乙酰甲胺磷膠體金檢測卡的制作方法
【技術領域】
[0001]屬于食品安全檢測領域，具體涉及食品中有害殘留物的檢測方法，特別是乙酰甲胺磷試紙檢測方法。
【背景技術】
[0002]乙酰甲胺磷(英文名稱:Ac印hate)又名高滅磷，屬低毒殺蟲劑。乙酰甲胺磷為內吸殺蟲劑，具有胃毒和觸殺作用，并可殺卵，有一定的熏蒸作用，是緩效型殺蟲劑，適用于蔬菜、茶樹、煙草、果樹、棉花、水稻、小麥、油菜等作物，防治多種咀嚼式、刺吸式口器害蟲和害螨及衛生害蟲。保管及使用不當可引起人畜中毒。
[0003]乙酰甲胺磷屬有機磷酸酯類農藥。該類農藥抑制體內膽堿酯酶，造成神經生理功能紊亂。有機磷農藥急性中毒系誤服引起。中毒表現有頭痛、頭昏、食欲減退、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、流涎、瞳孔縮小、呼吸道分泌物增多、多汗、肌束震顫等。重癥出現肺水腫、昏迷、呼吸麻痹、腦水腫，少數重度中毒者在臨床癥狀消失后數周出現神經病。接觸有機磷農藥工人可有頭暈、頭痛、無力、失眠、多汗、四肢麻木、肌肉跳動等。血膽堿酯酶活性降低。
[0004]我國已制定的一些農副產品中的農藥最高殘留限量表中乙酰甲胺磷的限量為谷類(以原糧計)，蔬菜中不得超過0.2mg/kg ;水果中不得超過0.5mg/kg。
【發明內容】
[0005]本發明目的在于提供快速檢測出食品中乙酰甲胺磷的殘留。
[0006]本發明的技術方案是乙酰甲胺磷的檢測卡及其檢測樣品的處理方法。乙酰甲胺磷的檢測卡是在長條扁平薄殼狀的檢測卡外殼內設置檢測條，檢測卡外殼表面有檢測窗孔和加樣孔，其特征在于測試條是由支承背板上粘貼四種原件組成:支承背板中部粘貼硝酸纖維素膜，支承背板一端上粘貼吸水紙，另一端粘貼樣品墊，吸水紙內端與硝酸纖維素膜搭接，樣品墊與硝酸纖維素膜之間則有一段金標墊，由金標墊將樣品墊與硝酸纖維素膜連接在一起。金標墊中是含有第二種屬蛋白和乙酰甲胺磷抗體的混合物，硝酸纖維素膜上橫向有2條間隔開的顯色印記帶，一條是含乙酰甲胺磷蛋白質偶聯物的檢測帶，另一條是第二種屬動物蛋白的IgG (常用的為抗兔抗體或抗鼠抗體);測試條置入檢測卡外殼內，樣品墊正對加樣孔，硝酸纖維素膜正對檢測窗孔。
[0007]樣品處理方法是:稱取試樣2±0.05 g于50 mL的離心管中，加入10 mL超純水，在1800 r/min條件下用高速組織粉碎機打碎(約1 min),取粘稠液加50%三氯乙酸2 mL和二氯甲燒10 mL,在回旋式振蕩器上高速振搖30 min。然后在4°C 5000 rpm條件下離心30 min，取上清10 mL，加二氯甲烷2 mL，在回旋加速器上振蕩混合20 min，再在4°C 12000rpm條件下離心30 min,上清液即為藥物的抽提液。
[0008]本發明的優點是能快速檢測出樣品中含有的乙酰甲胺磷，且節省檢測成本，使用方便，檢測快速，靈敏度高，結果準確。
【附圖說明】
[0009]圖1是乙酰甲胺磷檢測卡外殼及檢測試紙條在外殼內的安置圖。
[0010]圖2是乙酰甲胺磷檢測卡檢測試紙條結構示意圖。
[0011]圖3是檢測試紙條硝酸纖維素膜上顯示印跡帶示意圖。
【具體實施方式】
[0012]1.標記膠體金的制備
膠體金溶液的制備:先將1 g氯金酸(HAuC14)粉末溶于100 mL超純水配置成1%的氯金酸溶液；再取1 L超純水于特質電爐上加熱，至沸騰后加入10 mL 1%的檸檬酸三鈉水溶液，沸騰后繼續加熱，5分鐘后加10 mL 1%的氯金酸溶液，再次加熱至沸騰，等待顏色變為酒紅色后開始計時，10分鐘后停止加熱，取下后自然冷卻、定容至1 L，即為膠體金溶液。
[0013]抗體標記:確定抗體所需的0.1 mol/1 K2C03的比例，取100 mL膠體金溶液，加入此比例0.1 mol/L的K2C03，混勻(約5 min),再將乙酰甲胺磷和第二種屬動物蛋白分別用PBS (0.01 mol/L,pH7.4)溶解稀釋至2 mg/mL,加入2 mL 2 mg/mL的乙酰甲胺磷抗體(或2mL 2 mg/mL第二種屬動物蛋白),混勻(5 min),最后加入10% BSA 2 mL,混勻(5 min)。離心三次留沉淀，此三次收集的沉淀即為金標乙酰甲胺磷抗體。
[0014]膠體金標記部分處理:將乙酰甲胺磷抗體稀釋后，按一定比例將載體(如玻璃纖維、聚酯膜等)浸透，鋪均勻，取出放于37 °C恒溫烘箱烘制8-12 h，干燥后即作為膠體金標記部分。
[0015]2.免疫層析專用高分子復合膜制備
首先用一種硝酸纖維素膜制成透明背襯膜，在背襯膜上覆蓋一層對蛋白質結合力強，浸潤性能好的具有一定孔徑的層析膜。背襯膜的作用是阻止粘合劑中的有機溶劑對層析膜上蛋白質的破壞。
[0016]3.層析膜的點樣方法
將一定濃度的甜蜜抗原(乙酰甲胺磷與載體物質形成的偶合物)精確定量；以一定間距(5 mm)呈橫條狀點定于層析膜上，供檢測用。
[0017]乙酰甲胺磷檢測卡是在檢測卡外殼1中設置檢測試紙條2，檢測卡外殼1的結構及檢測試紙條2的設置見附圖1，檢測卡外殼1為長條扁平薄殼狀外殼，長70 _，寬20 _，厚5 mm,薄殼壁厚1 mm,由工程塑料制成，檢測卡外殼1由上蓋和下蓋兩半聯接而成，在檢測卡外殼1上蓋上有檢測窗孔3和加樣孔4。檢測試紙條2放置在檢測卡外殼1的下蓋內。
[0018]檢測試紙條2是多層結構的窄條薄片，片長60 mm,片寬約4 mm,厚度小于2.5 mm。檢測試紙條2是多層結構:底層是支承背板5,為聚乙烯薄片,厚度約0.5 mm,長60 mm,寬
4mm ;支承背板5中部粘貼硝酸纖維素膜6,硝酸纖維素膜厚0.5 mm,長20 mm,寬4 mm。硝酸纖維素膜6上有兩條間隔開的橫向顯示印跡帶，參見附圖3，兩條顯示印跡中，一條是檢測線10，含乙酰甲胺磷偶聯物，另一條是參照線11，含第二種屬動物蛋白的IgG。支承背板
5一端上粘貼吸水紙9，另一端粘貼樣品墊8，吸水紙9內端與硝酸纖維素膜6搭接，樣品墊8與硝酸纖維素膜6之間則有一段金標墊7，由金標墊7將樣品墊8與硝酸纖維素膜6連接在一起，搭接寬度在1-2 mm。樣品墊8材料為吸水玻璃纖維或聚酯膜。
[0019]使用乙酰甲胺磷膠體金檢測卡時，先將待檢測的樣品液(藥物的抽提液稀釋后，直接用于檢測)從加樣孔4中滴入乙酰甲胺磷檢測試紙條2的樣品墊8，由于虹作用原理，帶動待檢測的樣品液及膠體金膜7所含的抗乙酰甲胺磷單克隆抗體膠體金標記物一起向硝酸纖維素膜6擴散，5-10分鐘內觀察結果。
[0020]檢測卡的主要反應是免疫學的抗原和抗體反應，在硝酸纖維素膜上遷移的膠體金標記的抗體，在測試線上與含有乙酰甲胺磷蛋白質偶聯物，以及參照線含第二種屬動物蛋白的IgG反應，形成棕紅色條帶。若樣品中相應的待測乙酰甲胺磷高于允許值，樣品加入后先與金標墊中的抗體反應，而不會與檢測帶所帶有的乙酰甲胺磷蛋白質偶聯物反應，從而不顯色。主要有以下3種檢測結果:
1、檢測線10和參照線11同時顯現棕紅色印跡，表示檢測結果為陰性，說明被測樣品中不含乙酰甲胺磷或含量低于允許值。
[0021]2、檢測線10不顯色，參照線11顯現棕紅色印跡，表示檢測結果為陽性，說明被測樣品中乙酰甲胺磷含量高于允許值。
[0022]3、檢測線10顯現棕紅色印跡，參照線11不顯色，或檢測線10和參照線11均不顯色，表示檢測試紙條失效。
【主權項】
1.乙酰甲胺磷膠體金檢測卡，其特征在于:在試紙的背襯上依次貼有樣液吸收部分、膠體金標記部分、檢測反應部分和吸水部分，膠體金標記部分被標記的物質為第二種屬動物蛋白和乙酰甲胺磷抗體的混合物；檢測反應部分包被有檢測用乙酰甲胺磷抗原1條作為檢測線，同時還包被有抗第二種屬動物蛋白的IgG 1條作為參照線。2.根據權利要求1所述的乙酰甲胺磷膠體金檢測卡，其特征在于:乙酰甲胺磷檢測用抗原為乙酰甲胺磷與載體物質形成的偶合物。3.根據權利要求2所述的乙酰甲胺磷膠體金檢測卡，其特征在于:所述的載體物質，為蛋白質、蛋白質片段、合成多肽、半合成多肽或多糖。4.根據權利要求1所述的乙酰甲胺磷膠體金檢測卡，其特征在于:所述的第二種屬動物蛋白為非抗體來源動物的蛋白質。
【專利摘要】本發明為乙酰甲胺磷膠體金檢測卡。主要用于快速檢測食品中乙酰甲胺磷的含量，該方法在試紙的背襯上依次粘貼有樣液吸收部分、膠體金標記部分、檢測反應部分及吸水部分。檢測反應部分上面包被有檢測用抗原1條作為檢測線，同時還包被有抗第二種屬動物蛋白的IgG1條作為參照線。該快速檢測試紙條特異性強，能夠半定量檢測，環境溫度為4-35℃都可以使用，適合于個體養殖戶、食品衛生質檢部門、海關等植物源食品進行乙酰甲胺磷殘留的快速檢測。本發明具有特異性強、靈敏性高、能夠實現半定量檢測，且操作簡單方便等有益效果。
【IPC分類】G01N33/558, G01N33/577
【公開號】CN105486868
【申請號】CN201410522807
【發明人】洪霞, 薛永來, 吳明慧
【申請人】江蘇維賽科技生物發展有限公司
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2014年10月8日