一種阿法替尼及其有關物質的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及阿法替尼及其有關物質的檢測方法，尤其是阿法替尼順式異構體的檢 測方法屬于制藥技術領域。
【背景技術】
[0002] 阿法替尼（Afatinib)是一種表皮生長因子受體(EGFR)和人表皮生長因子受體2 (Her-2)酪氨酸激酶的不可逆抑制劑，其二馬來酸鹽可用于治療晚期非小細胞肺癌(NSCLC) 等疾病。該化合物的化學名為(2E) -4- [ (3-氯-4-氟苯基)氨基]-6- {[ 4- (N，N-二甲基氨基)-1-氧代-2-丁烯-1-基]氨基}-7-((3S)_四氫呋喃-3-基氧基)-喹唑啉，結構式如下：
[0003]
[0004]W02007/085638A公開了一種阿法替尼的制備方法，其合成路線如下：
[0005]
[0006]所得阿法替尼粗品可以進一步精制后，與馬來酸反應，生成阿法替尼二馬來酸鹽。 [0007]阿法替尼(API)含有雙鍵和手性碳結構且穩定性較差，因此阿法替尼及其二馬來 酸鹽在制備或儲存過程中易產生雜質，包括(S，Z)-N-{4_[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[(四 氫呋喃-3-基)氧基]喹唑啉-6-基}-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺(RCl)、（R，E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[(四氫呋喃-3-基)氧基]喹唑啉-6-基} -4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰 胺(RC2)、（S，Z)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[(四氫呋喃-3-基)氧基]喹唑啉-6-基}-4-(羥基）丁-2-烯酰胺(RC3)、（S)-N4-(3-氯-4-氟苯基)-7-[(四氫呋喃-3-基)氧基]喹唑 啉-4,6-二胺(RC4)、二甲胺(RC5)等，其中，順式異構體雜質RC1和與目標產物性質相近而難 以分離、檢測。W02007/085638A的合成方法中還涉及工藝雜質（S)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基） 氨基]-7-[(四氫呋喃-3-基)氧基]喹唑啉-6-基}-4-氨甲酰基-膦酸二乙基酯(RC6)。
[0008] W02013/052157A公開了一種阿法替尼二馬來酸鹽的純度測定方法，其采用超高液 相色譜法實現，色譜柱為PhenomenexC18100A( 150mmX4 · 6mm，2 · 6μηι)，檢測波長為260/ 4nm，Ref550/1OOnm，柱溫為40°C，流速為0 · 7mL/min，進樣量為lyL，流動相為乙腈為流動相 A，0.2 %甲酸+0.1 %七氟丁酸pH2為流動相B，其梯度洗脫條件如下：
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[0010] 該方法所用儀器設備昂貴且不具有普遍適應性，并且對所用試劑、色譜柱要求苛 亥IJ，其中七氟丁酸價格昂貴。此外，該方法檢測阿法替尼時可檢出的雜質種類少，且分離度 差。由此可見，該方法的實用性和適用性差。
[0011]因此，需要一種適于分離和檢測阿法替尼及其有關物質，尤其是其順式異構體的 方法，以有效控制藥品的質量。
【發明內容】
[0012] 本發明提供了一種阿法替尼及其有關物質的檢測方法，是在高效液相色譜儀上進 行梯度洗脫，色譜柱為十八烷基鍵合硅膠色譜柱，流動相為含0.2%甲酸、0.1%三氟乙酸的 水溶液為流動相A，乙腈為流動相B，檢測波長為255nm~265nm，柱溫為35~45°C，其中，梯度 洗脫條件如下，
[0013]
ο
[0014]在本發明的一些優選實施方案中，所述有關物質是阿法替尼的順式異構體。
[0015]在本發明的一些優選實施方案中，所述十八烷基鍵合硅膠色譜柱為Phenomenex C18(250mmX4.6mm，5ym)。
[0016]發明人發現檢測波長可選擇255nm~265nm范圍內的任意波長，且均能滿足對阿法 替尼及其有關物質的檢測。在本發明的一些優選實施方案中，所述檢測波長為260nm。
[0017 ]在本發明的另一些優選實施方案中，所述柱溫為40°C。
[0018]在本發明的一些優選實施方案中，所述流速為1 .OmL/min。
[0019] 在本發明中，所述"流速" ±0.lmL/min、"流動相比例" ±2%、"檢測波長" ±2nm對 本發明的實施無影響，且均落入本發明的保護范圍內。
[0020] 發明人還發現，本發明的稀釋劑可以選擇任意可溶解樣品且對系統無干擾的溶 劑，例如水，30%乙腈，乙腈，甲醇，或體積比為85:15的含0.2%甲酸、0.1 %三氟乙酸的水溶 液:乙腈的混合溶液，且均能滿足對阿法替尼及其有關物質的檢測。
[0021] 本發明中，所述"阿法替尼"在沒有明確區分的情況下，可以是阿法替尼的純品、原 料藥、合成品、阿法替尼的鹽(如馬來酸阿法替尼)等以阿法替尼作為主成分的產品。本發明 的測定方法均適用于上述產品的質量控制，并且這些產品的有關物質的測定方法也保護在 本發明的保護范圍內。
[0022] 本發明中，所述"有關物質"是指在藥物制備和貯存過程中，對合成方法可能產生 的雜質（包括中間體、副產物等有機雜質）。其中，阿法替尼的有關物質包括其順式異構體 (RC1)等與其結構有關的潛在雜質，例如其降解雜質RC3、RC4、RC5。
[0023]本發明的檢測方法，能夠將阿法替尼及其順式異構體和與其結構有關的潛在雜質 進行有效的分離，分離度好，從而可以有效控制阿法替尼的質量。本發明的方法能夠簡單、 快捷、準確地分離檢測出阿法替尼及其順式異構體和與其結構有關的潛在雜質，且專屬性 強、靈敏度高、穩定性好、重現性好、精密度高、峰型好，可以用于實際生產中的有效控制。
【附圖說明】
[0024]圖1為實施例1空白溶液的色譜圖。
[0025]圖2為實施例1的馬來酸阿法替尼對照溶液的色譜圖。
[0026]圖3為實施例1的分離度溶液的色譜圖。
[0027]圖4為實施例1的馬來酸阿法替尼樣品的色譜圖。
[0028]圖5為實施例2的馬來酸阿法替尼對照品的色譜圖。
[0029 ]圖6為實施例2的馬來酸阿法替尼樣品的色譜圖。
[0030] 圖7為實施例3的馬來酸阿法替尼對照品的色譜圖。
[0031] 圖8為實施例3的馬來酸阿法替尼樣品的色譜圖。
[0032] 圖9為對比例的馬來酸阿法替尼樣品的色譜圖。 具體實施方案
[0033] 為了使本領域的技術人員更好地理解本發明的技術方案，下面進一步披露一些非 限制實施例對本發明作進一步的詳細說明。
[0034] 本發明所使用的試劑均可以從市場上購得。
[0035] 實施例1
[0036] (1)檢測條件
[0037] 儀器:waters2695高效液相色譜儀，2996PDA檢測器，檢測波長：260nm;
[0038]色譜柱:PhenomenexC18(250mmX4.6mm，5ym)色譜柱；
[0039] 稀釋劑:30%乙腈；
[0040] 流動相:0.2 %甲酸+0.1 %三氟乙酸的水溶液(取2ml的甲酸和1ml的三氟乙酸溶液 混勻于l〇〇〇ml水中）為流動相A，乙腈為流動相B;
[0041] 流速：1 .Oml/min;
[0042]柱溫:40°C;
[0043] 進樣量：10uL;
[0044] 按表1進行線性梯度洗脫。
[0045] 表 1
[0046]
[0047] (2)檢測步驟
[0048] 分離度溶液的制備:準確稱取順式異構體(RC1)、馬來酸阿法替尼、RC3和RC4按照 一定量比例混合，作為分離度溶液。
[0049] 對照品溶液的制備：取馬來酸阿法替尼對照品適量，加稀釋劑稀釋制成每lml含 〇. 5yg的溶液，作為對照品溶液。
[0050]供試品溶液的制備:取馬來酸阿法替尼樣品約25mg，精密稱定，至50mL量瓶中，用 稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
[0051]分別精密量取空白溶液、對照品溶液、分離度溶液和供試品溶液各1 OyL，注入液相 色譜儀，記錄色譜圖，見圖1、圖2、圖3、圖4。結果表明：在圖2中，各峰為阿法替尼API
[0052] (tR=17.421min);在圖3中，各峰為馬來酸（tR= 3.4min)、順式異構體RCl(tR= 16.22711^11)、阿法替尼厶？1(七1?=17.41911^11)、1^3(七1?=18.16511^11)、1^4(七1? = 23.29511^11)。
[0053] 實施例2
[0054]按照實施例1類似的檢測方法，其中，檢測波長替換為255nm。其對照品的色譜圖見 圖5、供試品的色譜見圖6。
[0055] 實施例3
[0056]按照實施例1類似的檢測方法，其中，檢測波長替換為265nm。其對照品的色譜圖見 圖7、供試品的色譜見圖8。
[0057]方法學驗證試驗結果
[0058] 按照《中國藥典》2015年版指導原則9101藥品質量標準分析方法驗證指導原則部 分，進行方法學驗證試驗，其中耐用性考察的色譜條件下包括流速±〇 .lmL/min、柱溫± 5 °C、流動相比例± 2 %、波長± 2nm。結果見表2 〇
[0059]表2
[0060]
[0061] 對比例
[0062]參考W02013/052157A的方法，將酸水相替換為更為常用的0.2%甲酸+0.1%三氟 乙酸的溶液，同時，將UPLC下的方法轉化成HPLC。
[0063] (1)檢測條件
[0064] 儀器:waters2695高效液相色譜儀，2996PDA檢測器，檢測波長：260nm;
[0065]色譜柱:Phenomenex C18(250mmX4.6mm，5ym)色譜柱；
[0066]稀釋劑:30%乙腈；
[0067] 流動相:0.2 %甲酸+0.1 %三氟乙酸的酸水溶液(取2ml的甲酸和1ml的三氟乙酸溶 液混勻于l〇〇〇ml水中）為流動相A，乙腈為流動相B;
[0068]流速：1 .Oml/min;
[0069] 柱溫:40°C;
[0070]進樣量:10uL;
[0071]按表3進行線性梯度洗脫程序。
[0072]表 3
[0073]
[0074]精密量取實施例1的供試品溶液10yL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖3。結果 表明：在圖9中，各峰為馬來酸(tR = 2.5min)、順式異構體RCl(tR = 7.287min)、阿法替尼API (tR=17.419min)、RC3(tR=10.593min)，且RC4和兩個未知雜質峰相互交叉重疊，分離度為 0.432min。
【主權項】
1. 一種阿法替尼及其有關物質的檢測方法，其特征在于，在高效液相色譜儀上進行梯 度洗脫，色譜柱為十八烷基鍵合硅膠色譜柱，流動相為含0.2%甲酸、0.1%三氟乙酸的水溶 液為流動相A，乙腈為流動相B，檢測波長為255nm~265nm，柱溫為35-45°C，其中，梯度洗脫 條件如下，2. 根據權利要求1的檢測方法，其特征在于，所述有關物質是阿法替尼的順式異構體。3. 根據權利要求1的檢測方法，其特征在于，所述十八烷基鍵合硅膠色譜柱為 Phenomenex C18(250mmX4.6mm，5ym) 〇4. 根據權利要求1或2的檢測方法，其特征在于，所述檢測波長為260nm。5. 根據權利要求1或2的檢測方法，其特征在于，所述柱溫為40°C。6. 根據權利要求1或2的檢測方法，其特征在于，所述流速為1.0 mL/min。7. 根據權利要求1或2的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法的稀釋劑選自水，30%乙 腈，乙腈，甲醇，或體積比為85:15的含0.2%甲酸、0.1 %三氟乙酸的水溶液：乙腈的混合溶 液。
【專利摘要】本發明涉及一種阿法替尼及其有關物質，尤其是其順式異構體的檢測方法。該方法是在高效液相色譜儀上進行梯度洗脫，色譜柱為Phenomenex？C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動相為含0.2％甲酸、0.1％三氟乙酸的水溶液為流動相A，乙腈為流動相B，檢測波長為255nm～265nm，柱溫為35-45℃；在一定的條件下進行梯度洗脫。該方法能夠有效地分離和檢測阿法替尼及其有關物質，尤其是其順式異構體。
【IPC分類】G01N30/02
【公開號】CN105424842
【申請號】CN201511004462
【發明人】鄭永亮, 張艷俠, 郝福, 康旺, 余大海
【申請人】河北神威藥業有限公司
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年12月29日