反射鏡后帶來的 位相差，使其在經第二反射鏡反射后為準確的線偏光；
[0020] (7)二分之一波片，用于調整入射光的線偏振方向；
[0021] (8)二色鏡，用于使激光反射同時使被激發的熒光透射；
[0022] (9)第二四分之一波片，用于使相位受到調制的入射光變成圓偏振光；
[0023] (10)物鏡，用于將相位受到0~2π調制的圓偏振光會聚到樣品面上，收集熒光樣品 被激發后所發出的熒光；
[0024] (11)濾光片，用于濾除經所述樣品面反射回來的激光，而僅使熒光樣品發出的熒 光通過參與成像；
[0025] (12)第二透鏡，用于將所述熒光樣品發出的熒光會聚到所述探測器陣列上；
[0026] (13)探測器陣列，由15x15個帶有針孔的光電探測器所組成的陣列，如圖3所示的 矩形陣列，用于將探測到的光信號轉換為電信號并傳送至計算機；
[0027] (14)納米平移臺，通過控制納米位移平臺完成對樣品的二維平面掃描；
[0028] (15)計算機，用于處理探測器傳送過來的信號，同時控制納米移動平臺的平動使 其完成對樣品的二維平面掃描。
[0029] 本發明的原理如下：
[0030] 本發明在傳統共聚焦顯微鏡裝置(如圖1所示）的基礎上，首先經準直擴束后的高 功率激光光束入射到一偏振片后變成線偏光，線偏光再經過0~231渦旋位相板調制后經過 物鏡前的四分之一波片后形成位相受到調制的圓偏振光，再由物鏡聚焦到位于其焦面上的 樣品平面后形成高強度空心光斑，激發光照明熒光樣品后使其激發產生熒光。當激發光強 度較小時，所激發的熒光強度與激發光強成正比，當激發光強I超過某一臨界值Is后，如果 持續增加光強，熒光將產生非線性效應，即熒光的發射強度將保持恒定，產生熒光飽和現 象。這是由于較強的激發光造成熒光分子的吸收截面減小，從而降低了分子實際捕獲激發 光光子的能力，BP
[0031] 〇'cs = ocs(l+I/Is)
[0032]其中，〇'。3為熒光分子的實際吸收截面，ocs = 23t(A/2jt)2( yr/ Γ tC)t)為熒光分子的 吸收截面，Γ tclt，γ 4Ρλ分別為吸收總頻率寬、自發輻射熒光率和激發光波長。此時的點擴 散函數將產生變形，其峰值將被削平，如圖5所示。這種變形后的點擴散函數在空間頻域內 包含更多的高頻分量，從而可以探測物體更多的高頻信息。物鏡將收集到的飽和熒光經成 像光路后，最終成像在探測器陣列上，則探測器陣列上所記錄的光強為：
[0033]
[0034] 其中，？代表樣品上被掃描的位置矢量，？'代表物空間上的物的位置矢量，J代表 探測器所在的位置矢量，〇表示熒光樣品發出的光強;有效點擴散函數為：
[0035]
[0036] 式中：ΜΚ?')代表激發點擴散函數，分')代表探測點擴散函數，共輒焦點處 的針孔探測器單元所對應的有效點擴散函數如圖6所示。
[0037] 當探測器單元不是處在共輒焦點上時，該探測器單元所探測到的探測點擴散函數 將發生平移，從而使有效點擴散函數的峰值產生平移，如圖7(a)中的點虛線和線虛線所示 分別表示距離共輒點探測器±〇.25λ處所對應的有效點擴散函數。故假如直接將每個探測 器單元所獲得的有效點擴散函數加起來，則所獲得的有效點擴散函數將產生較大的輪廓， 從而與未采用針孔探測器的共焦顯微一樣降低了分辨率。所以，在已知探測器陣列中每個 探測單元的實際位置時，將每個探測器單元所對應的有效點擴散函數作一定的平移，如圖7 (b)點虛線和線虛線所示，然后再相加，這一過程被稱為光子重組，用公式表示即：
[0038]
[0039] 其中q稱為平移因子，采用卷積的形式寫出該光強即為：
[0040]
[0041]
[0042]
[0043] 由于探測器陣列中的每個探測單元所獲得的有效點擴散函數的空心暗斑位置都 與共輒焦點處探測器單元所得到的暗斑位置重合，當對探測器陣列中的每個探測單元所對 應的有效點擴散函數作光子重組后，中心暗斑位置處將被光子填充，從而使作光子重組后 的有效點擴散函數變成一個中心較周圍強度稍低的實心光斑，其有效點擴散函數如圖8所 不。
[0044]那么利用與熒光差分(FED)-樣的原理，將光子重組所獲得的實心光斑對應的有 效點擴散函數減去一定比例的處于熒光樣品共輒點處探測單元所得到的空心光斑對應的 有效點擴散函數即可獲得一個光斑更小的實心光斑，所對應的有效點擴散函數如圖9所示。 對于處于共輒點的探測單元所得到空心光斑的光強分布為：
[0045]
[0046]
[0047]
[0048]則重構圖像后的光強為：
[0049]
[0050] 其中，p為減數因子。采用卷積形式可以寫成：
[0051]
[0052]
[0053]
[0054]適當選擇平移因子q和減數因子p可以獲得一個半高全寬很小的重構點擴散函數。 如此便完成了對單個物點的圖像讀入和處