一種鑒定γδT細胞殺傷的方法
【技術領域】
[0001]本發明是細胞免疫學技術領域，具體是運用流式細胞原理檢測通過雙標法標記Calcein 一 AM和PI染色的方法鑒定γ δ Τ細胞殺傷效率。
[0002]發明背景
Τ淋巴細胞根據表達Τ細胞抗原受體(T cell receptor, TCR)的不同分為兩類:RCRa β細胞和TCRy δ細胞，其中γ δ Τ細胞是一個橋連接固有免疫和適應性免疫的獨特的一群Τ淋巴細胞，γ δ Τ主要分布于皮膚和黏膜組織中，占外周淋巴細胞群的0.5 - 5%，這樣一群細胞在機體抗感染和抗腫瘤免疫中發揮著重要的作用，目前已經臨床實驗證實了γ δ τ細胞在腫瘤的生物治療中已經得到良好的治療效果和廣泛的應用，但是如何對體外擴增培養的的γ st細胞進行功能性的檢測？本發明就針對這一項進行公開的闡述，免疫細胞殺傷實驗的經典的檢測方法是用51Cr釋放法，但是由于51Cr是放射性物質，操作起來不方便等原因限制了這一個方法的廣泛應用，而MTT法和乳酸脫氫酶(LDH)釋放法都存在靈敏度不高等原因也限制了其廣泛應用，本發明就是運用calcein — AM和PI雙標染色法結合流式細胞儀上檢測免疫細胞殺傷效率。本方法優點是操作簡單，準確，經濟，快速，并能得到很好的穩定性。對于其他所有免疫細胞的功能性鑒定提供的十分重要的價值。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是為了提供一種簡單快速檢測γ δ τ細胞的殺傷性功能的方法，通過流式細胞儀上可以快速檢測出細胞的殺傷效率的方法，克服經典的51Cr的放射性物質的污染和MTT，LDH的方法的靈敏度低的限制條件。
[0004]本發明所采用的技術方案是:一種簡單快速檢測γ δ Τ細胞的殺傷性功能的方法，包括以下步驟:
(1)制備外周血單個核細胞:采取健康志愿者的外周血，肝素鈉抗凝，應用淋巴細胞分離液進行密度梯度分離得到單個核細胞，用GT-T551培養基或者RPMI1640培養基重懸細胞。
[0005](2)誘導培養γ δ τ細胞:重懸好的細胞沉淀，取少量進行細胞計數，調整濃度在(1 - 2)X106/ml，加入磷酸抗原HMBPP20ng/ml和rhIL_2因子1000IU/ml對細胞誘導，放37°C，5%C02培養箱培養至10 - 14天。
[0006](3) Calcein 一 AM標記腫瘤細胞:取對數生長期的KA562細胞，PBS洗滌1次，無血清RPMI1640培養基重懸，計數后調整細胞密度在(1 - 2)X106/ml，加入鈣黃綠素(Calcein-AM) 0.luM，37度染色30分鐘；PBS洗滌2次，離心后用無血清培養基重懸，計數后調整濃度在 4X105/ml，2X105/ml，lX105/ml，備用。
[0007](4)與γ δΤ細胞共培養:取第10天之后的γ ST，PBS洗滌1次，用無血清RPMI1640培養基重懸，計數，調整濃度在2X106/ml ;鋪24孔板，K562和γ δ T分別加入
0.5ml，使得終濃度為5:1，10:1，20:1，各孔分別設置3個復孔，另外設置空白對照孔，陽性對照孔各重復3個復孔，于37度培養箱共培養24小時后，收集細胞上流式細胞儀檢測細胞殺傷效率。
[0008](5)流式檢測細胞殺傷效率:共培養后24小時收集細胞到1.5mlEPPEND0RF管中，1500rpm離心5分鐘，沉淀用lOOulPBS重懸起來，加入PI (lmg/ml) 2ul到lOOul體系中，混勻，室溫放置15分鐘；上BD Accuri C6流式細胞儀檢測γ δ Τ細胞對Κ562的殺傷效率，設定空白管γ δΤ對照孔和Κ562陽性對照孔，對Κ562對照孔進行圈門，再打開另一窗口，FL-1和FL-2進行作圖，可直觀得到殺傷率Rat1 = UR%
(6)根據本發明，所述的培養基為GT-T551免疫細胞專用培養基，RPMI 一 1640用于腫瘤細胞培養的培養基，Calcein 一 AM購于Invitrogen公司，碘化丙錠(PI)購于Sigma公司。流式細胞儀Accuri?C6購于BD公司，Z2全自動細胞計數儀購于BeckmanCoulter公司。
[0009]本發明所用的原料和試劑除有特殊說明外，均市售可得。
【具體實施方式】
[0010]下面用實例具體說明本發明，但是本發明并不受其限制。下面實例中凡為注明具體條件的實驗方法，均為遵循常規方法和廠家提供的操作說明執行。
[0011]實施例1
本實施例1是用外周血提取PBMC制備γ δΤ細胞，包括以下步驟:
1.采取健康志愿者外周血，肝素納抗凝，用人淋巴細胞分離液Ficoll進行密度梯度分離獲得單個核細胞。具體步驟:510g/分，離心7分鐘，降速為2，離心完畢后，吸取上層血漿層，56度滅活30分鐘，510g/分，離心7分鐘，取上層血漿層轉到干凈的離心管備用。沉淀的血細胞用生理鹽水稀釋后，將Ficoll分離液與稀釋血液按照1:2的比例緩慢加入離心管中，轉到離心機上離心，680g/分，離心20分鐘，升降速度都調為1，離心完畢后，小心吸取白膜層，用生理鹽水洗滌2次，510g/分，離心7分鐘。最后沉淀用GT-T551培養基重懸沉淀，即可得到PBMC細胞。
[0012]2.將上述的PBMC細胞，取少量進行細胞計數，并用GT-T551培養基調整細胞濃度在(1 一 2) X106/ml，5ml/瓶種于Corning的T25培養瓶中，加入磷酸抗原激活劑和rhIL_2因子誘導γ ST細胞，于37度培養箱培養，每隔2 — 3天進行半量補加培養基，計數并維持細胞密度在(1 - 2)X106/ml，顯微鏡觀察細胞生長狀態，培養至10 — 15天，即可以進行細胞殺傷實驗的檢測。
[0013]實施例2
本實施例2利用上述的γ δΤ細胞檢測懸浮的腫瘤細胞Κ562的殺傷作用，具體步驟如下:
取對數生長期的Κ562細胞作為靶細胞，PBS洗滌1次，PBS重懸細胞沉淀，調整細胞濃度在(1 - 2) X106/ml，加入活細胞染色標記物鈣黃綠素(Calcein — AM) 0.luM于37度培養箱孵育30分鐘，染色結束后用PBS洗滌細胞2次，lOOOrpm離心5分鐘，最后一次離心，用無血清RPMI1640培養基重懸沉淀，計數后調整濃度為4X105，2X105，1X105，鋪板于24孔板里，每個孔對應添加500ul，使得每個孔的細胞濃度為2X105，lX105，5X104/ml。取γ δΤ細胞為效應細胞，PBS洗滌1次，用無血清RPMI1640培養基重懸細胞，計數，并調整細胞濃度在2Χ10%1，鋪板于24孔板，每個孔添加500ul，使得最后的效靶比為5:1，10:1，20:1，每孔重復3個復孔，并設置好對照孔，單效應細胞孔和單K562細胞孔，各重復3個復孔，于37度培養箱培養24小時，24小時后，收集細胞，PBS洗滌2次，加入PI染色15分鐘，上流式細胞儀檢測細胞殺傷活率。結果顯不本發明制備的γ δ T對Κ562具有尚效的殺傷活性，殺傷率平均為85%。
[0014]實施例3
本實施例3利用上述的γ δΤ細胞檢測貼壁的腫瘤細胞Α549的殺傷作用，具體步驟如下:
取對數生長期的Α549細胞作為靶細胞，PBS洗滌1次，PBS重懸細胞沉淀，調整細胞濃度在(1 一 2) X106/ml，加入活細胞染色標記物鈣黃綠素(Calcein — AM) luM于37度培養箱孵育30分鐘，染色結束后用PBS洗滌細胞2次，lOOOrpm離心5分鐘，最后一次離心，用無血清RPMI1640培養基重懸沉淀，計數后調整濃度為4X105，2X105，1X105，鋪板于24孔板里，每個孔對應添加500ul，使得每個孔的細胞濃度為2X105，lX105，5X104/ml。取γ δΤ細胞為效應細胞，PBS洗滌1次，用無血清RPMI1640培養基重懸細胞，計數，并調整細胞濃度在2Χ10%1，鋪板于24孔板，每個孔添加500ul，使得最后的效靶比為5:1，10:1，20:1，每孔重復3個復孔，并設置好對照孔，單效應細胞孔和單A549細胞孔，各重復3個復孔，于37度培養箱培養24小時，24小時后，收集細胞，仍有貼壁的細胞加入少量胰酶進行消化下來，離心收集細胞沉淀，PBS洗滌2次，加入PI染色15分鐘，上流式細胞儀檢測細胞殺傷活率。結果顯示本發明制備的γ δ T對Α549具有高效的殺傷活性，殺傷率平均為60%。
【主權項】
1.一種鑒定γ δ τ細胞的殺傷性方法，包括步驟: 1)采集健康志愿者外周血，運用人淋巴細胞分離液分離得到單個核細胞，加入磷酸抗原HMBPP 10-30ng/ml和rhIL_2因子500-1000IU/ml進行對PBMC誘導成γ δ T細胞并擴增培養； 2)在培養到第8-10天后開始對γδΤ細胞進行殺傷實驗的檢測，運用活細胞染料鈣黃綠素一 AM對腫瘤細胞染色，染色時的細胞密度要控制在105 — 10 7ml ; 3)染色之后與γδΤ細胞共培養一段時間收細胞，檢測前加入碘化丙錠染色，最后用流式細胞儀檢測死亡細胞數量，得出細胞的殺傷率。2.根據權利要求1所述鑒定γδ Τ細胞殺傷的方法，其特征在于:所述γ δ Τ細胞細胞的殺傷性驗證保護。3.根據權利要求1所述鑒定γδ Τ細胞殺傷的方法，其特征在于:對所述腫瘤細胞經過calcein — AM染色的條件保護。4.根據權利要求1所述鑒定γδ Τ細胞殺傷的方法，其特征在于:對所述腫瘤細胞與效應細胞共培養時所設計的條件的實驗方法的保護。
【專利摘要】本發明公開了一種簡單快速鑒定γδT細胞的殺傷性方法，包括步驟：1）采集健康志愿者外周血，運用人淋巴細胞分離液分離得到單個核細胞，加入磷酸抗原HMBPP？10-30ng/ml和rhIL-2因子500-1000IU/ml進行對PBMC誘導成γδT細胞并擴增培養；2）在培養到第8-10天后開始對γδT細胞進行殺傷實驗的檢測，運用活細胞染料鈣黃綠素－AM對腫瘤細胞染色，染色時的細胞密度要控制在105－107/ml；3）染色之后與γδT細胞共培養一段時間收細胞，檢測前加入碘化丙錠染色，最后用流式細胞儀檢測死亡細胞數量，得出細胞的殺傷率。本發明通過流式細胞儀上可以快速檢測出細胞的殺傷效率的方法，克服經典的51Cr的放射性物質的污染和MTT，LDH的方法的靈敏度低的限制條件。
【IPC分類】G01N15/14
【公開號】CN105424582
【申請號】CN201511013848
【發明人】饒秀茸, 崔博靖, 付凡, 馬飛, 王宇環
【申請人】深圳市合一康生物科技股份有限公司
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年12月31日