一種用于檢測眼病的試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種用于檢測眼病的試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002] 甲狀腺相關眼病（thyroid associated ophthalmopathy, ΤΑ0)是內分泌科常見 疾病之一，也是目前世界上治療最為困難的疾病之一。ΤΑ0病程較長，各年齡段均可發生， 以女性多發。輕者可影響生活、工作質量，損傷外貌，重者可導致視力下降，甚至失明，給患 者帶來了沉重的經濟及心理負擔。近年來，由于生活方式的改變，工作壓力的增加，社會環 境狀況的變化，食用加碘鹽的普及，以及不正規用藥等因素，ΤΑ0的發病率明顯上升，住院率 高。目前由于本病原因未明，臨床主要以激素、免疫抑制劑、生長激素類似物、抗甲狀腺藥 物、眶內放射、眼眶減壓術等綜合治療為主，但由于種種原因，效果并不盡人意，迄今為止尚 無任何一種藥物能有效治療ΤΑ0,并獲長期緩解。因此，研究治療甲狀腺相關眼病的藥物是 亟待解決的技術問題。而檢測所述疾病更是本領域積極研究的方向。
[0003]近年來的研究表明，細胞間粘附分子-1的表達與自身免疫甲狀腺病免疫病理過 程密切相關。甲狀腺炎患者的甲狀腺組織內浸潤淋巴細胞、內皮細胞的sICAM-1和sICAM-1 表達異常活躍。另外，發現伴有突眼的患者血清sICAM-1水平異常增高，這是因為患者眼球 后組織強烈表達sICAM-1，所以血清sICAM-1升高的水平多與眶周炎癥浸潤程度密切相關。 此外，研究還發現，在藥物的治療過程中，甲狀腺功能和臨床癥狀的好轉與血清sICAM-1水 平的下降并不同步，往往甲狀腺功能的恢復在很大程度上要早于sICAM-1的恢復。綜上所 述，可溶性細胞間粘附分子-1的濃度變化可能對于判斷GD的自身免疫紊亂水平、停藥與否 和是否復發等具有重要意義。細胞間粘附分子-1的表達與甲狀腺相關眼病有直接關聯，因 此，檢測細胞間粘附分子-1的表達情況，可以直接用于鑒定甲狀腺相關眼病。然而傳統的 檢測細胞間粘附分子-1的表達情況具有操作復雜，費時的缺點。
[0004] 核酸適體（Aptamer,又稱適配體，適配子)是能高親和性、高特異性的結合某種生 物革E1標的單鏈寡核酸分子（ssDNA或ssRNA)。核酸適體是通過指數富集配體系統進化技 術（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment, SELEX)從人工合 成的DNA/RNA文庫中篩選得到的能夠高度特異性結合靶標分子的單鏈DNA/RNA。已報道核 酸適體的靶標包括金屬離子、有機小分子、多肽、蛋白質、細胞甚至組織等。核酸適體的分子 識別功能與抗體類似，具有與抗體分子相當甚至更強的靶標識別能力，但與抗體相比具有 很多優良的特性，如分子量小，能批量生產，不易失活，無免疫原性、容易合成與標記、快速 的穿透組織、良好的代謝動力學、不同批次之間產品不會存在差異和具有很好化學穩定性， 在生物檢測、疾病診斷治療等領域具有重要的應用前景。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種特異結合sICAM-1的核酸適體及其試劑盒。
[0006]本發明提供的核酸適體，是序列表的序列1-15所示的單鏈DNA。
[0007] 所述核酸適體與sICAM-1蛋白具有較好的親和能力。
[0008] 還可將所述核酸適體進行修飾或改造，得到所述核酸適體的衍生物。
[0009] 所述核酸適體的衍生物可為如下任意一種： a) 將所述核酸適體刪除部分或增加部分互補的核苷酸，得到的與所述核酸適體具有相 同功能的核酸適體的衍生物； b) 將所述核酸適體進行核苷酸取代或部分修飾，得到的與所述核酸適體具有相同功能 的核酸適體的衍生物； c) 將所述核酸適體的骨架改造為硫代磷酸酯骨架，得到的與所述核酸適體具有相同功 能的核酸適體的衍生物； d) 將核酸適體改造為肽核酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生 物； e) 將所述核酸適體連接上熒光、放射性和治療性物質后，得到的與所述核酸適體具有 相同功能的核酸適體的衍生物。
[0010] 所述核酸適體可用于制備檢測SICAM-1的試劑盒。
[0011] 利用本發明的核酸適體，可以捕獲血液中的sICAM-1，從而用于甲狀腺相關眼病篩 查。利用本發明的核酸適體，部分代替單克隆抗體捕獲sICAM-1進行檢測，具有高靈敏、成 本低、易制備、易保存的優點。本發明具有很高的應用價值。
【具體實施方式】
[0012] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0013] 實施例1、核酸適體的篩選和制備 設計兩端包含大約20個核苷酸、中間包括39個核苷酸的隨機核酸文庫如下： 5' -ACGACTAACGTGTMCAG (N39) CAGTGCATGATGCTACGAA-3' ；N39 代表 39 個隨機核苷 酸。
[0014] 將單鏈DNA文庫擴增為雙鏈DNA，產物經2%瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收純化；以 回收的雙鏈DNA為模板，體外轉錄出單鏈RNA隨機文庫，轉錄產物經PAGE純化。75 μ g RNA 文庫經硝酸纖維素膜反篩去除與膜結合的RNA分子，然后與2ug sICAM-1蛋白（通過陳志 鴻等，人細胞間黏附分子-1的真核細胞表達與鑒定中公開的方法，表達得到的目的蛋白）， 37° C孵育30min，反應液經硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜；然后將濾膜剪碎，置于洗脫緩沖 液（6mol/L 尿素，0. 55mol/L 醋酸銨，1.5mmol/LEDTA，0. 15%SDS)中煮沸 5min，離心，取 上清，無水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20 μ 1 DEPC水中；以RNA為模板RT-PCR擴增雙鏈 DNA，體外轉錄出RNA文庫用于下一輪篩選；每輪篩選過程中RT-PCR得到雙鏈DNA文庫，以 該雙鏈DNA為模板體外轉錄出RNA適配子庫，篩選共進行10輪。得到了 15個適配子，其序 列分別為SEQ ID Ν0:1-15所示。具體序列如下所示： sICAM-1-1 ：ACGACTAACGTGTAACAGTCCAAGTATTCATACATACCATAAATTCATTGTCATTAA CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID N0:1) sICAM-1-2 ：ACGACTAACGTGTAACAGCAGACACCATATATACTATCTACTACCACATACCTCTAC CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:2) sICAM-1-3 ：ACGACTAACGTGTAACAGCTAACTTCTTATAACTTAAGATACTTCTTCCAAACAACA CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:3) sICAM-1-4 ：ACGACTAACGTGTAACAGTACATCACTCTAATCTTCACGCCTCAGTTACATTCCCTT CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:4) sICAM-1-5 ：ACGACTAACGTGTAACAGATGTATATTCCTTATATGACTATAATTCTTACCTATAAA CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:5) sICAM-1-6 ：ACGACTAACGTGTAACAGACCTCTATCTCACTCTTCCCTTTCGCCTACACATCCGAA CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:6) sICAM-1-7 ：ACGACTAACGTGTAACAGAGATTCACTAATATTTCTTCGCCTCGCCATACTTAAGAT CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:7) sICAM-1-8 ：ACGACTAACGTGTAACAGTACCCATCCACCTTCTTACTACTGCTCTCTCAATCTACA CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:8) sICAM-1-9 ：ACGACTAACGTGTAACAGACAGATACATTCATATCAAGTTACACATCTCCATGTTAA CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:9) sICAM-1-10： ACGACTAACGTGTAACAGCAGAACACAAATCTATACAAATCAGCATCACACTCATAC CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:10) sICAM-1-11： ACGACTAACGTGTAACAGATACCAATCGCCACCTACACTTACATCTAGACACTCTAT CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:11) sICAM-1-12： ACGACTAACGTGTAACAGTATCTACACATAGATCCTCCACTTAATAACAATCTGTCA CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:12) sICAM-1-13： ACGACTAACGTGTAACAGATACCTCATCAGATATTACATTCGCCAATATTTCTCTAT CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:13) sICAM-1-14： ACGACTAACGTGTAACAGTCTATAACGCCTAACTACACCACTCCACTCATTATAATA CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:14) sICAM-1-15： ACGACTAACGTGTAACAGATCTATTTCACCATTAAGAACCATATCGCATCACCCTTC CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:15) 實施例2 sICAM-1蛋白結合適配子的性能測定 將RNA適配子分別取2. Ομg，用牛小腸堿性磷酸酶（CIP) 37° C消化lh，純化回 收去磷酸化的RNA ;通過T4多核苷酸激酶標記[γ -32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末 端。lOnmol放射性標記的RNA適配子分別與不同濃度（1-200ηΜ)的sICAM-1 37° C孵育 30min，各組反應液經硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜，干燥濾膜，液閃計數儀測定濾膜上殘留 的放射量，同一樣品平行做兩次測定。計算各個適配子與sICAM-1的解離常數。結果如下：
實施例3所述適配子特異性分析以及穩定性分析 分別采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，霍亂弧菌VgrG3C蛋白，大腸桿菌外膜蛋白A， Lp-PLA2蛋白，與15條適配子進行特異性檢測，經過結合試驗發現，這些適配子都不與這些 蛋白相結合，而只與sICAM-1結合保持較高的特異性。
[0015] 將所述的適配子，取0.2ug，分別置于常溫的血清、水溶液中，放置二周。通過 RT-PCR檢測，發現二周的放置其結構穩定，沒有被降解。
[0016] 實施例4所述適配子疾病的診斷 將15個適配子分別與10個甲狀腺相關眼病患者以及正常人的血液混合30min，通過生 物素分離，定量分析其中的sICAM-1蛋白的含量，通過分析發現，10個甲狀腺相關眼病患者 中sICAM-1蛋白的含量相對于正常人顯著增加。
[0017] 以上僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技術人 員來說，凡在本發明的精神和原則之內所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本 發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種用于眼病檢測的試劑盒，其特征在于：包含核酸適體。2. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述核酸適體為SEQIDNo:1-15任一所 述。 3. SEQIDNo:1-15任一所述的適體在制備檢測眼病的試劑盒中的應用。4. 一種檢測眼病的方法，其特征在于利用權利要求1所述的試劑盒。5. 如權利要求1-2所述的試劑盒，其特征在于：所述眼病為甲狀腺相關眼病。6. 如權利要求3所述的應用，其特征在于：所述眼病為甲狀腺相關眼病。
【專利摘要】本發明公開了一種特異結合sICAM-1的核酸適體及試劑盒。本發明提供的核酸適體，與sICAM-1具有較好的親和能力。利用本發明的核酸適體，可以捕獲溶液中的sICAM-1，將其制備成為相應的試劑盒，將用于眼病的篩查。利用本發明的試劑盒，具有高靈敏、成本低的特點，適合大規模的篩查。
【IPC分類】G01N33/68
【公開號】CN105334327
【申請號】CN201510723711
【發明人】李倩
【申請人】李倩
【公開日】2016年2月17日
【申請日】2015年11月1日