一種海蜇足囊石蠟切片前期處理方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于腔腸動物組織切片制備技術領域，具體的涉及一種海蜇足囊石蠟切片前期處理方法。
【背景技術】
[0002]海蜇是我國沿海特有的大型可食用水母，也是我國水產養殖業中重要的養殖品種之一，其生殖生物學研究一直受到相關科研人員的重視。足囊是海蜇無性繁殖關鍵生活史階段，可抵御低氧、餌料匱乏等惡劣環境，并能防止敵害生物捕食及有害微生物侵染，對保持海蜇自然資源和實現人工繁育具有重要意義。
[0003]石蠟切片技術廣泛應用于組織形態的觀察，在海蜇足囊研究方面具有重要意義。海蜇足囊緊緊附著在附著基表面(人工繁育附著基為聚乙烯波紋板)，在制作海蜇足囊石蠟切片的實驗研究過程中，若直接用鑷子、解剖針等取樣，會直接破壞足囊組織結構，導致切片制作成功率在5%以下；足囊周圍包裹一層幾丁質外膜，通透性差，不能直接用固定液固定;足囊體積極小(直徑200-500μπι，厚度20-50μπι)，采用傳統蠟塊制備方法，足囊分散于蠟塊中，在海蜇足囊組織切片時，難以對足囊位置進行固定。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是針對海蜇足囊石蠟切片固定過程中存在的技術問題，提供一種適用于海蜇足囊組織結構特點的固定方法。
[0005]本發明要解決的技術問題是克服海蜇足囊難以與附著基剝離、不易固定、體積小操作不方便的缺陷，提供一種海蜇足囊石蠟切片的前期處理方法，既能實現足囊的完整固定，又能對足囊位置進行定位。
[0006]為了達到上述目的，本發明是通過采用如下技術方案實現的:
一種海蜇足囊石蠟切片的前期處理方法，包括如下步驟:
1、取樣處理:用海水沖洗帶有海蜇足囊的聚乙烯波紋板，選擇足囊較多的部位，將帶有足囊的波紋板剪成長、寬為l_3cm的小片。
[0007]2、第一次固定:將上述步驟I中帶有足囊的波紋板放置于50ml的離心管中，加入Bouin氏固定液固定30_60min。
[0008]3、足囊穿刺:將上述步驟2固定后的足囊用磷酸緩沖液輕輕清洗3-5次，放置于體視鏡下，用細針從足囊側面，斜向下將一側幾丁質外膜刺穿。
[OOO9 ] 4、第二次固定:將上述步驟3處理的足囊再次放入Bouin氏固定液中固定I _2h。
[0010]5、足囊收集:將上述步驟4處理的足囊用磷酸緩沖液清洗2-3次后，放置于體視鏡下，用解剖針將波紋板上的足囊小心的鏟下，收集。
[0011]6、超聲清洗:將上述步驟5收集的足囊置于超聲管中，清洗l-3min，之后用磷酸緩沖液清洗3-5次。
[0012]7、瓊脂凝集:將上述步驟6清洗的足囊收集到1.5ml離心管中，棄去上清，加入50-150μ1冷卻至35-40°C的1.5%低熔點瓊脂，混勻靜置5-1011^11，冷凝后去除多余瓊脂。
[0013]8、第三次固定:將包含有足囊的瓊脂塊轉入Bouin氏固定液中固定10_20h，后續操作與常規石蠟切片相同。
[0014]本發明的有益效果:本發明首次提供了一種海蜇足囊石蠟切片前期處理方法，通過樣品處理、足囊穿刺、多次固定、超聲清洗及瓊脂凝集等步驟，在保證組織形態完整的前提下，使足囊徹底固定，該方法實用性強，操作簡單，足囊固定效果好，更利于海蜇足囊的石蠟切片制作等后續研究的開展。
【具體實施方式】
[0015]下面結合具體實施例對本發明做進一步說明，但是這些實例并不限制本發明的范圍。此外相關領域的普通技術人員對本發明做的任何改動，只要不脫離本發明的實質，都將等價落在本發明權利要求書所限定的范圍內。
[0016]實施例1
1、取樣處理:用海水沖洗帶有海蜇足囊的聚乙烯波紋板，選擇足囊較多的部位，將帶有足囊的波紋板剪成長、寬為1.5cm的小片。
[0017]2、第一次固定:將上述步驟I中帶有足囊的波紋板放置于50ml的離心管中，加入Bouin氏固定液固定60min。
[0018]3、足囊穿刺:將上述步驟2固定后的足囊用磷酸緩沖液輕輕清洗5次，放置于體視鏡下，用細針從足囊側面，斜向下將一側幾丁質外膜刺穿。
[0019]4、第二次固定:將上述步驟3處理的足囊再次放入Bouin氏固定液中固定lh。
[0020]5、足囊收集:將上述步驟4處理的足囊用磷酸緩沖液清洗2次后，放置于體視鏡下，用解剖針將波紋板上的足囊小心的鏟下，收集。
[0021]6、超聲清洗:將上述步驟5收集的足囊置于超聲管中，清洗3min，之后用磷酸緩沖液清洗5次。
[0022]7、瓊脂凝集:將上述步驟6清洗的足囊收集到1.5ml離心管中，棄去上清，加入100μI冷卻至35-40°C的1.5%低熔點瓊脂，混勻靜置8min，冷凝后去除多余瓊脂。
[0023]8、第三次固定:將包含有足囊的瓊脂塊轉入Bou in氏固定液中固定1h。
[0024]實施例2
1、取樣處理:用海水沖洗帶有海蜇足囊的聚乙烯波紋板，選擇足囊較多的部位，將帶有足囊的波紋板剪成長、寬為I Cm的小片。
[0025]2、第一次固定:將上述步驟I中帶有足囊的波紋板放置于50ml的離心管中，加入Bouin氏固定液固定30min。
[0026]3、足囊穿刺:將上述步驟2固定后的足囊用磷酸緩沖液輕輕清洗3次，放置于體視鏡下，用細針從足囊側面，斜向下將一側幾丁質外膜刺穿。
[0027 ] 4、第二次固定:將上述步驟3處理的足囊再次放入Bouin氏固定液中固定2h。
[0028]5、足囊收集:將上述步驟4處理的足囊用磷酸緩沖液清洗3次后，放置于體視鏡下，用解剖針將波紋板上的足囊小心的鏟下，收集。
[0029]6、超聲清洗:將上述步驟5收集的足囊置于超聲管中，清洗lmin，之后用磷酸緩沖液清洗3次。
[0030]7、瓊脂凝集:將上述步驟6清洗的足囊收集到1.5ml離心管中，棄去上清，加入150μI冷卻至35-40°C的1.5%低熔點瓊脂，混勻靜置1min，冷凝后去除多余瓊脂。
[0031 ] 8、第三次固定:將包含有足囊的瓊脂塊轉入Bouin氏固定液中固定20h。
【主權項】
1.一種海蜇足囊石蠟切片前期處理方法，其特征在于，包括如下步驟: a、取樣處理:將帶有足囊的波紋板清洗后，剪成長、寬為l-3cm的小片； b、第一次固定:帶有足囊的波紋板小片經Bouin氏固定液固定30min-60min; c、足囊穿刺:固定后的足囊用磷酸緩沖液清洗3-5次，用細針從足囊側面，斜向下將一側幾丁質外膜刺穿； d、第二次固定:將上述步驟處理的足囊由Bouin氏固定液固定l_2h； e、足囊收集:將上述步驟處理的足囊用磷酸緩沖液清洗2-3次后，用解剖針將波紋板上的足囊小心的鏟下，收集； f、超聲清洗:將上述步驟收集的足囊置于超聲管中，清洗l_3min，之后用磷酸緩沖液清洗3-5次； g、瓊脂凝集:將上述步驟清洗的足囊收集到1.5ml離心管中，棄去上清，加入50-150μ1冷卻至35-40°C的1.5%低熔點瓊脂，混勻靜置5-1011^11，冷凝后去除多余瓊脂； h、第三次固定:將包含有足囊的瓊脂塊轉入Bouin氏固定液中固定10-20h，后續操作與常規石蠟切片相同。
【專利摘要】一種海蜇足囊石蠟切片前期處理方法，本發明屬于腔腸動物組織切片制備技術領域，它的步驟包括取樣處理、第一次固定、足囊穿刺、第二次固定、足囊收集、超聲清洗、瓊脂凝集及第三次固定。本發明在保證組織形態完整的前提下，使海蜇足囊徹底固定，該方法實用性強，操作簡單，足囊固定效果好，更利于海蜇足囊的石蠟切片制作等后續研究的開展。
【IPC分類】G01N1/36, G01N1/30
【公開號】CN105510106
【申請號】CN201510905745
【發明人】孫云, 劉春勝, 陳四清, 顧志峰, 王愛民, 陳昭廷
【申請人】海南大學
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年12月10日