用于區分惡性漿膜腔積液中間皮細胞與癌細胞的酸性磷酸酶染色法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及輔助診斷領域，具體涉及一種用于區分惡性漿膜腔積液中間皮細胞與癌細胞的酸性磷酸酶染色法、相關試劑及其應用。
【背景技術】
[0002]漿膜腔是漿膜壁層和臟層之間的間隙，分為胸膜腔、腹膜腔、心包腔等。腔內有少許漿液，起潤滑作用，病理情況下可增多，形成胸水、腹水、心包積液等。臨床送檢的漿膜腔積液均屬病理性，漿膜腔積液內的細胞成分包括間皮細胞、非上皮來源的血液細胞，還可能存在腫瘤細胞。良性病變(如肺炎、肺梗死、流感、肝膿腫、結核病、心衰等等)或惡性病變(肺癌、乳腺癌、惡性淋巴瘤、惡性間皮瘤、卵巢癌、宮頸癌、子宮內膜癌、消化系統腫瘤等等)都可以引起漿膜腔積液。
[0003]2014年世衛組織最新數據顯示，肺癌已成為中國癌癥死因之首，同時也是中國男性最常見的癌癥，2014年中國有超過60萬人死于肺癌。約50%以上的肺癌患者在疾病過程中將出現胸腔積液。9年來前六位的腫瘤分別是:肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、結直腸肛門癌、乳腺癌，占所有報告病例的65%以上。引起惡性腹水的原發病以卵巢癌和肝癌最常見，占30%?54%，其他可由胃腸道腫瘤、胰腺癌、子宮癌等引起，10%?15%胃腸道腫瘤可發生惡性腹水，腹腔外惡性腫瘤如乳腺癌、肺癌和淋巴瘤等也可引起。此外，15-20%的患者原發病灶不明。而臨床的隨機胸腹水樣本中，25%左右為惡性。
[0004]脫落細胞學檢查因具有快速、簡便、易行、可重復檢查以及患者痛苦少等優點，在臨床上得以廣泛應用，目前是惡性胸腹水診斷的基本方法。細胞學檢查依據細胞的形態學特征作出判斷，而漿膜腔中的間皮細胞由于增生、變性等原因導致形態多樣，僅通過巴氏染色從形態上不容易與癌細胞區分，所以漿膜腔積液的脫落細胞學檢查經常存在較低的敏感性(40% -60% )，經驗不足的病理醫生甚至無法做出判斷。因此如何減少漿膜腔積液細胞學診斷的假陰性、假陽性率，避免漏診、誤診，提高陽性率具有重要的實際意義，這也是目前亟待解決的問題。
【附圖說明】
[0005]圖1鱗狀細胞癌患者胸水染色結果:圖中右側見數個鱗癌細胞呈片狀排列，細胞大小不等，核形不規則，呈陰性反應。而左側反應性間皮細胞呈強陽性反應，細胞質中出現紅色顆粒。
[0006]圖2腺癌患者腹水染色結果:圖中左上及左下兩團腺腔樣排列的腺癌細胞，呈陰性反應，而周圍反應性間皮細胞呈強陽性反應，淋巴細胞酸性磷酸酶染色為陰性。
[0007]圖3肺小細胞癌患者心包積液染色結果:圖中央數個小細胞型癌細胞擁擠樣排列，呈陰性反應，而周圍散在分布的反應性間皮細胞呈強陽性反應。
【發明內容】
[0008]本發明以酸性磷酸酶催化的特異性反應為基礎，在細胞質中生成的紅色顆粒為標記，從分子層次區分間皮細胞和癌細胞，本發明的方法操作簡便，穩定性好，保證了診斷的特異性和靈敏度。同時能夠幫助醫生迅速找到病變細胞，醫生在診斷時只需觀察酸性磷酸酶陰性的細胞進行形態學觀察，減少醫生的工作量。
[0009]經過長時間的研究和分析，我們發現，使用酸性磷酸酶染色法，能夠將惡性漿膜腔積液中的間皮細胞染成紅色(即間皮細胞為酸性磷酸酶染色陽性)，而惡性腫瘤細胞不能被染色(即惡性腫瘤細胞為酸性磷酸酶染色陰性)。通過對惡性漿膜腔積液脫落細胞染色可以將間皮細胞和惡性腫瘤細胞明顯區分，能夠幫助醫生迅速準確的找到惡性腫瘤細胞，并借此進一步作出診斷，極大提高了診斷的準確性，尤其對于形態、大小均與間皮細胞極為相似的惡性腫瘤細胞，該染色方法能夠將兩者顯著區分，有助于醫生進行下一步的具體診斷和得出準確的診斷結果。
[0010]且在研究過程中研究人員發現，使用10%福爾馬林溶液用作固定液能夠清除漿膜腔積液中紅細胞，避免了紅細胞對醫生診斷造成影響，而使用其他成分的固定液卻不能達到有效清除紅細胞的效果。
具體實施例
[0011]實施例1:
[0012]—、酸性磷酸酶染色試劑盒成分:
[0013](1)固定液:5-10%福爾馬林
[0014](2)染色液:5-20g/l萘酚AS-ΒΙ磷酸鹽溶于二甲基甲酰胺
[0015](3)鹽酸品紅:2-10%鹽酸品紅
[0016](4)亞硝酸鈉:0.1-0.4M NaN02
[0017](5)醋酸鈉溶液:2-5M，pH 4.5-5.5
[0018](6)蒸餾水
[0019](7)核復染液:蘇木素2.5g，無水酒精20ml，硫酸鋁鉀5g，蒸餾水330ml，碘酸鈉250mg，甘油 150ml，冰醋酸 10ml。
[0020]此外，上述試劑盒中還可以包含酶標液基細胞學保存液，其具體組成如下所示:
[0021](1)15% 甲醇
[0022](2) 0.1mM EDTA
[0023](3) 0.1mM NaCl
[0024](4) 0.01M 醋酸鈉緩沖液，pH 5.2
[0025](5)5% Proclin 300
[0026](6)dd H20o
[0027]二、染色步驟:
[0028](1)細胞涂片制片:常規抽取的胸腹水或心包積液約15ml，2000rpm離心lOmin，小心移去上清，取上層細胞涂片，待細胞半干；
[0029]或液基細胞制片:常規抽取的胸腹水或心包積液約15ml，2000rpm離心lOmin，小心移去上清，應用酶標液基細胞學保存液洗滌并制片，待細胞半干；
[0030](2)固定:半干的細胞涂片置于固定液中常溫固定4min，可以去除紅細胞；
[0031](3)自來水流水沖洗2min;
[0032](4)酸性磷酸酶染色:25ml蒸餾水中加入0.5ml鹽酸品紅溶液、1.5ml萘酚溶液、
0.5ml亞硝酸鈉溶液、1.5ml醋酸鈉溶液，作為酸性磷酸酶染色液，將細胞涂片置于上述酸性磷酸酶染色液中，37攝氏度染色5-10min ;
[0033](5)自來水流水沖洗2min;
[0034](6)核復染液中染色5min ；
[0035](7)自來水流水沖洗2min;
[0036](8)徹底風干后中性樹膠封片。
[0037]三、染色結果:
[0038]固定液兼有破碎紅細胞功能，紅細胞被去除，背景干凈，易于觀察；研究中，研究人員使用其他固定液對漿膜腔積液同樣進行上述染色方法，結果表明，使用其他固定液并不能夠去除紅細胞，造成較大的背景污染，對診斷檢查造成困擾。
[0039]同時，圖1-3結果表明，漿膜腔積液中間皮細胞酸性磷酸酶表達水平高，染色陽性，在細胞質中出現大量紅色顆粒；腫瘤細胞、淋巴細胞、白細胞酸性磷酸酶染色陰性，所有細胞的細胞核呈藍色。新鮮或保存較好的樣本中間皮細胞染色更強。說明本發明的染色方法能夠顯著的將漿膜腔積液中的間皮細胞與惡性腫瘤細胞等區分開來，有助于醫生做出準確的醫學診斷結果。
[0040]四、臨床研究結果:
[0041]中國醫科大學第一附屬醫院和安徽省立醫院的臨床研究結果有力的證明了產品敏感性高、特異性強、假陰性率低的特點。我們在2014年至2015年期間從中國醫科大學第一附屬醫院和安徽省立醫院就診的門診病人隨機收集病例151例，最終的組織學結果確認31例為惡性漿膜腔積液，120例為非惡性。其中中國醫科大學第一附屬醫院取得病例101例，應用細胞涂片制片；而安徽省立醫院取得50例，應用液基制片法制片。所有樣本按照上述酸性磷酸酶染色法與普通巴氏染色法對照進行細胞學檢查，將所有樣本交由5位經驗豐富的病理醫生先后進行診斷。細胞學診斷結果是，應用酸性磷酸酶染色準確率為96±4%，平均用時2.25小時，巴氏染色為73 ± 17 %，平均用時3.75小時。酸性磷酸酶染色法在鑒定惡性漿膜腔積應用中液顯示出明顯的優越性。
【主權項】
1.一種用于區分惡性漿膜腔積液中間皮細胞與癌細胞的酸性磷酸酶染色試劑盒，所述試劑盒包括固定液、染色液、鹽酸品紅、亞硝酸鈉、醋酸鈉溶液、核復染液、蒸餾水。2.權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒的具體組成如下所示: (1)固定液:5-10%福爾馬林 (2)染色液:5-20g/l，萘酚AS-ΒΙ磷酸鹽溶于二甲基甲酰胺 (3)鹽酸品紅:2-10%鹽酸品紅(4)亞硝酸鈉:0.1-0.4M NaN02 (5)醋酸鈉溶液:2-5M，pH4.5-5.5 (6)蒸餾水 (7)核復染液:蘇木素2.5g，無水酒精20ml，硫酸鋁鉀5g，蒸餾水330ml，碘酸鈉250mg，甘油150ml，冰醋酸10ml。3.權利要求1-2任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括酶標液基細胞保存液，所述酶標液基細胞保存液的具體組成如下所示: (1)15%甲醇(2)0.1mM EDTA(3)0.1mM NaCl (4)0.01M醋酸鈉緩沖液，pH 5.2(5)5%Proclin 300(6)ddH20o4.權利要求1-3任一項所述的試劑盒在制備用于區分惡性漿膜腔積液中間皮細胞與癌細胞的輔助診斷試劑中的用途。5.使用權利要求1-3任一項所述的試劑盒區分惡性漿膜腔積液中間皮細胞與癌細胞的酸性磷酸酶染色方法，其特征在于:所述方法的步驟如下: (1)細胞涂片制片:常規抽取的胸腹水或心包積液約15ml，2000rpm離心lOmin，小心移去上清，取上層細胞涂片，待細胞半干； 或液基細胞制片:常規抽取的胸腹水或心包積液約15ml，2000rpm離心lOmin，小心移去上清，應用酶標液基細胞學保存液洗滌并制片，待細胞半干； (2)固定:半干的細胞涂片置于固定液中常溫固定4min，可以去除紅細胞； (3)自來水流水沖洗2min; (4)酸性磷酸酶染色:25ml蒸餾水中加入0.5ml鹽酸品紅溶液、1.5ml萘酚溶液、0.5ml亞硝酸鈉溶液、1.5ml醋酸鈉溶液，作為酸性磷酸酶染色液，將細胞涂片置于上述酸性磷酸酶染色液中，37攝氏度染色5-10min ; (5)自來水流水沖洗2min; (6)核復染液中染色5min； (7)自來水流水沖洗2min; (8)徹底風干后中性樹膠封片。
【專利摘要】本發明涉及輔助診斷領域，具體涉及一種用于區分惡性漿膜腔積液中間皮細胞與癌細胞的酸性磷酸酶染色法、相關試劑及其應用。本發明的染色方法能夠去除樣品中的紅細胞，消除背景影響，同時，能夠將間皮細胞和惡性腫瘤細胞明顯區分，幫助醫生迅速準確的找到惡性腫瘤細胞，并借此進一步作出診斷，極大提高了診斷的準確性。
【IPC分類】G01N1/30
【公開號】CN105424448
【申請號】CN201510760630
【發明人】吳廣平, 王陽, 方圣云, 方圣文
【申請人】合肥錦慈康生物技術有限公司
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年11月6日