一種枸櫞酸西地那非有關物質的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種化學藥物枸櫞酸西地那非及其制劑的有關物質檢測方法，屬于藥 物分析領域。
【背景技術】
[0002] 枸櫞酸西地那非是一種有效治療主觀和客觀原因引起的陰莖勃起功能障礙病癥 的藥物，是選擇性磷酸二酯酶5型（PDE-5)的抑制劑，1997年3月經FDA批準作為處方藥在 美國上市。枸櫞酸西地那非的化學結構式如下：
[0003]
[0004] 陰莖勃起功能障礙的主要原因是陰莖海綿體供血不足，可能與缺少一氧化氮有 關。N0可使鳥苷酸環化酶（GC)活化，在活化的GC作用下，鳥苷酸（GTP)轉變成環鳥苷酸 (cGMP) ;cGMP可被磷酸二脂酶5型（PDE-5)降解為cGMP-5^，后者無生物學效應，而cGMP 則可引起陰莖海綿體平滑肌血管舒張，使陰莖迅速充血而勃起。研究表明，枸櫞酸西地那非 可通過抑制海綿體內分解cGMP的TOE-5,來增強N0的作用，從而發揮其治療作用。
[0005] 藥品中的有關物質是指藥品中除主要成分之外的其他物質，它既可能是按既定工 藝生產過程中帶入的其他原料、試劑及生產過程中產生的中間體、副產物和立體異構體等， 也可能是在正常貯存和運輸過程中，由于環境條件的影響而產生的降解產物、聚合物等。藥 物中含有的有關物質不但會降低藥物療效，還與人們的健康和生命安危有極其密切的關 系。藥物安全性評價的一個重要內容就是藥物中有關物質的含量控制。
[0006] 為了嚴格控制枸櫞酸西地那非原料藥及其制劑的質量，保證臨床用藥的安全有 效，需要建立其有關物質的檢測方法。然而，枸櫞酸西地那非合成路線較多，不同生產路線 及制劑工藝所帶來的有關物質也不完全相同。常見的有關物質有以下7種（有關物質A~ G)，具體名稱和結構見下表。
[0007]
[0009] 如何在同一色譜條件下對上表中的7種有關物質進行同時檢測與分析，是枸櫞酸 西地那非原料藥及其制劑產品質量控制中的一個重要問題。
[0010] 現有技術中，USP35及EP8. 0對上表中枸櫞酸西地那非中的有關物質D、E、G，以及 1-咪唑和5- [2-羥基-5- [ (4-甲基哌嗪-1-基）磺酰基]-苯基]-1-甲基-3-丙基-1，6-二 氫-7H-吡唑并-[4, 3-d]嘧啶-7酮，共5個有關物質進行了質量控制。色譜條件為：采 用C18色譜柱；流動相為水相（0. 7%三乙胺的水溶液，用磷酸調pH至3. 0):甲醇：乙腈= 58:25:17 ;洗脫方式為等度洗脫。而采用該方法對上表中7個有關物質A~G進行分析檢 測時，有關物質C與E重合，有關物質D與F重合，專屬性差，有關物質A出峰時間太早，主 成分峰的理論塔板數低，僅為1441。
[0011] 文獻（AnalyticalSciences, 2003, 19, 1007 ~1011.)報道了對上表中枸櫞酸 西地那非的有關物質A，以及5-(5-氯-2-乙氧基）-1-甲基-3-丙基-6, 7-1H-吡唑并 [4, 3-d]嘧啶-7酮、1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-羧酸、1-甲基-4-硝基-3-丙基 咪唑-5-甲酰胺和5-(2-乙氧基）-1-甲基-3-丙基-6, 7-二氫-1H-吡唑并-[4, 3-d]嘧 啶-7-酮，共5個有關物質進行質量分析的方法。色譜條件為：采用C18色譜柱；流動相為 含0. 05mol/ml磷酸二氫鉀的水溶液：乙腈=30:70 ;洗脫方式為等度洗脫。而采用該方法 對上表中7個有關物質A~G進行檢測時，有關物質A與E重合，有關物質B未檢出，專屬 性差，主成分峰理論塔板數低，僅為1477。
[0012] 文獻（InternationalJournalofComprehensivePharmacy, 2011，7, 1 ~6.)報 道了一種枸櫞酸西地那非有關物質的檢測方法。該方法采用C18色譜柱；流動相為水相（含 0. 05mol/ml磷酸二氫鉀的水溶液，用氫氧化鉀溶液調pH至5. 8):乙腈：甲醇=30:50:20， 洗脫方式為等度洗脫。采用該方法對上表中7個有關物質A~G進行分析檢測時，有關物 質A與有關物質D重合，專屬性差。
[0013] 文獻（中國藥科大學學報，2001，32, 429~431.)對枸櫞酸西地那非的4個中間 體的分離檢測進行了研究。該方法采用C18色譜柱；流動相為水相（0. 015mol/ml三乙胺的 水溶液，用磷酸調pH至6.0):乙腈= 42:58,洗脫方式為等度洗脫。采用該方法對上表中7 個有關物質A~G進行分析檢測時，有關物質D未檢出，有關物質A、E分離度不好，理論塔 板數低。
[0014] 綜上所述，現有方法均不能同時檢測上表中枸櫞酸西地那非的7個有關物質，且 色譜條件中的流動相含有不揮發性鹽或三乙胺，不能用于液質聯用分析，影響后續研究工 作的開展。
[0015] 針對現有技術和方法無法同時檢測上表中枸櫞酸西地那非的7種有關物質，給枸 櫞酸西地那非原料藥及其制劑產品的質量控制帶來困難。本發明通過大量的實驗研究，建 立了同時檢測枸櫞酸西地那非中7種有關物質的方法，可用于枸櫞酸西地那非原料藥及其 制劑產品的質量研究和質量控制。
【發明內容】
[0016] 本發明的目的在于提供一種同時檢測枸櫞酸西地那非中7種有關物質的高效液 相色譜方法。為實現上述目的，本發明提供如下技術方案，該方案包括以下步驟：
[0017] 步驟1:制備系統適用性溶液：
[0018] 取有關物質A、B、C、D、E、F、G和枸櫞酸西地那非對照品，精密稱定，加流動相配制 成混合對照溶液，其中有關物質A~G的濃度為1~10μg/ml，枸櫞酸西地那非的濃度為 100 ~300μg/ml〇
[0019] 步驟2 :按以下高效液相色譜條件進行有關物質測定：
[0020] 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以含1~10mm〇l/ml醋酸銨的水溶液，用氨 水調pH至5. 0~8. 0為流動相A相，以乙腈：甲醇=1 :1~10為流動相B相，柱溫25~ 35°C，流速為0. 5~2ml/min，檢測波長為292nm，用HPLC進行梯度洗脫。
[0021] 優選的，步驟2中以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以含2~8mmol/ml醋酸銨 的水溶液，用氨水調pH至6. 5~7. 5為流動相A相，以乙腈：甲醇=1 :1~5為流動相B 相，柱溫27~32°C，流速為0. 8~1. 2ml/min，檢測波長為292nm，用HPLC進行梯度洗脫。
[0022] 更為優選的，步驟2中以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以含5~6mmol/ml醋 酸銨的水溶液，用氨水調pH至6. 8~7. 2為流動相A相，以乙腈：甲醇=1 :1~3為流動相 B相，柱溫29~31°C，流速為0. 9~1.lml/min，檢測波長為292nm，用HPLC進行梯度洗脫， 流動相梯度如下：
[0023]
[0024] 主成分的理論塔板數大于70000,所有峰之間的分離度大于3. 5。
[0025] 本發明提供的方法與現有已知方法的對比及實驗結果如下：
[0026]
L0027」 本友明提供的萬法簡使、高效、分離度高，η」以問時分離檢測枸櫞酸曲地那非中的 7種有關物質，且流動相可適用于質譜檢測，方便通過質譜分析未知雜質的結構，可用于枸 櫞酸西地那非原料藥及其制劑產品的質量研究和質量控制。
[0028] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細說明。根據本領域普通技術 知識和常用手段做出各種替換和變更，均包括在本發明所保護的技術方案之內。
【附圖說明】
[0029] 圖1:USP35和EP8.0方法的系統適用性色譜圖；
[0030] 圖 2 :文獻（AnalyticScience, 2003, 19, 1007 ~1011.)方法的系統適用性色譜 圖；
[0031] 圖 3:文獻（InternationalJournalofComprehensivePharmacy, 2011，7, 1 ~ 6.)方法的系統適用性色譜圖；
[0032] 圖4:文獻（中國藥科大學學報，2001，32, 429~431.)的系統適用性色譜圖；
[0033] 圖5 :實施例1的系統適用性色譜圖；
[0034] 圖6 :實施例2的系統適用性色譜圖。
【具體實施方式】 [0035]實施例1
[0036] 步驟1:制備系統適用性溶液：
[0037] 取有關物質A、B、C、D、E、F、G和枸櫞酸西地那非對照品，精密稱定，加流動相配制 成混合對照溶液，其中有關物質A~G的濃度為5μg/ml，枸櫞酸西地那非濃度為200μg/ ml〇
[0038] 步驟2 :按以下高效液相色譜條件進行有關物質測定：
[0039] 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以含5mmol/ml的醋酸銨，用氨水調pH至7. 0 為流動相A相，以乙腈：甲醇=1 :1為流動相B相，柱溫30°C，流速為lml/min，檢測波長為 292nm，用HPLC進行梯度洗脫，流動相梯度如下：
[0040]
[0041] 主成分的理論塔板數為73453,所有峰之間的分離度達到3. 85以上。
[0042] 系統適用性色譜圖見圖5。
[0043] 實施例2
[0044] 步驟1:制備系統適用性溶液：
[0045] 取有關物質A、B、C、D、E、F、G和枸櫞酸西地那非對照品，精密稱定，加流動相配制 成混合對照溶液，其中有關物質A~G的濃度為5μg/ml，枸櫞酸西地那非濃度為200μg/ ml〇
[0046] 步驟2 :按以下高效液相色譜條件進行有關物質測定：
[0047] 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以含6mmol/ml的醋酸銨，用氨水調pH至7.0 為流動相A相，以乙腈：甲醇=1 :1為流動相B相，柱溫30°C，流速為lml/min，檢測波長為 292nm，用HPLC進行梯度洗脫，流動相梯度如下：
[0048]
[0049] 主成分的理論塔板數為89369,所有峰之間的分離度達到3. 59以上。
[0050] 系統適用性色譜圖見圖6。
【主權項】
1. 一種枸櫞酸西地那非有關物質的檢測方法，包括以下幾個步驟： 步驟1 :制備系統適用性溶液：取有關物質A、B、C、D、E、F、G和枸櫞酸西地那非對照品， 精密稱定，加流動相配制成混合對照溶液，其中有關物質A~G的濃度為1~10 μ g/ml，枸 橡酸西地那非濃度的為100~300 μ g/ml ; 步驟2 :按以下高效液相色譜條件進行有關物質測定：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填 充劑，以含1~10mm〇l/ml醋酸銨的水溶液，用氨水調pH至5. 0~8. 0為流動相A相，以乙 腈：甲醇=1 :1~10為流動相B相，柱溫25~35°C，流速為0. 5~2ml/min，檢測波長為 292nm，用HPLC進行梯度洗脫。2. 根據權利要求1所述，其特征在于，步驟2中以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以 含2~8mmol/ml醋酸銨的水溶液，用氨水調pH至6. 5~7. 5為流動相A相，以乙腈：甲醇 =1 :1~5為流動相B相，柱溫27~32°C，流速為0· 8~1. 2ml/min，檢測波長為292nm， 用HPLC進行梯度洗脫。3. 根據權利要求1所述，其特征在于，步驟2中以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以 含5~6mmol/ml醋酸銨的水溶液，用氨水調pH至6. 8~7. 2為流動相A相，以乙腈：甲醇 =1 :1~3為流動相B相，柱溫29~31°C，流速為0. 9~1. lml/min，檢測波長為292nm， 用HPLC進行梯度洗脫，流動相梯度如下：主成分的理論塔板數大于70000,所有峰之間的分離度大于3. 5。
【專利摘要】本發明公開了一種枸櫞酸西地那非有關物質的檢測方法。該方法采用高效液相色譜法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，醋酸銨水溶液為流動相A，乙腈-甲醇為流動相B，檢測波長為292nm，梯度洗脫。該方法簡便、高效、分離度高，可以同時分離檢測枸櫞酸西地那非中的7種有關物質，且流動相可適用于質譜檢測，可用于枸櫞酸西地那非原料藥及其制劑產品的質量研究和質量控制。
【IPC分類】G01N30/06, G01N30/02
【公開號】CN105334275
【申請號】CN201510888927
【發明人】陳再新, 王璠, 王勇軍, 黃靜, 周慧琴
【申請人】常州亞邦制藥有限公司, 江蘇亞邦愛普森藥業有限公司
【公開日】2016年2月17日
【申請日】2015年12月5日