一種福爾馬林固定組織非靶標代謝組學研究的樣品前處理方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種福爾馬林固定組織非靶標代謝組學研究的樣品前處理方法，特別涉及一種以UPLC-Q-TOF MSMS為分析平臺的新的、簡便的、能同時提取福爾馬林固定組織中極性和非極性代謝產物的樣品前處理方法。
【背景技術】
[0002]非靶標代謝組學可利用一系列的技術手段和檢測方法全面考察生物體系受刺激或擾動后，代謝物濃度和種類的動態變化，觀察機體的代謝途徑的變化和機體相對應的生理病理改變。代謝組學研究樣本包括體液樣本，如血液、尿液和唾液等；組織樣本，如肝臟組織、腎臟等。組織代謝組學是代謝組學的重要組成部分，與其他體液組學相比，更能清楚了解病變組織的病理生理變化。目前認為，組織代謝組學研究最好選用新鮮組織，但新鮮組織獲得有一定困難。福爾馬林固定組織是一種比較方便、常見的組織保存方式。尤其是關于腫瘤組織的研究，臨床病理科通常將術中切下的組織在10%福爾馬林中固定后制成石蠟切片進行檢查。因此，腫瘤研究工作中所獲得的樣本絕大部分為病理檢查剩余的福爾馬林固定的組織。
[0003]目前，有關新鮮或冰凍組織、福爾馬林-石蠟包埋組織的代謝組學研究的樣本前處理方法已有報道，但沒有福爾馬林固定樣本的非靶標代謝組學研究的前處理方法。不能從福爾馬林固定組織樣本中同時提取極性和非極性物質，不能滿足代謝組學分析組織中所有代謝產物的需求，不能全面系統的觀察組織代謝改變的具體變化和差異。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是提供一種簡便的能同時提取福爾馬林固定組織中的極性和非極性代謝產物的樣品前處理的方法。
[0005]本發明的一種福爾馬林固定組織非靶標代謝組學研究的樣品前處理方法，其特征在于包括以下步驟:
[0006](1)取出浸泡于福爾馬林組織浸泡液中的組織，放入研缽中加液氮研磨，充分研磨組織后，用甲醇充分溶解已研磨的組織，提取組織中的代謝物質并同時沉淀組織蛋白；
[0007](2)將步驟(1)中的所有溶液全部轉移至離心管中，渦旋1-5分鐘后，4°C下10000-12000rpm離心10-15分鐘，取上清液；
[0008](3)將步驟(2)得到的上清液轉移至另外一個離心管中，氮氣吹干，剩余固體殘余物以備重新復溶；
[0009](4)用甲醇和福爾馬林組織浸泡液的混合溶液復溶步驟(3)中的剩余固體殘余物，渦旋1-5分鐘，靜置5-10分鐘后，4°C下，10000-12000rpm離心10-15分鐘；
[0010](5)移取步驟(4)的上清液，即為處理后的福爾馬林固定組織非靶標代謝組學研究樣品。
[0011]在本發明中，優選的，甲醇和福爾馬林組織浸泡液的混合溶液中甲醇和福爾馬林組織浸泡液的體積比為1:1。
[0012]其中，所述的福爾馬林組織浸泡液是指臨床上固定腫瘤組織的質量分數為5%?15%的甲醛水溶液。
[0013]相較于現有技術，本發明的優點在于:
[0014]1、采用液氮研磨組織，甲醇提取組織中的代謝產物并沉淀蛋白，操作簡單易行；
[0015]2、用甲醇和福爾馬林組織浸泡液的混合溶液(優選按照體積比1:1)復溶氮吹殘留物(步驟4)，好處在于:組織在福爾馬林組織浸泡液中長期浸泡，組織中的大多數極性代謝產物和少量非極性代謝產物溶于福爾馬林組織浸泡液中，直接取福爾馬林組織浸泡液和甲醇混合溶液復溶氮氣吹干殘留物，節省極性物質提取步驟，減少操作步驟和實驗誤差。
[0016]3、溶液多次經高速離心，盡可能的除掉了蛋白質等大顆粒物質對色譜柱的影響，不經濾膜過濾，可直接進行色譜分離和檢測。
[0017]4、本發明的一種福爾馬林固定組織非靶標代謝組學研究的樣品前處理方法能夠直接使用福爾馬林固定組織進行組織非靶標代謝組學分析研究，解決了組織樣本采集和保存中遇到的難題，方法簡單快速。能同時提取組織中的極性和非極性物質，可以檢測到更多的組織中的代謝產物，更有利于全面的觀察組織代謝或病理的變化，推動組織非靶標代謝組學的進展。同時發現更可靠的差異代謝產物及生物標志物，有助于后期生物標志物的驗證及相應檢測試劑盒的開發。
【附圖說明】
[0018]圖1為采用本發明的樣品前處理方法得到的大腸腫瘤組織提取液總離子流色譜圖；
[0019]圖2為采用對比例方法得到的大腸腫瘤組織提取液總離子流色譜圖。
【具體實施方式】
[0020]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0021]實施例1福爾馬林固定組織非靶標代謝組學研究樣品的前處理
[0022]按照以下方法進行:
[0023]1.取浸泡于福爾馬林組織浸泡液(10% )中的大腸腫瘤組織100毫克，放入研缽中加液氮研磨，充分研磨組織，用2毫升甲醇充分溶解已研磨的組織，提取組織中的代謝物質并同時沉淀組織蛋白；
[0024]2.將步驟1所有溶液全部轉移至2毫升離心管，渦旋2分鐘后，4°C下12000rpm離心10分鐘；
[0025]3.取上清溶液于另外一個2毫升離心管中，氮氣吹干，剩余固體殘余物，以備重新復溶；
[0026]4.用體積比1:1混合的甲醇和福爾馬林組織浸泡液(10% )的混合溶液400微升復溶步驟3氮氣吹干物質，渦旋2分鐘，靜置10分鐘后，4°C下，12000rpm離心10分鐘；
[0027]5.移取步驟4上清溶液，即為處理后的福爾馬林固定組織非靶標代謝組學研究樣品Ο
[0028]實施例2前處理后樣品的質譜檢測(ULPLC/Q-TOF MSMS)
[0029]1、試劑
[0030]乙腈，甲醇(色譜純)，甲酸(色譜純)，超純水水由純水儀制取。
[0031]2、色譜分離條件:
[0032]液相色譜為美國Waters公司Acquity超高效液相色譜系統。色譜柱為(BEH)C18柱(1.8μπι，2.lXlOOmm)。液相色譜條件:流動相A為雙蒸水(0.1 %的甲酸溶液)，流動相B為乙腈，流速為0.35mL/min.以線性梯度洗脫，起始梯度為2 %乙腈并維持 0.5min, 0.5-1.5min 乙臆 2 % -20 %，1.5-6.0min 乙臆 20 % -70 %，6.0-10.0min 乙臆70% -98%, 10.0-12.0min乙腈98%維持2min，然后2min內乙腈含量降回2%，平衡色譜柱2min。每次進樣量為2 μ L，柱溫35°C，自動進樣器溫度維持在4°C。
[0033]3、質譜檢測條件:
[0034]質譜儀為Waters公司Micromass Q-T0F串聯四極桿-飛行時間質譜儀，配有電噴霧離子源(ESI)。質譜以正離子模式進行檢測，正離子模式條件為:毛細管電壓3000V ;錐孔電壓35V ;碰撞勢能6eV ;脫溶劑氣流速650L/h ;錐孔氣流速50L/h ;脫溶劑溫度320°C;源溫度110°c。使用全掃描模式，質量范圍為50 - lOOOamUo以Lock Spray的Centroid模式收集數據來確保準確性和重現性；以200pg/ml濃度的亮氨酸腦啡肽(固定質荷比556.2771)作單點校正，流速8 μ L/min。lock spray頻率為0.48s，亮氨酸腦啡肽平均掃描超過10次以作校正。
[0035]4、樣品:經實施例1方法處理后的福爾馬林固定組織非靶標代謝組學研究樣品。
[0036]5、結果
[0037]福爾馬林固定組織非靶標代謝組學研究樣品提取液的總離子流色譜圖，如圖1所不ο
[0038]對比例
[0039]為了說明本發明的樣品前處理方法能夠同時提取更多的極性和非極性的物質，本發明進行了以下對比試驗，按照以下方法進行:
[0040]1.取浸泡于福爾馬林組織浸泡液(10% )中的大腸腫瘤組織組織100毫克，放入研缽中加液氮研磨，充分研磨組織，用2毫升甲醇充分溶解已研磨的組織，提取組織中的代謝物質并同時沉淀組織蛋白；
[0041]2.將步驟1所有溶液全部轉移至2毫升離心管，渦旋2分鐘后，4°C下12000rpm離心10分鐘；
[0042]3.取上清溶液于另外一個2毫升離心管中，氮氣吹干，剩余固體殘余物，以備重新復溶；
[0043]4.用400微升甲醇復溶步驟3氮氣吹干物質，渦旋2分鐘，靜置10分鐘后，4°C下，12000rpm離心10分鐘；
[0044]5.移取步驟4上清溶液，即為處理后的福爾馬林固定組織非靶標代謝組學研究樣品Ο
[0045]色譜分離條件和質譜檢測條件一樣。
[0046]結果:采用對比例方法處理的福爾馬林固定組織非靶標代謝組學研究樣品的質譜圖如圖2所示，通過對比圖1和圖2可以發現，采用本發明的樣品前處理方法能同時提取組織中的極性和非極性物質，因此可以檢測到更多的組織中的代謝產物。
【主權項】
1.一種福爾馬林固定組織非靶標代謝組學研究的樣品前處理方法，其特征在于包括以下步驟: (1)取出浸泡于福爾馬林組織浸泡液中的組織，放入研缽中加液氮研磨，充分研磨組織后，用甲醇充分溶解已研磨的組織，提取組織中的代謝物質并同時沉淀組織蛋白； (2)將步驟(1)中的所有溶液全部轉移至離心管中，渦旋1-5分鐘后，4°C下10000-12000rpm離心10-15分鐘，取上清液； (3)將步驟(2)得到的上清液轉移至另外一個離心管中，氮氣吹干，剩余固體殘余物以備重新復溶； (4)用甲醇和福爾馬林組織浸泡液的混合溶液復溶步驟(3)中的剩余固體殘余物，渦旋1-5分鐘，靜置5-10分鐘后，4°C下，10000-12000rpm離心10-15分鐘； (5)移取步驟(4)的上清液，即為處理后的福爾馬林固定組織非靶標代謝組學研究樣品Ο2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:甲醇和福爾馬林組織浸泡液的混合溶液中甲醇和福爾馬林組織浸泡液的體積比為1:1。
【專利摘要】本發明公開了一種福爾馬林固定組織非靶標代謝組學研究的樣品前處理方法。采用本發明的方法能夠直接使用福爾馬林固定組織，以UPLC-Q-TOF？MSMS為分析平臺進行組織代謝組學分析研究，解決了組織樣本采集和保存中遇到的難題，方法簡單快速。此外，采用本發明方法能同時提取組織中的極性和非極性物質，可以檢測到更多的組織中的代謝產物，更有利于全面的觀察組織代謝或病理的變化，同時發現更可靠的差異代謝產物及生物標志物，從而推動組織非靶標代謝組學的進展，并且有助于后期生物標志物的驗證及相應檢測試劑盒的開發。
【IPC分類】G01N1/28
【公開號】CN105424429
【申請號】CN201510741890
【發明人】王帆, 趙亞雙, 于燕明, 宮晨
【申請人】哈爾濱醫科大學
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年11月4日