一種銅離子檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分析化學領域，涉及一種銅離子檢測方法和檢測試劑盒，尤其涉及一種基于點擊化學和等溫信號擴增用于銅離子的檢測方法和檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]銅離子(Cu2+)是生物體必須的微量元素之一，過高或過低的Cu2+將會對生物體產生有害影響。Cu2+過量通常是由于環境重金屬離子污染造成的，通過食物鏈在生物體富集，影響肝腎的正常代謝，造成神經退行性疾病以及引發癌癥。因此，對Cu2+檢測在生態環境保護以及食品安全方面具有重要意義，美國環境保護署規定飲用水中Cu2+濃度不能超過20mM。傳統的Cu2+檢測方法主要是石墨烯原子吸收光譜法以及電感耦合等離子體質譜法等。然而這些方法使用的儀器昂貴，需要專業的操作人員，限制了它們在基層實驗室的使用。因此，有必要構建一種操作檢測、經濟便宜、靈敏度高的Cu2+檢測方法和檢測試劑盒。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在于提供一種基于點擊化學和等溫信號擴增用于銅離子的檢測方法和檢測試劑盒。
[0004]本發明所采取的技術方案是:
一種銅離子檢測試劑盒，包括還原劑、dNTP、聚合酶、檢測核酸序列和緩沖體系，檢測核酸序列由核酸序列A、B、C、D組成，其中:
核酸序列A為莖環結構DNA，兩端分別修飾熒光基團和淬滅基團；
核酸序列B和C分別和核酸序列A環結構左右兩側序列互補配對，其配對后相鄰的兩端分別修飾有疊氮基團和炔基基團；
核酸序列D為核酸序列A的引物序列。
[0005]作為上述銅離子檢測試劑盒的進一步改進，核酸序列A的莖桿長度為6?9bp。
[0006]作為上述銅離子檢測試劑盒的進一步改進，核酸序列A的環長度為16?24個堿基。
[0007]作為上述銅離子檢測試劑盒的進一步改進，核酸序列B和C的長度差不超過4個堿基。更佳的，核酸序列B和C的長度相同或相差一個堿基。
[0008]作為上述銅離子檢測試劑盒的進一步改進，還原劑選自維生素C、抗壞血酸鹽、檸檬酸鹽。
[0009]作為上述銅離子檢測試劑盒的進一步改進，緩沖體系為Tris-HCl緩沖液、PBS緩沖液、HEPES緩沖液、MOPS緩沖液。
[0010]本發明的有益效果是:
(1)基于點擊化學檢測銅離子，只需要在兩段核酸序列分別修飾疊氮基團和炔基基團即可，無需銅離子特異的核酸酶，穩定性好，背景值低。
[0011](2)基于聚合酶等溫信號放大，可在室溫下完成反應，無需溫度控制，操作簡單，擴增高效，可實現高靈敏銅離子檢測。
[0012](3)選擇性好，抗干擾能力強，成本低廉且無毒害，實用性強，能用于環境樣品的檢測分析。
【附圖說明】
[0013]圖1為本發明所述的檢測方法的原理圖；
圖2為對不同濃度的Cu2+檢測的結果圖；
圖3為特異性實驗結果圖。
【具體實施方式】
[0014]一種銅離子檢測試劑盒，包括還原劑、dNTP、聚合酶、檢測核酸序列和緩沖體系，檢測核酸序列由核酸序列A、B、C、D組成，其中:
核酸序列A為莖環結構DNA，兩端分別修飾熒光基團和淬滅基團；
核酸序列B和C分別和核酸序列A環結構左右兩側序列互補配對，其配對后相鄰的兩端分別修飾有疊氮基團和炔基基團；
核酸序列D為核酸序列A的引物序列。
[0015]作為上述銅離子檢測試劑盒的進一步改進，核酸序列A的莖桿長度為6?9bp，優選為7bp。這是因為序列過短的話難以成環，過長的話，難以打開莖環結構。
[0016]作為上述銅離子檢測試劑盒的進一步改進，核酸序列A的環長度為16?24個堿基，優選為20個堿基。這是因為序列過短的話難以成環，過長的話，難以打開莖環結構。
[0017]作為上述銅離子檢測試劑盒的進一步改進，核酸序列B和C的長度差不超過4個堿基。更佳的，核酸序列B和C的長度相同或相差一個堿基。這樣可以更好地保證核酸序列B和C與環區的結合力相近，保證其可以更好地反應。
[0018]核酸序列D的堿基數為8-12個，優選的為9個。
[0019]還原劑的作用在于將Cu2+還原為Cu +，一般選用弱還原劑。作為上述銅離子檢測試劑盒的進一步改進，還原劑選自維生素C、抗壞血酸鹽、檸檬酸鹽。
[0020]作為上述銅離子檢測試劑盒的進一步改進，緩沖體系為Tris-HCl緩沖液、PBS緩沖液、HEPES緩沖液、MOPS緩沖液。
[0021]本發明檢測試劑的原理如圖1所示，具體如下:
1)核酸A是一種莖環結構DNA，兩端分別修飾熒光基團和淬滅基團。在A溶液中加入疊氮基團修飾的核酸B以及炔基基團修飾的核酸C，充分混勻。此時，B和C分別與A的環部分雜交，但由于B和C無法連在一起，A保持莖環結構狀態。熒光處于淬滅狀態，熒光強度較弱；
2)加入銅離子以及抗壞血酸鈉溶液，充分混勻，二價銅離子會被還原成一價銅離子，一價銅離子可催化疊氮基團和炔基基團進行環加成反應，形成一個三唑五元環，從而把B和C連接在一起，形成一條完成的核酸鏈，從而把A的莖環結構打開，熒光基團和淬滅基團分開，發出較強的焚光；
3)加入核酸D作為引物序列，在dNTP和聚合酶的作用，可以以打開后的A為模板進行聚合反應，從而把B-C置換下來，B-C又可以重新和A雜交，從而可以不斷的打開A，到達信號放大的目的，形成較強的熒光強度，銅離子濃度與熒光強度呈正相關，從而可以達到高靈敏檢測銅離子的目的。
[0022]下面結合實施例，進一步說明本發明的技術方案。
[0023]一種銅離子的檢測試劑盒，包括以下成分:
核酸序列A、B、C、D，其中A的兩端分別修飾熒光基團(FAM)和淬滅基團(DABCYL) ；B的一端修飾疊氮基團(N3) ;C的一端修飾炔基基團(CH = CH)。具體序列如下:
A:5 ’ - (DABCYL)-CCTCTCTGTGTCTCGTGGCTTCCCGTCAGAGAGG-(FAM)~3’ (SEQ ID NO:1)，下劃線標記的部分為莖環結構的莖桿區，中間序列為環區；
B:5’ -CACGAGACAC-N3-3’ (SEQ ID NO:2);
C:5> -CH = CH-GACGGGAAGC-3’ (SEQ ID NO:3)
D:5’ -CCTCTCTGA-3’ (SEQ ID NO:4)。
[0024]抗壞血酸鈉標準溶液。
[0025]dNTPs和核酸聚合酶。
[0026]20 mM Tris-HCl 緩沖液(ρΗ7.4，含有 100 mM NaCl，5 mM MgCl2)。
[0027]具體的銅離子檢測方法如下:
1)500nM 的 A 用 20 mM Tris-HCl 緩沖液(ρΗ7.4，含有 100 mM NaCl，5 mM MgCl2)溶解，然后分別加入100 nM的B和C，充分混勻，室溫反應30分鐘；
2)加入待測樣品，以及五倍濃度的抗壞血酸鈉標準溶液，室溫反應90分鐘；
3)加入D以及dNTPS和聚合酶，室溫反應90分鐘。反應完成后，體系在495nm激發光的激發下，記錄525 nm處的焚光發射光強度。焚光發射光強度與銅離子濃度呈正相關。
[0028]對不同濃度Cu2+的檢測
配制 Cu2+標準溶液，濃度分別為 0.1 nM、l nM、10 nM、100 nM、200 nM、400 nM 以及 800nM，室溫保存。
[0029]將不同濃度的Cu2+溶液分別加到實施例1中所述的反應體系中，充分反應后檢測熒光強度，如圖2所示，隨著Cu2+濃度的增加，對應的熒光強度逐漸增強，當Cu 2+濃度超過400 nM時，逐漸達到飽和。以Cu2+濃度的對數(lg C)為橫坐標，熒光強度為縱坐標，繪制標準曲線，二者具有很好的線性關系，線性范圍是從0.1 nM到400 nM，線性方程是#= 130.45+ 213.24 lgC (R2=0.974) (/為熒光強度，6為汞離子濃度)，按照3倍信噪比標準(3S/N)，檢測限為0.05 nMo
[0030]特異性實驗
配制濃度為100 nM的不同干擾物標準溶液，分別是Pb2+、Hg2+、Mn2\Fe2\ Co2\ Cd2+、Zn2+和 Cr3+0
[0031]將100 nM的不同干擾物標準溶液和100 nM Cu2+標準溶液分別加到實施例1中所述的反應體系中，充分反應后檢測熒光強度，如圖3所示，100 nM的Pb2+、Hg2+、Mn2+、Fe2\Co2\ Cd2+、Zn2+和Cr3+的熒光強度與空白樣品相比，變化不大，對檢測不產生影響。只有當加入Cu2+才會使熒光強度明顯增加，這證明該方法對Cu2+的檢測具有很好的特異性。
【主權項】
1.一種銅離子檢測試劑盒，包括還原劑、dNTP、聚合酶、檢測核酸序列和緩沖體系，其特征在于:檢測核酸序列由核酸序列A、B、C、D組成，其中: 核酸序列A為莖環結構DNA，兩端分別修飾熒光基團和淬滅基團； 核酸序列B和C分別和核酸序列A環結構左右兩側序列互補配對，其配對后相鄰的兩端分別修飾有疊氮基團和炔基基團； 核酸序列D為核酸序列A的引物序列。2.根據權利要求1所述的銅離子檢測試劑盒，其特征在于:核酸序列A的莖桿長度為6 ?9bp03.根據權利要求1所述的銅離子檢測試劑盒，其特征在于:核酸序列A的環長度為16?24個喊基。4.根據權利要求1所述的銅離子檢測試劑盒，其特征在于:核酸序列B和C的長度差不超過4個堿基。5.根據權利要求1所述的銅離子檢測試劑盒，其特征在于:核酸序列B和C的長度相同或相差一個堿基。6.根據權利要求1?5任意一項所述的銅離子檢測試劑盒，其特征在于:還原劑選自維生素C、抗壞血酸鹽、檸檬酸鹽。7.根據權利要求1?5任意一項所述的銅離子檢測試劑盒，其特征在于:緩沖體系為Tris-HCl緩沖液、PBS緩沖液、HEPES緩沖液、MOPS緩沖液。8.根據權利要求1?5任意一項所述的銅離子檢測試劑盒，其特征在于:核酸序列A的環長度為19?21個堿基。9.根據權利要求1?5任意一項所述的銅離子檢測試劑盒，其特征在于:核酸序列D的長度為8?12個堿基。
【專利摘要】本發明公開了一種銅離子檢測方法及檢測試劑盒，利用一個分子的疊氮基團和另外一個分子的炔基基團在一價銅離子的催化下，通過環加成反應，形成一個三唑五元環而被連接在一起，從而引發核酸序列打開熒光探針的發夾結構，并通過等溫信號擴增實現了銅離子的檢測，具有穩定性好、靈敏度高，選擇性好，抗干擾能力強，成本低廉且無毒害，實用性強等優點，特別適用于環境樣品的檢測分析。
【IPC分類】G01N21/64
【公開號】CN105352924
【申請號】CN201510698864
【發明人】陳俊華, 周順桂
【申請人】廣東省生態環境與土壤研究所
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年10月21日