側柏葉中烏發活性成分的提取和性能測定的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明公開了側柏葉的烏發活性成分樹脂的提取分離，W及對酪氨酸酶活性測 試。
【背景技術】
[0002] 側柏葉（Cacluneu Platycladi )又名叢柏葉，是側柏的干燥嫩枝梢及葉。中醫認 為側柏葉氣清香，味苦澀，性微寒.無毒入屯、'，肝、大腸經。具有涼血、止血、除內濕、散腫 毒之功。可治吐血、鼻出血、尿血、血頻、崩漏、風濕痛咳嗽、燙傷等癥。明代李時珍《本草綱 目》中記載側柏葉"乃多壽之木，所W可W入服食。道家W之點湯常飲。"側柏葉作為傳統 的中藥，其烏發功能一直被人忽略。而在諸多古代文獻中記載其主要功能為烏發和生發，在 《本草綱目》中謂其：浸油，生發，燒汁，黑發。和豬脂，沐發長黑。然而側柏葉烏發的機理尚 不明確。
【發明內容】
[0003] 本發明公開了側柏葉的烏發活性成分樹脂的提取和分離，W及對酪氨酸酶活性的 測試。1材料與方法 1. 1材料 側柏葉購自山東省濟寧市側柏種植基地，經吉林農業大學中藥材學院中藥學專業包海 鷹教授鑒定。磨茹酪氨酸酶（tyrosinase)，k多己化-Dopa)，均購自美國Sigma公司：憐 酸酶氨二鋼，憐酸二氨鋼，乙醇，石油酸，乙酸乙醋均為分析純。 1. 2儀器 721型分光光度計為上海第Ξ儀器分析廠產品，SY21-K型恒溫水浴鍋，RE-52AA旋轉蒸 發儀上海亞榮生化儀器廠。
[0004] 實驗內容與方法 1. 3. 1憐酸緩沖溶液（PBS)的配制：稱取0. 2mol/ml憐酸二氨鋼溶液250ml，加0. 2mol/ ml的氨氧化鋼溶液118ml，用水稀釋至1000ml，定容，即得。 陽0化]1. 3. 2酪氨酸酶溶液的配制：稱取13. 28g(25KU)磨茹酪氨酸酶（1881U/mg)，用 PBS定容至25ml,即化U/ml，分裝-20°C保存，臨用時室溫平衡，即得，稀釋至實驗所需濃度 143 U/mlo
[0006] 1. 3. 3 k多己溶液的配制：精密稱取197. 19mg，用PBS溶液定容至100ml，須現 用現配，濃度為197. 19g/mol。
[0007] 3. 4稱取新鮮的側柏葉2.化g，用石油酸（30°C -60°c )進行回流提取，提取時間3 小時，料液比1:12. 5,合并提取液濃縮，干燥。取干燥后的適量提取物，放入揮發油提取器 中，用水蒸氣蒸饋法進行提取，提取揮發油后剩余的提取液，干燥濃縮，即為側柏葉中的樹 脂成分。
[0008] 1. 3. 5將上述提取所得到的樹脂，用適量二甲基亞諷溶解，然后用憐酸緩沖溶液定 容，制成濃度分別為l〇mg/ml、20 mg/ml、30 mg/ml的Ξ個濃度梯度。多己溶液為底 物，在3ml的憐酸緩沖液的測活體系中，先加入0. 1ml不同濃度的提取物于比色杯中，再加 入2. 8ml預先在37°C恒溫水浴保溫的底物溶液，然后加入0. 1ml磨茹酪氨酸酶溶液，立刻混 勻，在37°C恒溫條件下測定波長為475的吸光度值。
[0009] 酪氨酸酶活性測試結果
3結論 通過對側柏葉中的樹脂類成分進行酪氨酸酶活性測試，結果樹脂對酪氨酸酶的激活率 高達102. 13%，可能是側柏葉的烏發活性成分，為進一步側柏葉烏發產品的開發提供了很好 的理論依據，很好的i全釋了在《本草綱目》中謂其："浸油，生發，燒汁，黑發。和豬脂，沐發長 黑"的記載。
【主權項】
1. 側柏葉（具有烏發生發的功能，并且價格低廉適合作為化妝 品、保健品的開發。2. 根據權利要求1所述的應用，其中側柏葉中烏發活性成分的提取和性能測定如下步 驟： 一稱量側柏葉2. 5kg，按1:12. 5的量加石油醚（60°C-90°C)回流提取3個小時，提取 兩次，合并提取液濃縮、干燥，得到34. 6g混合固體； 二稱取10g混合固體，用水蒸氣蒸餾法除去混合物中的揮發油，得到混合物固體 9. 2g，即為樹脂； 三稱取13. 28g(25KU)蘑菇酪氨酸酶（1881U/mg)，用PBS定容至25ml，即lKU/ml，分 裝-20°C保存，臨用時室溫平衡，即得，稀釋至實驗所需濃度143U/ml; 四稱取13. 28g(25KU)蘑菇酪氨酸酶（1881U/mg)，用PBS定容至25ml，即lKU/ml，分 裝-20°C保存，臨用時室溫平衡，即得，稀釋至實驗所需濃度143U/ml; 五將上述提取所得到的樹脂，用適量二甲基亞砜溶解，然后用磷酸緩沖溶液定容，制 成濃度分別為l〇mg/ml、20mg/ml、30mg/ml的三個濃度梯度； 六以L-多巴溶液為底物，在3ml的磷酸緩沖液的測活體系中，先加入0.lml不同濃度 的提取物于比色杯中，再加入2. 8ml預先在37°C恒溫水浴保溫的底物溶液，然后加入0.lml 蘑菇酪氨酸酶溶液，立刻混勻，在37°C恒溫條件下測定波長為475的吸光度值。
【專利摘要】<b>本發明公開了側柏葉中烏發活性成分樹脂的提取和對酪氨酸激活率測試：稱取新鮮的側柏葉</b><b>2.5kg</b><b>，用石油醚（</b><b>30</b><b>℃</b><b>-60</b><b>℃）進行回流提取，提取時間</b><b>3</b><b>小時，料液比</b><b>1:12.5</b><b>，合并提取液濃縮，干燥。取干燥后的適量提取物，放入揮發油提取器中，用水蒸氣蒸餾法進行提取，得黃色透明液體</b><b>1.2g</b><b>，剩余的膠狀液體干燥后即為樹脂，采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法，對樹脂進行酪氨酸酶激活率測試，藥物濃度為</b><b>30mg/ml</b><b>時，激活率達</b><b>102.13%</b><b>。</b>
【IPC分類】G01N21/31
【公開號】CN105486647
【申請號】CN201510630744
【發明人】包海鷹, 高旦, 劉葉
【申請人】吉林農業大學
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2015年9月29日